阿魏菇菌絲體多糖的分離純化研究

陳恒雷，林增祥，呂長武

（新疆大學(xué)物理學(xué)院低能離子注入與生物工程實驗室，新疆烏魯木齊830046）

阿魏菇菌絲體多糖的分離純化研究

陳恒雷，林增祥，呂長武*

（新疆大學(xué)物理學(xué)院低能離子注入與生物工程實驗室，新疆烏魯木齊830046）

以液體發(fā)酵獲得的阿魏菇菌絲體為材料，開展了阿魏菇菌絲體多糖分離純化及純度鑒定研究。結(jié)果表明，料液以質(zhì)量體積比1∶15（g/mL）、提取溫度100℃、提取時間3h、提取次數(shù)3次，熱水浸提，用孔徑38 μm的尼龍布過濾，加入適量20%三氯乙酸去蛋白，5倍體積于多糖濃縮液的無水乙醇醇析10h，10%的H2O2脫色8 h和DEAE-52柱層析純化處理得到的阿魏菇菌絲體多糖，經(jīng)吸收光譜掃描不含蛋白、核酸及色素殘留，經(jīng)紅外光譜掃描初步判定其為糖類物質(zhì)，且含有β-糖苷鍵。

阿魏菇；菌絲體多糖；分離；純化；波譜分析

阿魏菇（Pleurotus ferulae lanzi）又名阿魏側(cè)耳、阿魏蘑菇、白靈菇，因寄生或腐生在新疆干旱草原藥用植物阿魏或刺芹、闊葉拉瑟草植物上而得名［1］。它集食用、藥用價值于一身，被學(xué)者美譽(yù)為當(dāng)今食用菌皇后，在食用菌族中獨秀一枝，與另一種高檔藥食兩用菌—羊肚菌并稱為姊妹菌［2］。阿魏菇生物活性有效組分食藥用真菌多糖的含量很高［3］，其子實體多糖和液態(tài)深層發(fā)酵培養(yǎng)過程中產(chǎn)生的真菌多糖具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力［4-5］、抗腫瘤［6-7］等功效。目前，阿魏菇多糖的藥用價值及其應(yīng)用已為世界各國重視，極具開發(fā)前景。本研究以液體發(fā)酵獲得的阿魏菇菌絲體為材料，開展了阿魏菇多糖分離純化及純度鑒定研究，以期為該真菌多糖的應(yīng)用開發(fā)提供試驗參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1原料

阿魏菇菌絲體：通過XWB-5L生化反應(yīng)器液體發(fā)酵所得。

1.1.2試劑

考馬斯亮藍(lán)（分析純）：上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；葡萄糖（分析純）、酪氨酸（分析純）、苯酚（分析純）、濃硫酸（分析純）、氯仿（分析純）、三氯乙酸（分析純）、正丁醇（分析純）、無水乙醇（分析純）、雙氧水（分析純）、濃氨水（分析純）、NaCl（分析純）、KBr（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3儀器

XWB-5L生化反應(yīng)器：南京新凱龍生物工程有限公司；ZFQ81-1型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：上海醫(yī)械專機(jī)廠；HH-2電熱恒溫水浴鍋：天津匯科儀器設(shè)備有限公司；HL-2恒流泵和BSZ-100自動部分收集器：上海精科實業(yè)有限公司；層析柱（50 cm×2.6 cm）：上海廈美生化科技發(fā)展有限公司；DEAE-52纖維素：南京森貝伽生物科技有限公司；UV-2100型紫外-可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；AVATAR-370傅立葉紅外光譜儀：上海禾工科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1阿魏菇菌絲體多糖的制備方法

稱取10.0 g阿魏菇鮮菌絲體，料液以質(zhì)量體積比1∶15（g/mL）、提取溫度100℃、提取時間3 h、提取次數(shù)3次熱水浸提，用孔徑38 μm的尼龍布過濾備用。

1.2.1.1脫蛋白

將浸提后的多糖液放入-20℃冰柜中，冰凍之后融化，過濾除去不溶沉淀。分別用Sevage法［8］、三氯乙酸-正丁醇法和20%三氯乙酸法去蛋白，用考馬斯亮藍(lán)結(jié)合法［9］測量離心后多糖溶液中的蛋白質(zhì)含量，比較3種脫蛋白方法的試驗效果。

