珍稀瀕危植物黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析

楊洪升，李富恒，王長寶，戚曉利，羅志文，李修平，張衛(wèi)東（1.東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱150030；.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯154007）

珍稀瀕危植物黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析

楊洪升1,2，李富恒1*，王長寶2，戚曉利2，羅志文2，李修平2，張衛(wèi)東2
（1.東北農業(yè)大學生命科學學院，哈爾濱150030；2.佳木斯大學生命科學學院，黑龍江佳木斯154007）

利用ISSR分子標記對黃檗17個自然種群作遺傳多樣性分析，8條引物共擴增出81條帶，其中61條具有多態(tài)性。結果表明，在物種水平上多態(tài)位點百分率（PPL）為75.31%，Shannon多樣性指數(shù)（I）為0.3045，Nei's基因多樣性指數(shù)（H）為0.2788。在種群水平上PPL為43.87%，I為0.2243，H為0.2628，種群間遺傳分化系數(shù)Gst為0.2065，基因流Nm為1.9213。AMOVA分析表明，種群間遺傳分化水平Fst為0.2235，黃檗遺傳變異主要存在于種群內（77.65%）。Mantel檢驗表明，黃檗種群間地理距離與遺傳距離間存在極顯著正相關關系（R=0.789，P<0.01）。UPGMA聚類分析將17個黃檗種群分為兩大類：華北種群組和東北種群組，地理較近種群有聚集趨勢。推測長白山地區(qū)為黃檗現(xiàn)代遺傳多樣性分布中心。

黃檗；遺傳多樣性；遺傳分化；ISSR；保護策略

網(wǎng)絡出版時間2016-6-17 15:21:46[URL]http://www.cnki.net/kcms/detail/23.1391.S.20160617.1521.004.htm l

楊洪升,李富恒,王長寶,等.珍稀瀕危植物黃檗種群遺傳多樣性ISSR分析[J].東北農業(yè)大學學報,2016,47(6):26-32.

Yang Hongsheng,Li Fuheng,Wang Changbao,et al.ISSR analysis on genetic diversity in natural populations of rare and endangered species Phellodendron amurense[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(6):26-32.(in Chinese with English abstract)

黃檗（Phellodendron amurense Rupr.）又稱黃菠蘿、黃柏，是蕓香科（Rutaceae）黃檗屬（Phelloden?dron）第三紀古熱帶植物區(qū)系孑遺植物。國內主要分布在東北小興安嶺、長白山、張廣才嶺、完達山、老爺嶺及華北燕山等地，國外分布于俄羅斯遠東地區(qū)、朝鮮和日本[1]。

黃檗作為我國東北闊葉紅松林重要伴生喬木，三大硬闊樹種之一，既是珍貴用材樹種，也是我國傳統(tǒng)中藥黃柏藥源植物。由于長期不合理藥材采收及過量林木采伐，野生黃檗資源急劇減少，已被列入國家二級保護植物名錄[2]。目前對黃檗研究主要集中在種群結構、化學成分含量、藥理作用和更新繁殖等方面[3-6]。在黃檗遺傳多樣性研究方面，閆志峰等對10個野生黃檗種群作AFLP分析，認為黃檗物種水平遺傳多樣性高于其種群水平遺傳變異[7]。李紹臣等利用ISSR分子標記吉林省10個黃檗種群作遺傳多樣性分析，結果表明黃檗種群間存在明顯分化[8]，由于所用分子標記及采樣策略局限，未能全面揭示黃檗物種水平上遺傳多樣性和分布格局。

簡單序列重復區(qū)間多態(tài)性（ISSR）是新型分子標記技術，綜合其他分子標記技術特點[9]，具有操作簡單、所需DNA量少、多態(tài)性高、重復性好、不需預知研究對象的基因組序列等優(yōu)點，已被成功應用于多種植物遺傳多樣性研究，并取得較好效果[10-13]。本研究采用ISSR分子標記，在分布區(qū)代表性山脈采樣基礎上，從核基因角度揭示野生黃檗種群遺傳多樣性，為合理開發(fā)利用黃檗資源及制定保護策略提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

