堆肥過程中纖維素酶活與纖維素降解相關(guān)研究

李洪濤，王　涵，臧翔云，劉美庭（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱150030）

堆肥過程中纖維素酶活與纖維素降解相關(guān)研究

李洪濤，王涵，臧翔云，劉美庭
（東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，哈爾濱150030）

采用室內(nèi)小型堆肥反應器堆肥，測定CMC酶活性和β-葡萄糖苷水解酶活性，測定堆肥物料中纖維素、半纖維素和木質(zhì)素相對含量，利用高效液相法測定葡萄糖和纖維二糖。結(jié)果表明，堆肥過程中，堆體溫度前3 d迅速上升至45℃，進入高溫期，維持8 d后進入降溫期，最后與環(huán)境溫度變化一致；β-葡萄糖苷水解酶活性第4天達最大值（1.482μmol p-Nitr·g-1DW·min-1），并在降溫腐熟期維持在0.429~0.533μmolp-Nitr·g-1DW·min-1范圍內(nèi)；CMC酶活性變化趨勢與β-葡萄糖苷水解酶活性相似，并在第7天達最大值（47.67μg glucose·g-1DW·min-1）；纖維素和半纖維素降解趨勢相似，均在高溫期降解明顯；木質(zhì)素相對含量總體變化較小，且在降溫腐熟期小幅增加。結(jié)果顯示，CMC酶活性與纖維素和半纖維素降解呈正相關(guān)。

堆肥；CMC酶；β-葡萄糖苷水解酶；高效液相色譜法

網(wǎng)絡(luò)出版時間2016-6-17 15:22:24[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1522.024.htm l

李洪濤,王涵,臧翔云,等.堆肥過程中纖維素酶活與纖維素降解相關(guān)研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2016,47(6):33-40.

Li Hongtao,Wang Han,Zang Xiangyun,et al.Correlation study on cellulose activities and ligocellulose degradation during composting[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):33-40.(in Chinese with English abstract)

高溫好氧堆肥方式是我國當今處理農(nóng)業(yè)固體廢棄物諸如秸稈、稻草和禽畜類糞便等有效手段。多種有機物成分存在于堆肥基質(zhì)中，纖維素、半纖維素和木質(zhì)素等大分子物質(zhì)是畜禽糞便和秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物主要成分[1]。這些大分子物質(zhì)中，作物秸稈等纖維素類物質(zhì)為微生物生長提供碳源。堆肥就是基質(zhì)在微生物產(chǎn)生各種酶作用下，通過一系列分解反應，最后形成腐殖質(zhì)過程。木質(zhì)纖維素在牛糞堆肥中含量達50%~70%[2-3]，研究結(jié)果顯示，木質(zhì)素降解程度影響堆肥腐熟進程，是堆肥產(chǎn)品品質(zhì)控制重要因素[3-6]。

可切斷纖維素中β-1,4-葡萄糖苷鍵的多種功能酶總稱纖維素酶，包括β-葡萄糖苷水解酶、葡聚糖外切酶、內(nèi)切葡聚糖酶[7]。降解纖維素過程為內(nèi)切葡聚糖酶切斷纖維素多糖鏈成為不同長度寡糖鏈，再由羧甲基纖維素酶（CMC酶）等外切纖維素酶將寡糖鏈分解成纖維二糖。纖維二糖在β-葡萄糖苷水解酶的作用下分解成葡萄糖，被微生物直接吸收利用供其生長繁殖[8]。在微生物產(chǎn)生各種酶降解纖維素的一系列反應中，β-葡萄糖苷水解酶是限速酶[9]。

高效液相色譜法（High pressure liquid chroma?tography，HPLC）由傳統(tǒng)液相柱層析方式演化而來，以高壓下液體為流動相定性定量監(jiān)測微量樣品的技術(shù)手段，具有樣品進樣量微少、分析快速精準、適用范圍廣泛和預處理簡單快捷等特點。孫雪等利用HPLC成功測得生殖培養(yǎng)液中葡萄糖含量[10]；李琦利用HPLC測定發(fā)酵乳中葡萄糖等成分含量，指出HPLC具有簡便、快速及結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點[11]；逯平杰等利用HPLC快速、準確測定甘蔗節(jié)間葡萄糖等成分含量[12]。