1.2.1.2醇析

1）乙醇濃度對多糖得率的影響

取20 mL菌絲體多糖濃縮液，分別加入1、2、3、4、5、6倍體積無水乙醇，靜置過夜后6 000 r/min離心15 min，取沉淀加水復(fù)溶后用苯酚-濃硫酸法［9］測量多糖含量。

2）醇析時間對多糖得率的影響

取11份10 mL多糖濃縮液，加入4倍體積無水乙醇，每隔1 h取一個樣品，6 000 r/min離心15 min，取沉淀加水復(fù)溶后用苯酚-濃硫酸法測量多糖含量。

1.2.1.3H2O2脫色

取200 mL多糖溶液，加入20 mLH2O2，滴加氨水至pH值8.5，每隔1 h，600 nm波長測量OD值，以蒸餾水做空白參照，觀測時間與脫色效果的關(guān)系。

1.2.1.4DEAE-52柱層析

先用檸檬酸起始緩沖液對50 mg阿魏菇菌絲體多糖在4℃平衡過夜，中間換液3次。用吸管將經(jīng)過平衡的纖維素柱上部緩沖液吸出，留有一薄層液面以免空氣進(jìn)入。沿管壁緩緩加入多糖樣品，擰開下端的螺旋夾，使多糖樣品進(jìn)入交換劑中，快加完樣時，加2 mL檸檬酸緩沖液沖洗柱壁，隨即采用0～1 mol/L NaCl梯度洗脫，利用自動分步收集器收集，當(dāng)多糖液流出時，開始分管收集，至無多糖為止，以苯酚-濃硫酸法測洗脫液多糖含量。

1.2.2阿魏菇菌絲體多糖的純度鑒定

1.2.2.1阿魏菇菌絲體多糖的吸收光譜掃描

取2 mg/mL阿魏菇菌絲體多糖溶液，進(jìn)行全波段掃描，水為空白對照，以確定經(jīng)過純化后多糖溶液中是否有蛋白質(zhì)、核酸和色素殘留。

1.2.2.2阿魏菇菌絲體多糖的紅外光譜掃描

取1 mg左右干燥的菌絲體多糖樣品，與200 mg左右經(jīng)干燥的KBr粉末，在紅外燈下在瑪瑙研缽中輕輕研勻，然后對阿魏菇菌絲體多糖進(jìn)行紅外光譜掃描，掃描范圍400 cm-1～4 000 cm-1。

2結(jié)果與分析

2.1阿魏菇菌絲體多糖的分離純化試驗結(jié)果

2.1.13種脫蛋白方法的試驗比較

3種脫蛋白方法的試驗比較見圖1。

圖13　種脫蛋白方法的比較結(jié)果Fig.1Result of comparing three removing protein methods

由試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三氯乙酸法脫蛋白效果最好，其原因可能是用三氯乙酸脫蛋白時，因三氯乙酸和多糖水溶液互溶，大大增加了三氯乙酸作用于蛋白質(zhì)分子的概率，使多糖溶液中蛋白質(zhì)充分變性、絮狀析出，通過離心作用使絮狀物充分沉淀，將蛋白質(zhì)從多糖溶液中分離出來；而三氯乙酸-正丁醇脫蛋白時，因正丁醇與水的極性不同會形成分界層，析出的蛋白質(zhì)不溶于正丁醇和水，所以整個溶液體系分為3層，上層為正丁醇液，下層為水合三氯乙酸，中間為蛋白質(zhì)沉淀，萃取過程中對沉淀物的分離效果不如離心法好，相對去蛋白效果差一些。Sevage法條件溫和效果也不錯，且萃取劑可以重復(fù)使用，但需要經(jīng)過多次萃取效果比較理想。

2.1.2醇析試驗結(jié)果

2.1.2.1乙醇濃度對多糖得率的影響

乙醇濃度對多糖得率的影響見圖2。

圖2　乙醇濃度對多糖得率的影響Fig.2Effect of ethanol concentration on yield of polysaccharide

通過乙醇濃度對多糖得率影響的試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)當(dāng)加入5倍體積乙醇時，多糖沉淀質(zhì)量不再增加，適宜作為阿魏菇菌絲體多糖沉積的醇析濃度。

