pH響應(yīng)性聚合物膠束的制備、表征及對阿霉素的控制釋放研究

苑瑩芝,馬　敏,張　丹,袁建超

(西北師范大學 化學化工學院，甘肅省高分子材料重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

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pH響應(yīng)性聚合物膠束的制備、表征及對阿霉素的控制釋放研究

苑瑩芝,馬敏,張丹,袁建超

(西北師范大學 化學化工學院，甘肅省高分子材料重點實驗室，甘肅 蘭州 730070)

以主鏈含腙鍵的聚乙二醇大分子(PEG-NH-N=CH-OH)為引發(fā)劑，通過開環(huán)聚合己內(nèi)酯(ε-CL)，制備了一種具有pH響應(yīng)性的兩親性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL. 運用核磁共振(1H NMR)、透射電鏡(TEM)和動態(tài)光散射(DLS)等對聚合物的結(jié)構(gòu)、膠束的形貌及粒徑進行表征. 結(jié)果表明，聚合物膠束呈規(guī)整球形且分布均勻，平均粒徑約98 nm， pH 5.0時膠束粒徑顯著增加. 負載阿霉素(DOX)的聚合物膠束的載藥量為16.4%，包封率為57.4%. 體外釋放研究表明，pH 5.0時藥物釋放速率比pH 7.4時快，48 h后累計釋放率達91.1%. 因此，該pH響應(yīng)性聚合物膠束作為抗癌藥物載體具有潛在的應(yīng)用價值.

聚合物膠束；兩親性嵌段共聚物；pH響應(yīng)性；阿霉素；控制釋放

惡性腫瘤的發(fā)病率大幅增加,嚴重威脅到人類的生命和健康[1]. 化療是治療癌癥最有效的手段之一,但抗癌藥物的非特異性分布、全身毒性、以及腫瘤細胞的多重耐藥性是導致感染藥物治療和腫瘤化療失敗的重要原因,降低了抗癌藥物的治療療效[2-3]. 其中,抗癌藥物阿霉素(DOX)常用于各種癌癥的治療,如卵巢癌,乳腺癌,肺癌和軟組織瘤. 但由于DOX的短半衰期和對正常組織的毒副作用,如心臟中毒和骨髓抑制,DOX的臨床應(yīng)用受到極大限制[4-5]. 近年來,生物可降解聚合物膠束作為納米藥物載體備受矚目[6-8],它能包裹疏水性藥物,提高藥物在水中的溶解度,延長藥物在血液中的循環(huán)時間. 另外,聚合物膠束的尺寸一般為10～200 nm,可以避免納米粒子過早地被腎臟清除和免疫系統(tǒng)吞噬,并且憑借高通透性和滯留效應(yīng)(EPR效應(yīng)),促進了大分子類物質(zhì)在腫瘤組織處的選擇性分布,達到被動靶向的作用,降低全身副作用和改善藥物利用率[9-10].

值得注意的是,EPR效應(yīng)只能促進納米載藥體系在腫瘤部位富集,但無法將藥物定向輸送到腫瘤細胞內(nèi)并完成快速藥物釋放,也不能控制藥物的釋放量為靶向位點提供有效的藥物濃度[11]. 刺激響應(yīng)性膠束可根據(jù)內(nèi)部刺激(如pH、氧化還原電位、溶酶體酶)或外部刺激(如溫度、磁場、光)快速響應(yīng),如溶解、溶脹或坍塌,從而達到在靶位或在合適時間釋放藥物的目的,提高治療療效[12-14]. 在這些刺激中,pH響應(yīng)性是使用最廣泛的,由于人體環(huán)境天然存在pH的差異,如腫瘤組織的pH(pH 6.0～7.2)低于人體血液和正常組織(pH 7.4)而顯酸性,腫瘤細胞內(nèi)的pH更低(早期核內(nèi)體: pH 5.0～6.0,晚期溶酶體: pH 4.0～5.0)[15-18]. 目前,已有大量基于酸敏感鍵(原酸酯、腙和縮醛等)的pH響應(yīng)性膠束的研究. 其中,特別是腙鍵,它在中性條件下穩(wěn)定,酸性環(huán)境中容易水解，并被廣泛用于連接聚合物主鏈和各種活性治療藥物[19-24]. 聚乙二醇(PEG)和聚(ε-己內(nèi)酯)(PCL)是具有生物可降解性和良好生物相容性的材料,并已獲得FDA批準. 由PEG-PCL嵌段共聚物自組裝形成的膠束作為納米藥物載體尤為常見[25-27]. 但其存在降解緩慢和無刺激響應(yīng)性等缺陷,從而阻礙了藥物在腫瘤部位高效累積,降低了體內(nèi)抗腫瘤效率.