本研究通過對各時期β-葡萄糖苷水解酶與CMC酶活性及纖維二糖、葡萄糖含量測定，探討堆肥過程中兩種酶活性相關(guān)性，深入分析兩種酶對基質(zhì)纖維素降解影響，研究纖維素類物質(zhì)在堆肥過程中降解生物學特性。

1　材料與方法

1.1材料

本試驗采用小型實驗室堆肥反應器將牛糞與稻草秸稈1?3混合均勻后高溫好氧堆肥，地點為東北農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院生物質(zhì)資源化利用研究室。調(diào)節(jié)堆肥物料含水率（60%~70%）。堆肥周期為30 d，每天上午6:30，中午12:00，晚上19: 00對堆體通風并測定堆體距離頂端35 cm（上層）、65 cm（中層）和85 cm（下層）溫度與環(huán)境溫度。堆肥第8天、第16天和第23天翻堆。

1.2CMC酶與β-葡萄糖苷水解酶活性測定

兩種酶活性測定參照文獻[13]，取堆肥第0、1、4、7、13、23、29天新鮮樣品測定酶活性。羧甲基纖維素酶（CMC酶）活性測定方法：稱取羧甲基纖維素鈉鹽0.625 g溶于醋酸鈉緩沖液配置反應底物（CMC），用葡萄糖（Glucose）標準品（分析純）配置成1mg·mL-1溶液，1mg·mL-1葡萄糖溶液分別取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，加入去離子水定容至2mL，分光光度計540 nm測定10個濃度梯度葡萄糖溶液吸光值，繪制葡萄糖標準曲線。稱取新鮮堆肥樣品2 g加入20mL去離子水中，搖床55℃100 r·min-1震蕩1 h，取震蕩后溶液4.5mL置于離心管中室溫8 000 r·min-1離心15min。吸取離心后上清液1mL于試管中，吸取同體積去離子水作空白對照，將試驗樣品、空白對照及底物CMC溶液置于預熱55℃水浴鍋中水浴2min。將樣品和對照取出后加入1.5mL醋酸鈉溶液并調(diào)節(jié)pH至4.5，加入預熱底物溶液4 mL，對照組不加底物以4mL預熱去離子水代替。隨后，將各試管置于55℃水浴鍋中保溫1 h，取出后立即加入1.5mL配置后過夜放置的DNS溶液終止酶促反應，充分搖勻后沸水浴5min，取出冷卻，去離子水定容至25mL，540 nm波長測定吸光值，根據(jù)公式計算CMC酶活性[13]。

β-葡萄糖苷水解酶活性測定方法：以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）為底物，將對硝基苯酚配置成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1mmol·L-110個濃度梯度，利用分光光度計測定400 nm吸光度，繪制對硝基苯酚標準曲線。取新鮮堆肥樣品1 g加入5mL去離子水中，室溫6 000 r·min-1離心20min，取上清液即粗酶液0.1mL，加入0.9mL醋酸緩沖液，置于預熱55℃水浴鍋中水浴5min后，加入同樣55℃水浴5 min后PNPG溶液1 mL，靜止放置20 min后加入1mLNa2CO3溶液終止反應，室溫靜置5min后，測定400 nm吸光度，計算β-葡萄糖苷水解酶活性[13]。

1.3纖維素、木質(zhì)素和半纖維素含量測定

堆肥各時期樣品纖維素、木質(zhì)素和半纖維素相對含量利用美國安康半自動纖維分析儀測定。

1.4高效液相色譜法測定纖維二糖和葡萄糖含量

由于HPLC對溶劑要求較高，故試驗過程使用超純水。試驗前1天做好流動相準備工作，吸取27μL濃硫酸加水定容至1 L后抽濾和超聲波去泡。所有樣品及標樣均于試驗當天配置完成并-20℃保存?zhèn)溆?，防止樣品中待測定成分發(fā)生降解影響測定結(jié)果。

稱取0.01 g葡萄糖（分析純），加水定容至10 mL制成標樣備用，纖維二糖標樣制備同理。稱取2 g待測樣品加入6mL水，4℃震蕩30 min后取出，于4℃12 000 r·min-1離心15min，直徑0.05 nm濾器處理上清液后待測。

1.5數(shù)據(jù)處理

試驗采用Excel2007、DPS7.05和SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)計算、繪圖及統(tǒng)計分析。