2.1.2.2醇析時間對多糖得率的影響

醇析時間對多糖得率的影響見圖3。

圖3　醇析時間對多糖得率的影響Fig.3Effect of polysaccharide precipitation time on yield of polysaccharide

通過醇析時間對菌絲體多糖得率影響的試驗結(jié)果，發(fā)現(xiàn)醇析8 h后多糖沉淀增加較少，以醇析時間10 h效果較好。

2.1.3H2O2脫色試驗結(jié)果

H2O2脫色試驗結(jié)果見圖4。

圖4　H2O2脫色時間曲線Fig.4Time curve of H2O2bleaching

對圖4結(jié)果分析，可以發(fā)現(xiàn)H2O2脫色時間與脫色效果線性相關(guān)，前6 h脫色速度稍快，然后隨時間延長吸光度減少緩慢，因此選擇8 h為脫色時間。通過擬合后得到脫色方程為：Y=0.005 6X2-0.057 4X+1.623 2（式中：Y為600 nm OD值；X為時間，R2=0.997 3）。

2.1.4DEAE-52柱層析試驗結(jié)果

DEAE-52柱層析試驗結(jié)果見圖5。

圖5　菌絲體多糖的DEAE-52分離結(jié)果Fig.5Results of mycelium polysaccharide separation with DEAE-52

通過圖5可以看出，從0～1 mol/L NaCl的濃度范圍，層析柱吸附多糖都有洗脫，從第4管洗脫量逐漸增加到第12管開始減少，25管到40管洗脫量較少，40管之后出現(xiàn)一個大的洗脫峰，60管之后多糖基本洗脫完畢。

2.2阿魏菇菌絲體多糖的純度鑒定試驗結(jié)果

2.2.1阿魏菇菌絲體多糖的吸收光譜掃描

阿魏菇菌絲體多糖的吸收光譜掃描見圖6。

圖6　阿魏菇菌絲體多糖的吸收光譜掃描Fig.6Absorption spectrum scanning of Pleurotus mycelium polysaccharide

通過對上圖我們可以看出，在280 nm和260 nm處無吸收峰，可以判斷樣品中不含有蛋白質(zhì)和核酸；在620 nm處也沒有吸收峰，可以判斷樣品中沒有色素殘留。

2.2.2阿魏菇菌絲體多糖的紅外光譜掃描

阿魏菇菌絲體多糖的紅外光譜掃描見圖7。

通過菌絲體多糖的紅外掃描譜圖可以看出，在3 322 cm-1的一個寬峰是-O-H伸縮振動，存在分子間和分子內(nèi)的氫鍵，2 926 cm-1的吸收峰是-C-H伸縮振動，1 400 cm-1～1 200 cm-1的一些峰是-C-H的變角振動，通過這兩組糖類物質(zhì)特征吸收峰則可以初步判斷該樣品是糖類物質(zhì)。在1 100 cm-1～1 010 cm-1處的3個吸收峰是吡喃糖苷特征吸收峰，1 000 cm-1～1 200 cm-1間比較大的吸收峰是由兩種C-O伸縮振動所引起的，其中一種屬于C-O-H的，另外一種是糖環(huán)的C-O-C，876 cm-1～905 cm-1處的吸收峰，是β-D-吡喃糖C-H變角振動的特征吸收峰，表明有β-糖苷鍵。