選取小興安嶺、長白山、張廣才嶺、完達山、老爺嶺以及燕山等山脈17個野生種群，每個種群采集20~24個植株，為避免重復取樣，植株間至少相隔50m，對每株樣樹胸徑、樹高、生境記錄、拍照，并做好標記，每個植株采摘其健康幼嫩葉片8~10片，置于裝有硅膠塑料自封袋迅速干燥，帶回實驗室于-20℃冰箱保存，用于DNA提取。采樣地點種群編號、經(jīng)緯度、海拔高度及每個種群所采集樣本數(shù)量，采樣種群地理位置分布見圖1。

圖1　黃檗樣品采集分布Fig.1 Sampled populations distribution of Phellodendron amurense

1.2DNA提取和PCR擴增

采用改良CTAB法[14]，從硅膠干燥后黃檗葉片中提取總DNA。分光光度計測定OD260和OD280，確定基因組DNA濃度和純度后，稀釋至40 ng·μL-1于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。擴增反應在Eppendorf梯度PCR儀上進行，通過優(yōu)化設計適合黃檗ISSRPCR最佳反應體系，最終確定為20μL反應體系，包括：ddH2O 13μL，10×Buffer 2μL，25mmol·L-1MgCl21.6μL，10 mmol·L-1dNTPs 0.4μL，10 μmol·L-1引物0.8μL，5 U·μL-1Taq DNA聚合酶0.2μL，40 ng·μL-1模板DNA 2μL。PCR擴增程序為：94℃預變性4min；35個循環(huán)：94℃變性30 s，退火45 s，72℃延伸2min；最后72℃延伸8min，4℃保存。PCR產(chǎn)物1.5%瓊脂糖膠（含有0.5μg·mL-1EB）中電泳，電泳緩沖液為0.5× TBE，以DL2000Marker（TaKaRa，寶生物工程大連有限公司）為分子質量標準，5 V·cm-1穩(wěn)定電壓條件下電泳2 h，電泳后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3引物篩選

本研究所用ISSR引物根據(jù)加拿大哥倫比亞大學（UBC）公布第9套ISSR引物序列（100條）進行特異性篩選，由上海生工生物工程股份有限公司合成。隨機從12個種群中各選取1個個體，20μL反應體系擴增篩選。最終篩選出8條重復性好、擴增條帶清晰且具有多態(tài)位點引物用于個體擴增。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

由于ISSR是顯性標記，在相同電泳遷移位置條帶具有同源性。ISSR擴增結果電泳圖譜中，有帶記作“1”，無帶或者弱帶記作“0”，建立“0，1”二元數(shù)據(jù)矩陣，將二元數(shù)據(jù)輸入計算機。采用軟件POPGENE 1.32在假定這些ISSR標記處于Hardy-Weinberg平衡條件下作遺傳參數(shù)分析。分別計算：多態(tài)位點百分率PPL（Proportion of polymor?phic loci）、有效等位基因數(shù)Ne（Effective number of alleles）、Nei's基因多樣性指數(shù)H（Nei's gene diver?sity）、Shannon信息指數(shù)I（Shannon information in?dex）、群體總基因多樣度Ht（Total gene diversity）、群體內基因多樣度HS（Geniediversity within popula?tion）以及Nei's遺傳距離D。群體間Nei's遺傳分化系數(shù)Gst（Coefficient of genetic differentiation）由公式1-HS/Ht算得，基因流Nm（Gene flow）由公式（1-Gst）/ 4Gst算得。AMOVA 1.55軟件作分子方差分析，計算種群內、種群間變異方差分布。采用GenALEX 6.5進行Mantel檢測，檢測種群間地理距離與遺傳距離相關關系。用MEGA 5.0軟件，采用Nei's（1972）計算遺傳距離，作種群間UPGMA（非加權配對算數(shù)平均法）聚類分析。