2　結(jié)果與分析

2.1堆肥過程中溫度變化

因人為控制秸稈與牛糞混合成分，堆體各部分溫度存在一定時間空間差異，溫度成為堆肥過程中堆體腐熟程度監(jiān)測重要指標[14]。堆肥第0~2天，堆體平均溫度迅速上升，這一階段可定為升溫期。第3天開始至堆肥第10天堆體始終維持45℃以上溫度，由于自制小型堆肥反應器特殊性，在此可將堆肥過程中45℃以上時段定為高溫期。第11天進入降溫期，21 d進入腐熟期。升溫期階段，由于堆肥反應器因素，堆體熱量不易散失，溫度迅速升高。隨溫度升高，堆體內(nèi)一些嗜熱微生物生長繁殖迅速增加且代謝活動加快，使溫度維持在堆肥過程的最高水平。微生物代謝活動隨易被分解利用的有機物消耗而減弱，溫度總體趨勢下降。在降溫腐熟期，溫度呈穩(wěn)定趨勢，但與自然堆肥不同，小型堆肥反應器有保溫作用，堆體溫度變化受環(huán)境溫度影響，但并不會迅速降低至環(huán)境溫度。

堆肥第8、16和23天人工翻堆，使堆體充分混勻和為堆體提供氧氣。各次翻堆后，溫度呈小幅度下降后又回升趨勢，說明翻堆后，堆體氧氣含量大幅增加，微生物代謝活動有所增強。研究表明，溫度變化在堆肥過程中影響微生物生長代謝，能反映堆肥進程[15]。

圖1　堆肥過程中溫度變化Fig.1 Change of temperature during com posting

2.2CMC酶活與β-葡萄糖苷水解酶活性研究

堆肥過程中人工營造小型生態(tài)環(huán)境，與自然環(huán)境類似，含碳類有機物質(zhì)循環(huán)往復依賴微生物產(chǎn)生不同類型的酶對有機物質(zhì)代謝分解。不同種類酶類調(diào)節(jié)相應底物代謝速率[16]，CMC酶與纖維素代謝有關(guān)。

如圖2所示，堆肥初期，溫度處于上升期，微生物代謝活力和代謝水平均處于較低狀態(tài)，此時微生物僅利用簡單易降解的小部分纖維素類有機物質(zhì)，環(huán)境中可被利用的有機物質(zhì)僅供微生物大量生長繁殖之用，無法產(chǎn)生大量酶類次生代謝產(chǎn)物，CMC酶活性在堆肥初始時較高，后呈大幅降低趨勢。進入高溫期后，堆體溫度不斷升高，微生物代謝水平也隨之提高，大量酶類隨微生物大量生長繁殖產(chǎn)生，堆體中小分子易降解有機物在升溫期基本被消耗殆盡，意味微生物開始利用大分子纖維素類有機物分解代謝并使次生代謝產(chǎn)物大量積累，CMC酶活性逐漸升高。堆肥第7天 CMC酶活性為整個堆肥進程中最高值（47.67μg glucose·g-1DW·min-1），之后則逐漸降低，整個高溫階段，CMC酶活性均處于較高水平。進入降溫腐熟階段后，由于纖維素類有機物質(zhì)被大量分解，微生物代謝活動減弱，CMC酶活性也隨之下降，直至堆肥結(jié)束。

圖2　CM C酶活及β-葡萄糖苷水解酶活性曲線Fig.2 Activities curve of CMCase and β-glucosidase

由圖2可知，β-葡萄糖苷水解酶活性在堆肥過程中呈先升后降趨勢。β-葡萄糖苷水解酶作用底物是纖維素類有機物分解產(chǎn)生的纖維二糖，因此在堆肥初始0~3 d，β-葡萄糖苷水解酶活性與CMC酶活性變化趨勢一致。4~7 d，堆體中纖維二糖不斷增加，β-葡萄糖苷水解酶活性維持較高水平（2.75~4.11μmolp-Nitr·g-1DW·min-1）。堆肥降溫腐熟階段，CMC酶活性降低，纖維二糖生成量降低，因此β-葡萄糖苷水解酶活性雖有一定起伏，但維持在較低水平（0.429~0.533μmol p-Nitr· g-1DW·min-1）。同時，堆肥降溫腐熟期，酶活性降低與β-葡萄糖苷水解酶降解產(chǎn)物葡萄糖存在一定相關(guān)，眾多研究證實β-葡萄糖苷水解酶活性受大量累積葡萄糖抑制[7,17]。