圖7　阿魏菇菌絲體多糖的紅外光譜掃描Fig.7IR Scan of Pleurotus mycelium polysaccharide

3結(jié)論

阿魏菇是近幾年發(fā)展起來的食用菌新秀之一，國內(nèi)的研究重點已經(jīng)由阿魏菇的菌種的馴化及栽培轉(zhuǎn)移到其真菌多糖的深層發(fā)酵、提取及分離純化等方面。本研究基于課題組近期的優(yōu)化提取工藝參數(shù)：料液以質(zhì)量體積比1∶15（g/mL）、提取溫度100℃、提取時間3 h、提取次數(shù)3次，熱水浸提阿魏菇菌絲體多糖。通過脫蛋白、醇析、H2O2脫色和DEAE-52柱層析比較試驗獲得了阿魏菇菌絲體多糖分離純化工藝參數(shù)：用孔徑38 μm的尼龍布過濾，將過濾后的多糖溶液加入適量20%三氯乙酸去蛋白，離心除去不溶沉淀；然后減壓濃縮，再用5倍體積于多糖濃縮溶液的無水乙醇醇析10 h，10%的H2O2脫色8 h，每10 g阿魏菇鮮菌絲體可提取538.3 mg粗多糖；最后上DEAE-52陰離子纖維素層析柱純化，得阿魏菇菌絲體純多糖得率是19.6 mg/100 mg。以該工藝參數(shù)制備的阿魏菇菌絲體多糖通過吸收光譜掃描，其不含有蛋白質(zhì)、核酸和色素殘留；通過紅外光譜掃描，初步判定其為糖類物質(zhì)，且含有β-糖苷鍵。

［1］陳忠純，吳政聲.阿魏側(cè)耳優(yōu)良菌株KH2的選育［J］.干旱區(qū)研究，1994，11（4）：76-78

［2］武紅旗，李志宏，范燕敏，等.新疆阿魏菇及發(fā)展展望［J］.食用菌，2004，26（1）：7-8

［3］黃年來.18種珍稀美味食用菌栽培［M］.北京：中國農(nóng)業(yè)出版社：1-164

［4］趙祁，肖杰，王勤.阿魏菇對小鼠免疫功能的影響［J］.中國食用菌，2001，20（1）：43-45

［5］甘勇，呂作舟.阿魏菇多糖理化性質(zhì)及免疫活性研究［J］.菌物系統(tǒng)，2001，20（2）：228-232

［6］宋旭紅，張月明，鄧紅.新疆阿魏蘑菇提取物體外腫瘤實驗研究［J］.癌變·畸變·突變，2002，14（2）：107-110

［7］董洪新，呂作舟.阿魏側(cè)耳多糖的分離純化與抗腫瘤活性的研究［J］.微生物學(xué)通報，2003，30（2）：16-19

［8］Sevag M G，Lackman D B，Smolens J.The isolation of components of streptococcal nucleoproteins in serologically active form［J］.Journal of Biological Chemistry，1938，124：425

［9］張惟杰.復(fù)合多糖生化研究技術(shù)（2版）［M］.杭州：浙江大學(xué)出版社，1999：10-11

Separation and Purification of Pleurotus Mycelium Polysaccharide

CHEN Heng-lei，LIN Zeng-xiang，Lü Chang-wu*
（Laboratory of Low Energy Ion Implantation and Biological Engineering，School of Physics Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China）

Taking Pleurotus mycelium obtained through liquid fermentation as materials，the separation，purification and identification of Pleurotus mycelium polysaccharide were also made.The results showed that the fresh mycelium was extracted with deionized water［material-water ratio：1∶15（g/mL），extraction temperature：100℃，extraction time：3 h and extraction degree：3 times］，then the supernatant was separated from insoluble residue with nylon cloth（pore diameter 38 μm）.The extracts were then removed protein by the addition of suitable 20%trichloroacetic acid，precipitated by the addition of anhydrous ethanol（ethanol-polysaccharide concentration ratio 5∶1，precipitation time 10 h），and the precipitates were collected by centrifugation，then solubilized in deionized water and bleached with 10%H2O2to get the crude polysaccharides.And then the crude polysaccharides were purified with DEAE-52 column chromatography to get the mycelium polysaccharides.The mycelium polysaccharides did not contain proteins，nucleic acids and pigment residue by absorption spectrum scanning，were determined initially as carbohydrate and contained a β-glycosidic bond by IR scan.

Pleurotusferulae；myceliumpolysaccharide；separation；purification；spectrumanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.011

2015-11-19

新疆維吾爾自治區(qū)青年科技創(chuàng)新人才培養(yǎng)工程項目（2013721007）

陳恒雷（1979—），男（漢），副教授，博士后，研究方向：離子束生物工程、食藥用菌誘變育種與開發(fā)、天然產(chǎn)物研究與開發(fā)。*通信作者