圖1　pH響應(yīng)性膠束的自組裝及細胞內(nèi)DOX釋放Fig.1　Illustration of self-assembly pH-sensitive micelles andpH-triggered intracellular release of DOX

本文中我們將腙鍵引入到兩親性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL的主鏈上,制備了一種生物相容性好的pH響應(yīng)性藥物載體. 嵌段共聚物在水溶液中自組裝形成聚合物膠束,PEG嵌段被賦予優(yōu)良的生物相容性優(yōu)先位于外表面,而PCL嵌段位于核心內(nèi)負載藥物. 在溶酶體的酸性環(huán)境中,載藥膠束迅速膨脹或破裂,藥物得以釋放并最終滲入細胞核,殺死腫瘤細胞(圖1). 利用動態(tài)光散射和透射電鏡觀察聚合物膠束的大小和形貌,并驗證了其pH響應(yīng)性. 同時制備了載有阿霉素的聚合物膠束,并對其體外藥物釋放進行了研究.

1　實驗部分

1.1試劑及儀器

聚乙二醇(PEG,Mn=5 000)、對硝基苯基氯甲酸酯(NPCF)、對羥基苯甲醛 (PHB)、ε-己內(nèi)酯 (ε-CL)、鹽酸阿霉素(DOX·HCl)、吡啶、水合肼、鋅酸亞錫 (阿拉試劑公司)；二氯甲烷(CH2Cl2)、二甲基亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺 (DMF) (北京化工廠)；其他為常用分析純試劑.

Nano-ZS90動態(tài)光散射納米粒度儀(Malvern Ltd,英國); Mercury plus-400 MHz核磁共振波譜儀(Varian,美國); JEM-2100F透射電子顯微鏡(TEM,JEOL,日本); DUV-3700紫外可見分光光度計(UV/Vis,日本島津公司).

1.2PEG-NPCF的合成

稱取PEG (100 mg, 0.02 mmol) 溶于20 mL CH2Cl2中,用微量進樣器向該反應(yīng)體系中加入16.11 μL吡啶,不斷攪拌直至溶解. 將5 mL NPCF (200 mg, 0.99 mmol) 的CH2Cl2溶液逐滴加入到反應(yīng)體系中,攪拌24 h, 控制整個反應(yīng)過程的溫度為0 ℃. 反應(yīng)后，濃縮反應(yīng)液并用石油醚、乙酸乙酯沉淀,重復操作3次后,真空干燥至恒重,即得白色固體PEG-NPCF.

1.3PEG-NH-NH2的合成

稱取PEG-NPCF (100 mg, 0.02 mmol)溶于 10 mL 無水乙醇,將29.10 μL水合肼逐滴滴加到反應(yīng)體系中,90 ℃回流攪拌48 h. 冷卻至室溫后,濃縮反應(yīng)液,加入石油醚、乙酸乙酯,使沉淀析出,用無水乙醇洗滌沉淀,重復操作3次后,真空干燥即得淡黃色固體PEG-NH-NH2.

1.4PEG-NH-N=CH-OH的合成

稱取PEG-NH-NH2(200 mg, 0.04 mmol),PHB (20 mg, 0.16 mmol) 置于Schlenk瓶中,用4 mL 的DMSO溶解,加入1滴無水乙酸,抽真空充氮氣循環(huán)3～5次,密封Schlenk瓶,于65 ℃攪拌反應(yīng)48 h. 用石油醚、乙酸乙酯沉淀,過濾,重復操作3次后,真空干燥即得白色固體.