2.3木質(zhì)纖維素相對含量

纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是牛糞和秸稈中纖維素類有機物主要成分，堆肥各時期采樣測量其相對含量。

由圖3可知，木質(zhì)素在初始堆肥物料中相對含量最高為24.96%，半纖維素次之為23.16%，纖維素最低為18.32%。堆肥終止時其相對含量分別為13.09%、15.12%和26.88%。纖維素和半纖維素相對含量在堆肥過程中總體呈逐漸降低趨勢且變化相似，CMC酶活性與之緊密相關(guān)。但由于堆肥物料中木質(zhì)素相對于纖維素和半纖維素更難降解，其含量在堆肥過程稍有波動，但總體變化不大，甚至在降溫腐熟期小幅增加。大量試驗結(jié)果表明，木質(zhì)素降解是限制植物細胞壁纖維素降解關(guān)鍵，是自然生態(tài)系統(tǒng)碳循環(huán)過程中重要環(huán)節(jié)[18]，與本試驗過程中木質(zhì)素相對含量變化相符。大量研究證實木質(zhì)素是一類很難被分解代謝的有機物，在牛糞秸稈堆肥過程中僅小部分被微生物分解利用，與木質(zhì)素相比，纖維素和半纖維素更易被微生物分解利用[19]。

由圖3可知，纖維素和半纖維素相對含量在堆肥升溫期和高溫期（0~4 d）變化不明顯，堆體溫度在這一時期相對較低，各種分解纖維素和半纖維素微生物活動比較弱，主要依靠堆體中簡單有機物生長代謝。此外，在這些微生物代謝活動中產(chǎn)生分解纖維素和半纖維素酶類也非常少，導致纖維素和半纖維素該時期降解程度低。

2.4葡萄糖和纖維二糖含量

試驗采用濃硫酸和水混合體系作為流動相，利用HPX-87H色譜柱在柱溫55℃，流速0.5mL·min-1，進樣量10μL條件下監(jiān)測葡萄糖和纖維二糖標準品色譜峰，如圖4、5所示，葡萄糖標準品色譜峰保留時間為10.611min，纖維二糖色譜峰保留時間為8.631min。

圖3　纖維素、半纖維素與木質(zhì)素相對含量Fig.3 Relative contents of cellulose,hemicellulose and lignin

圖4　葡萄糖標準品色譜Fig.4 Chromatographic chart of glucose

圖5　纖維二糖標準品色譜Fig.5 Chromatographic chart of cellobiose

試驗過程中分別取葡萄糖和纖維二糖分析純標準品各0.01 g加入50μL超純水中，并依次10倍稀釋成3個梯度，將不同稀釋濃度梯度標準品溶液分別加入同一堆肥樣品中，以10μL進樣量檢測各梯度峰面積，計算兩種葡萄糖和纖維二糖回收率，均達80%以上，說明兩種標準品回收效率較好，此種檢測樣品中葡萄糖和纖維二糖含量方式可達到分離要求，并可應用于檢測堆肥樣品葡萄糖和纖維二糖含量。將堆肥樣品逐一處理后進樣，測得堆肥第0、1、4、7、13、23、29天色譜峰面積，如表1所示。

根據(jù)各時期樣品色譜圖顯示色譜峰面積值，結(jié)合葡萄糖和纖維二糖標準品各濃度梯度峰面積值和試驗中稱取堆肥樣品含量，計算各堆肥樣品葡萄糖與纖維二糖含量（mmol·kg-1），如圖6所示。