2　結果與分析

2.1遺傳多樣性

利用8個ISSR引物對17個黃檗自然種群共398份樣品作遺傳多樣性分析，每個引物均能擴增出清晰、穩(wěn)定條帶，其中引物UBC 827對桓仁（HR）種群24個個體DNA樣品擴增結果見圖2。8個引物共擴增出81條

清晰可重復條帶，其中多態(tài)性條帶61條，每條引物擴增出總帶數(shù)范圍從9（UBC827和UBC836）到12條（UBC818）不等，平均每個引物擴增條帶數(shù)為10.1（見表1），所得片段大小分布在200~2 500 bp。

分析結果表明（見表2），在物種水平上，黃檗多態(tài)位點百分率為75.31%，顯示較高遺傳多樣性水平，平均每個位點有效等位基因數(shù)為1.7382，Nei's基因多樣性指數(shù)為0.2788，Shannon多樣性指數(shù)為0.3045。

圖2　UBC827引物對桓仁種群擴增結果Fig.2 ISSR bands amplified with primer UBC827 from Huanren population

表1　ISSR引物及其擴增結果Table1 ISSR primers and their polymorphisms of amplified bands

表2　黃檗取樣種群信息及基于ISSR標記遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Sampling details of P.amurense and genetic diversity based on ISSR marker

由表2可知，黃檗種群內多態(tài)性位點百分率23.23%~69.52%，平均43.87%，各種群多態(tài)性百分率差異較大，其中WQ種群多態(tài)位點百分率最高69.52%；BJ種群多態(tài)位點百分率最低23.23%。每個位點平均有效等位基因數(shù)（Ne）為1.3244，種群Nei's基因多樣性指數(shù)在0.1152~0.2792，平均值0.2243；Shannon多樣性指數(shù)0.1500~0.4178，平均值0.2628，且H和I較高值均出現(xiàn)在長白山WQ、WC和JH種群，較低值出現(xiàn)在BJ、HN和QL種群，兩者大小與種群多態(tài)位點百分率趨勢基本一致。

2.2黃檗種群間遺傳變異

種群遺傳變異AMOVA分析顯示（見表3），黃檗種群間遺傳分化系數(shù)Fst為0.2235，即在總遺傳變異中有77.65%變異存在于種群內，種群內遺傳變異比種群間遺傳變異高，且種群內和種群間差異均極顯著（P<0.001）。通過POPGENE分析，在物種水平上黃檗17個群體基因多樣度（Ht）為0.2788，種群內基因多樣度（Hs）為0.2212，種群間基因多樣度Dst為0.0576，種群間遺傳分化系數(shù)Gst為0.2065，顯示總遺傳變異中有79.35%來自種群內，20.65%來自種群間，遺傳變異主要存在于種群內。由此可見，AMOVA和POPGENE分析結果基本一致，均表明種群內遺傳分化大于種群間遺傳分化。種群間基因流（Nm）估測值為1.9213，表明種群間基因流處于較高水平，有利于種群間基因交流。

表3　17個黃檗種群分子方差分析Tab le3 AMOVA analyses of P.amurense from 17 populations

2.3種群間遺傳距離及其聚類

POPGENE軟件計算黃檗17個種群間Nei's遺傳距離介于0.036與0.304之間。其中伊春（YC）種群與湯旺河（TWH）種群遺傳距離最小，為0.036；林口（LK）種群與北京（BJ）種群遺傳距離最大，為0.304。根據(jù)黃檗種群間遺傳距離，運用MEGA軟件采用算術平均數(shù)非加權成組配對法（UPGMA），對17個種群聚類分析，UPGMA聚類分析結果表明（見圖3）。

17個黃檗種群主要分為兩大類群：華北種群組和東北種群組。華北種群組包括北京（BJ）種群和青龍（QL）種群；東北種群組包括其余15個種群，其中長白山6個種群與老爺嶺1個種群聚成1組，小興安嶺3個種群與張廣才嶺2個種群聚成1組，完達山2個種群單獨聚成1組，3組聚成1個大類群，與其地理分布格局大致吻合。Mantel檢驗表明，黃檗各種群間遺傳距離與地理距離存在正相關關系，且相關性極顯著（R=0.789，P<0.01），表明地理距離越近種群，其遺傳距離也越近；反之越遠。

圖3　17個黃檗種群間基于Nei's遺傳距離UPGMA聚類結果Fig.3 UPGMA result for 17 sampled populations of P.amurense based on Nei'sgenetic distance

3　討論與結論

3.1遺傳多樣性

遺傳多樣性是生物攜帶遺傳信息總和，是長期進化產(chǎn)物，也是其生存、發(fā)展和進化基礎[15]。在評價種群遺傳多樣性參數(shù)中，多態(tài)位點百分率、Shannon信息指數(shù)和Nei's基因多樣性指數(shù)是衡量種群遺傳多樣性主要指標。本研究所用ISSR反應體系具有良好穩(wěn)定性和可重復性，應用該分子標記技術對篩選出的8個引物PCR擴增，得出平均多態(tài)位點數(shù)7.6個，多態(tài)位點百分率75.31%，Shannon多樣性指數(shù)0.3045，Nei's基因多樣性指數(shù)0.2788。與其他采用ISSR分子標記檢測的東北地區(qū)常見溫帶闊葉落葉樹種蒙古櫟[16]、胡桃楸[17]和紫椴[18]一致，表現(xiàn)出較高水平遺傳多樣性。本研究結果與閆志峰等采用AFLP分子標記對10個黃檗代表種群遺傳多致性研究結果基本一致（PPL=92.77%；H= 0.2316；I=0.4275）[7]，但比李紹臣等采用ISSR分子標記對局部區(qū)域黃檗遺傳多樣性要高[8]，原因是本研究從黃檗自然分布大范圍取樣，基本覆蓋黃檗在我國的自然分布區(qū)域。

黃檗具有較高遺傳多樣性可能與其繁育系統(tǒng)和生活史有關。黃檗屬多年生落葉喬木，雌雄異株、蟲媒傳粉，這種異交繁育系統(tǒng)被認為是物種維持較高遺傳多樣性水平重要因素[19]。此外，黃檗具有較大分布范圍、長命生活史及良好生態(tài)適應性[20]，也有利于維持一定遺傳多樣性水平。不同黃檗種群遺傳多樣性差異顯著（見表1），長白山地區(qū)野生資源分布集中，遺傳多樣性水平相對較高，由此推測長白山地區(qū)是黃檗遺傳多樣性分布中心。

3.2遺傳分化

黃檗種群間Nei's基因分化系數(shù)Gst=0.2065，表明其遺傳變異主要存在于種群內，即種群間遺傳分化較小。AMOVA分析也顯示，黃檗遺傳變異中22.35%發(fā)生在種群間，77.65%發(fā)生在種群內。如前所述，黃檗生殖方式是有性生殖，主要傳粉方式是蟲媒，主要靠食果鳥類進行較遠距離種子傳播[6]，這種傳粉方式及種子傳播方式有利于種群間基因流發(fā)生，可防止種群間遺傳分化。根據(jù)Gst值，推算黃檗種群間基因流Nm=1.9213，表明黃檗種群間存在較強基因流，當Nm>1時，一定程度上可抵消種群間因遺傳漂變而引起的遺傳分化[21]，這也是黃檗種群間遺傳分化小，遺傳變異主要存在于種群內原因之一。經(jīng)Mantel檢驗發(fā)現(xiàn)遺傳和地理距離呈顯著正相關，說明地理隔離對黃檗種群遺傳分化影響顯著。根據(jù)UPGMA聚類結果表明，地理距離較近種群有聚集趨勢，17個黃檗種群可分為兩大類群即華北種群與東北種群，可能是由于兩大類群地理距離較遠，影響兩者基因交流，長期自然選擇進而導致遺傳分化。