表1　樣品高效液相色譜峰峰面積Table1 Peak areas of samples HPLC

圖6　葡萄糖與纖維二糖含量Fig.6 Contents of glucose and cellobiose

由圖6可知，0~1 d時葡萄糖含量呈下降趨勢，這與堆肥過程中溫度和β-葡萄糖苷水解酶有關(guān)，此時溫度處于上升期，微生物活性較弱，一方面堆肥初始物料中葡萄糖作為微生物營養(yǎng)物質(zhì)被利用，另一方面β-葡萄糖苷水解酶產(chǎn)生量極少或為零，無法將纖維二糖分解成葡萄糖分子，導致葡萄糖在堆體中含量逐漸下降。堆肥第4天葡萄糖含量出現(xiàn)第1個峰值（1.85mmol·kg-1），此時進入高溫期前期，微生物代謝旺盛，產(chǎn)生β-葡萄糖苷水解酶分解代謝產(chǎn)生大量葡萄糖，但因為微生物旺盛代謝同樣需大量營養(yǎng)物質(zhì)供給，此時葡萄糖含量不會大量累積，在第4~7天呈下降趨勢。高溫期后期與降溫腐熟期前期，由于微生物活動減弱，導致葡萄糖消耗量降低且上一時期葡萄糖逐步累積，導致從降溫腐熟期第23天葡萄糖含量達到第2個峰值（5.35mmol·kg-1）。第23天后微生物主要以葡萄糖為營養(yǎng)物質(zhì)大量消耗，使葡萄糖含量再次降低。

第0~4天，纖維二糖含量變化呈先升后降趨勢，證明在這一階段，堆體中產(chǎn)生纖維二糖，在略有累積時由于β-葡萄糖苷水解酶作用使纖維二糖分解，導致這一趨勢產(chǎn)生。高溫階段后期和降溫腐熟前期，纖維二糖含量一直處于較低水平，維持在0~0.91 mmol·kg-1，與此時β-葡萄糖苷水解酶較高活性相對應。堆肥第13天起，纖維二糖大量累積，第29天達到最大值（1.29mmol·kg-1）。

3　討論

研究結(jié)果表明，溫度作為基本和關(guān)鍵堆肥技術(shù)指標，影響微生物在堆肥過程中代謝活動強弱[20]。測定CMC酶、β-葡萄糖苷水解酶兩種酶在堆肥各時期酶活性，與Cunha-Queda研究結(jié)果相符[9]，即在堆肥進程中，兩種酶活性變化密切相關(guān)，活性在高溫期處于較高活力范圍內(nèi)。由于堆肥過程中，各種酶主要來源為微生物次級代謝產(chǎn)物，在堆肥不同階段，細菌、真菌和放線菌對溫度適應能力不同導致種類和數(shù)量差別大，因此堆肥過程中活性與各時期微生物數(shù)量和種類密切相關(guān)。堆肥過程中酶活性與堆體中微生物關(guān)系試驗發(fā)現(xiàn)，β-葡萄糖苷水解酶活性與真菌中霉菌屬和放線菌數(shù)量顯著相關(guān)，證明堆肥過程中堆體內(nèi)霉菌和放線菌產(chǎn)生大量β-葡萄糖苷水解酶類次生代謝產(chǎn)物。堆肥第23天，堆體葡萄糖含量是所有樣品中最高值，此時β-葡萄糖苷水解酶活性水平不高，導致此時纖維素降解緩慢，朱鳳姝等研究表明葡萄糖對β-葡萄糖苷水解酶有反饋調(diào)節(jié)作用，葡萄糖累積會抑制β-葡萄糖苷水解酶產(chǎn)生[21]。因為β-葡萄糖苷水解酶在纖維素類有機物分解過程中作為限速酶具有重要作用，目前在堆肥碳循環(huán)研究中也利用β-葡萄糖苷水解酶活性判斷堆肥腐熟程度?？梢姡诙逊侍佳h(huán)過程中β-葡萄糖苷水解酶起決定性作用[22]。在牛糞秸稈堆肥過程中，纖維素類有機物質(zhì)降解主要是CMC酶和β-葡萄糖苷水解酶作用結(jié)果，因此纖維素類有機物質(zhì)降解與相關(guān)產(chǎn)酶微生物種屬、數(shù)量和產(chǎn)酶量存在一定關(guān)系，當微生物代謝活躍時，堆體中大量可被微生物降解利用的纖維素類有機物質(zhì)存在可刺激微生物產(chǎn)生相應酶類。隨堆肥過程推進，CMC酶與β-葡萄糖苷水解酶活性均呈先升后降趨勢，與Goyal等研究結(jié)果相符[23]。

高溫期是降解木質(zhì)纖維素類物質(zhì)主要階段，纖維素和半纖維素相對含量與其他時期相比明顯降低，木質(zhì)素在這一時期相對含量也發(fā)生小幅變化，這與高溫期CMC酶較高活性有關(guān)，也間接反映溫度對微生物活性影響。在堆肥降溫腐熟期，可明顯觀察到木質(zhì)纖維素各成分相對含量趨于穩(wěn)定，因堆肥體系中容易被微生物代謝分解的有機物質(zhì)大部分在高溫期已被利用，剩余一些難利用降解組分，再加上溫度降低微生物活性下降，兩種酶活性減弱，導致木質(zhì)纖維素降解率降低。Goy?al等在對牛糞甘蔗殘渣堆肥中發(fā)現(xiàn)，牛糞含量較多的體系中CMC酶活性明顯高于牛糞含量較少體系中酶活性。這是由于牛糞中可降解纖維素類有機物明顯多于甘蔗中纖維素類有機物質(zhì)，促進堆體中微生物合成大量酶使纖維素類酶活性升高[23]。進入降溫腐熟階段后，由于纖維素類有機物質(zhì)在高溫期被大量分解利用，微生物代謝活動減弱，CMC酶活性下降，此時β-葡萄糖苷水解酶酶活力較弱，導致纖維二糖大量累積，纖維二糖對CMC酶有反饋抑制作用，CMC酶活性降低，與β-葡萄糖苷水解酶活性變化相似[24]。

4　結(jié)論

高溫期CMC酶和β-葡萄糖苷水解酶兩種酶活性最高，呈先升后降趨勢。由于高溫期CMC酶活性較高，纖維素和半纖維素在這一時期降解率最高，降溫腐熟階段，微生物活性伴隨趨于平穩(wěn)的堆體平均溫度逐漸降低，CMC酶活性下降，導致纖維素和半纖維素降解變化較高溫期不明顯。整個堆肥過程中，木質(zhì)素相對含量變化不明顯，僅降溫腐熟期小幅增加。高效液相色譜測得的葡萄糖和纖維二糖含量與CMC酶和β-葡萄糖苷水解酶活性及溫度變化密切相關(guān)，高溫期纖維素類物質(zhì)降解率最高，在實際生產(chǎn)應用中，可適當延長高溫期時間控制溫度，加快纖維素類物質(zhì)降解并促進堆體腐熟。

[1]王偉東,劉建斌,?？×?等.堆肥化過程中微生物群落的動態(tài)及接菌劑的應用效果[J].農(nóng)業(yè)工程學報,2006(4):148-152.

[2]張所明,陳世和.城市生活垃圾堆肥發(fā)酵的腐熟度研究[J].上海環(huán)境科學,1988(10):9-13.

[3]陳世和,張所明,宛玲,等.城市生活垃圾堆肥處理的微生物特性研究[J].上海環(huán)境科學,1989(8):17-21.

[4]高福平.循環(huán)農(nóng)業(yè)中農(nóng)業(yè)廢棄物的再生利用[J].中國農(nóng)村小康科技,2008(2):66-68.

[5]WeiS,Jeanette M N,Bruce E M,et al.Effects of aeration and moisture during windrow composting on the nitrogen fertilizer val?ues of dairy waste composts[J].Applied Soil Ecology,1999,11(1): 17-28

[6]Pavlostathis SG,Misra G,Prytula M.Anaerobic processes[J].Wa?ter Environment Res,1995,67(4):459-470

[7]Bhatia Y,Mishra S,Bisaria V S.Microbialβ-glucosidases:Clon?ing,properties,and applications[J].Crit Rev Biotechnol,2002, 22:375-407.

[8]Nascimento CV,Souza FH M,MasuiD C,et al.Purification and biochemical properties of a glucose-stimulatedβ-D-glucosidase produced by Humicola grisea var.thermoidea grown on sugarcane bagasse[J].The Journal of Microbiology,2010,48(1):53-62.

[9]Cunha-Queda A C,Ribeiro H M,Ramos A,et al.Study ofbio?chemical and microbiological parameters during composting of pine and eucalyptus bark[J].Bioresour Technol,2007,98(17): 3213-3220.

[10]孫雪,黃元禮,柯林楠.高效液相色譜-示差折光檢測法測定輔助生殖培養(yǎng)液中果糖及葡萄糖的含量[J].中國組織工程研究, 2014,18(30):73-77.