3.3保護策略

了解物種遺傳多樣性及其遺傳分化可為制定珍稀瀕危物種保護策略及栽培利用措施提供重要信息[19]。本研究發(fā)現(xiàn)黃檗物種水平上具有較高遺傳多樣性，遺傳多樣性主要存在于種群內。因此，黃檗野生種群仍具有較高適應能力和進化潛力。但若不能有效阻止生境惡化及人為破壞，將加速黃檗種群片斷化，種群規(guī)模進一步減小，引起種群遺傳漂變發(fā)生，導致當前豐富遺傳多樣性大量喪失，影響該物種生存及可利用優(yōu)質資源喪失。因此，基于黃檗遺傳多樣性及種群生存現(xiàn)狀，建議采取以下保護措施：

①應盡快建立黃檗專門保護區(qū)，同時重視黃檗棲息地以及周圍環(huán)境保護，加強宣傳力度，禁止亂砍亂伐，保護盡可能多的遺傳變異。

②在加強對現(xiàn)有種群保護基礎上，進一步加強黃檗繁殖生物學研究，由于黃檗果實粘度大，果皮腐爛速度慢，種子具有胚生理后熟特點，在自然環(huán)境下種子發(fā)芽率較低，因此有必要建立人工繁育基地以提高種子繁育率和幼苗成活率，擴大黃檗種群規(guī)模。

③華北種群和東北種群作為兩個獨立單元保護，尤其注意優(yōu)先保護遺傳多樣性較高種群（WQ、WC、HD、JH）和遺傳多樣性較低種群（BJ、QL、HN）。

④考慮黃檗遺傳變異主要來自于種群內，因此遷地保護時，需盡可能在所有種群內采樣，保存遺傳資源。

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ISSR analysis on genetic diversity in natural populations of rare and endangered species Phellodendron amurense/YANG Hongsheng1,2,LI Fuheng1,

WANG Changbao2,QI Xiaoli2,LUO Zhiwen2,LI Xiuping2,ZHANG Weidong2
(1.School of Life Sciences,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Life Science, Jiamusi University,Jiamusi Heilongjiang 154007,China)

Genetic diversity of 17 natural populations of Phellodendron amurense was assessed by the Inter-Simple Sequence Repeat(ISSR)technique,using eight specific and stable primers,a total of 81 loci were identified,61 of which were polymorphic.The results showed that at the species level,total percentage of polymorphic loci(PPL)was 75.31%,and Shannon's information index(I)and Nei's gene diversity(H) were 0.3045 and 0.2788,respectively.At the population level,the mean value of P,I and H were 43.87%, 0.2243 and 0.2628,respectively.The genetic differentiation coefficient(Gst)among populations was 0.2065, and the value of gene flow(Nm)inferred from Gst was 1.9213.Analysis of molecular variance(AMOVA)demonstrated that most variance occurred within populations,while the variance among populations accounted for 22.35%(Fst=0.2235).Mantel test results showed a significant positive correlation between genetic distance and geographic distance among all populations(R=0.789,P<0.01).Total 17 populations were clustered into two groups by the UPGMA analysis including the North China group and the Northeast China group.Moreover,results of UPGMA clustering analysis showed that the populations tend to cluster together were nearer in geographical distance.The Changbai Mountain may be modern center of genetic diversity for P.amurense.

Phellodendron amurense；genetic diversity；genetic differentiation；ISSR；protection strategy圖1黃檗樣品采集分布

S792.31

A

1005-9369（2016）06-0026-07

2016-03-17

國家自然科學基金項目（81441132）；黑龍江省教育廳科學技術研究項目（12541808）；佳木斯大學青年基金項目（Sq2013-026）

楊洪升（1979-），男，講師，博士研究生，研究方向為植物資源學與分子生態(tài)學。E-mail:yhongsheng@126.com

李富恒，教授，博士生導師，研究方向為植物生理生化。E-mail:lifuheng1963@126.com