[11]李琦,張?zhí)m威,張英春,等.高效液相色譜法測定發(fā)酵乳中的乳糖、葡萄糖和半乳糖[J].食品科學,2012,33(4):162-166.

[12]逯平杰,代容春,葉冰瑩,等.高效液相色譜法測定甘蔗節(jié)間果糖、葡萄糖和蔗糖的含量[J].食品科學,2011,32(2):198-200.

[13]關(guān)松蔭.土壤酶與土壤肥力[J].土壤通報,1980(6):41-44.

[14]李承強,魏源送,樊耀波,等.堆肥腐熟度的研究進展[J].環(huán)境科學進展,1999(6):1-12.

[15]徐杰,許修宏,劉月,等.添加菌劑對堆肥化過程中微生物群落代謝影響的Biolog解析[J].南京理工大學學報,2014(1):181-186.

[16]McKinley V L,Vestal JR.Physical and chemical correlates of mi?crobial activity and biomass in composting municipal sewage sludge[J].Applied and Environmental Microbiology,1985,50: 506-510.

[17]Kubiceck CP,Messner R,Gruber F,et al.The Trichoderma cellu?lase regulatory puzzle:From the interior life of a secretoryfungus [J].Enzyme Microb Technol,1993,15:90-99.

[18]Kuhad RC,Singh A,Eriksson K E.Microorganisms and enzymes involved in the degradation of plant fiber cell walls.[J].Advances in Biochemical Engineering Biotechnology,1997,57:45-125.

[19]田偉,張振華,汪貞,等.牛糞高溫堆肥過程中木質(zhì)纖維素降解及相關(guān)生物學特性研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學報,2014(2):432-438.

[20]Finstein M S,Morris M L.Microbiology of municipal solid waste composting[J].Advances in Applied Microbiology,1975,19:113-151.

[21]朱鳳妹,彭麗莎,李軍.β-葡萄糖苷酶基因克隆及在絲狀真菌中高效表達的研究進展[J].食品安全質(zhì)量檢測學報,2014(10): 3052-3058.

[22]林敏,李洪濤,許修宏,等.在堆肥過程中添加外源菌劑對GH3真菌家族β-葡萄糖苷水解酶微生物群落的影響[J].安徽農(nóng)業(yè)科學,2015(12):88-90.

[23]Goyal S,Dhull SK,Kapoor K K.Chemical and biological chang?es during composting of different organic wastes and assessment of compost maturity[J].Bioresource Technology,2005,96(14): 1584-1591.

[24]楊勝遠,劉玉燕,梁智群.β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌的分離篩選[J].工業(yè)微生物,2002(4):36-38.

Correlation study on cellulose activities and ligocellulose degradation

during composting/LI Hongtao,WANG Han,ZANG Xiangyun,LIU Meiting
(School of Resources and Environmental Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

After the composting in the self-made composting bioreactor,the enzyme dynamics of CMCase andβ-glucosidase determined and the content of cellulose,hemicellulose and lignin in the compost pile were measured,in addition the content of glucose and cellobiose were determined using HPLC.The results showed that the temperature of the pile up to 45℃in the first 3 days of composting,the thermophilic phase started,the thermophilic phase lasted for 8 days.After the peaking temperature,the temperature of pile was approached to the background in the cooling phase.The activity ofβ-glucosidase reached the peak (1.482 μmol p-Nitr?g-1DW?min-1)on the 4th day and stabilized range from 0.429 to 0.533 μmol p-Nitr?g-1DW?min-1.The activity trend of CMCase was similar toβ-glucosidase,reached the peak of 47.67 μg glucose?g-1DW?min-1on the 7th day.The amounts of cellulose and hemicellulose were reduced during the thermophilic phase while the amount of lignin was increased slightly in the cooling phase.The results revealed that the degradation of the cellulose and hemicellulose was a positive correlation to the enzyme dynamics of CMCase.

composting;CMCase;β-glucosidase;high pressure liquid chromatography

S141.4

A

1005-9369（2016）06-0033-08

2016-03-18

國家自然科學基金項目（31300428）；黑龍江省自然科學基金項目（C2015005）；黑龍江省教育廳項目（12541009）；黑龍江省博士后科研啟動基金項目（LBH-Q13017）

李洪濤（1978-），男，副教授，博士，研究方向為農(nóng)業(yè)固體廢棄物資源利用。E-mail：htl@neau.edu.cn