1.5PEG-NH-N=CH-PCL的合成

在Schlenk瓶中，將PEG-NH-N=CH-OH (100 mg, 0.02 mmol),ε-CL(130 mg, 1.14 mmol),鋅酸亞錫 (20.25 mg, 0.05 mmol) 溶于5 mL 甲苯中,抽真空充氮氣循環(huán)3～5次,于110 ℃攪拌反應(yīng)24 h. 冷卻至室溫后,加入適量氯仿使反應(yīng)物完全溶解,用冷乙醚沉淀,過濾,真空干燥即得淡黃色固體PEG-NH-N=CH-PCL.

1.6聚合物膠束的自組裝及表征

將10 mg聚合物加入到1 mL DMF中,超聲直至溶解,然后逐滴滴加(1滴 / 15 s)10 mL蒸餾水,室溫攪拌24 h后即得穩(wěn)定的聚合物膠束. 取5 mL膠束溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(MWCO 3000)中,用蒸餾水透析48 h,即得空白聚合物膠束. 37 ℃條件下,采用動態(tài)光散射(DLS)測量聚合物膠束的粒徑及粒徑分布. 通過透射電鏡(TEM)觀察聚合物膠束的形態(tài)結(jié)構(gòu). 將透析得到的聚合物膠束滴在銅網(wǎng)表面,放在紅外燈下,待干燥后,采用TEM檢測,加速電壓為200 kV.

1.7載藥膠束的制備與體外釋放

將5 mg PEG-NH-N=CH-PCL和2 mg DOX溶于0.5 mL DMF中,超聲直至溶解,然后向溶液中逐滴滴加(1滴 / 15 s)5mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4),室溫下攪拌24 h. 將載藥膠束溶液轉(zhuǎn)移至透析袋(MWCO 3 000)中,在磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)中透析48 h,在12 000 r/min下離心15 min,冷凍干燥上層清液得到載藥膠束,整個過程在避光條件下進行.配制不同濃度的DOX溶液,在37 ℃下,用UV/Vis可見光譜檢測480 nm激發(fā)波長處的吸光度,繪制標準曲線. 為了測量載藥量,將凍干的載藥膠束溶于DMF中,檢測其在480 nm處的吸光度值,并帶入標準曲線方程中,包封率和載藥量的計算公式如下:

包封率=(負載到膠束中DOX的質(zhì)量/

(1)

載藥量=(負載到膠束中DOX的質(zhì)量/

(2)

計算結(jié)果,膠束的包封率為57.4% ,載藥量為16.4%.

將載藥膠束溶于5 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中(1 g/L),置于透析袋(MWCO 3000)后,將其分別放于100 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液和pH 5.0的醋酸緩沖溶液中透析.在理想時間間隔(1、3、8 h等)內(nèi),每次取3 mL透析液測樣,并立即放回以維持培養(yǎng)基的體積.用 UV/Vis可見光譜在480 nm 處檢測透析液中DOX的吸光度,并繪制體外釋放曲線.

2　結(jié)果與討論

2.1聚合物的核磁共振氫譜表征

PEG通過取代,肼解等一系列反應(yīng)得到末端為羥基的聚乙二醇大分子,并以此大分子作為引發(fā)劑,開環(huán)聚合ε-CL,合成兩親性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL. PEG-NH-N=CH-OH和PEG-NH-N=CH-PCL的1H NMR譜圖如圖2所示.

圖2　聚合物PEG-NH-N=CH-OH(A)和PEG-NH-N=CH-PCL(B)的核磁共振譜圖Fig.2　1H NMR spectra of PEG-NH-N=CH-OH (A)and PEG-NH-N=CH-PCL (B)

圖2A中δ3.22(a)和3.49(b)處分別為PEG-NH-N=CH-OH中甲氧基(-OCH3)和重復單元(-OCH2CH2O-)的質(zhì)子吸收峰,11.05(c)處為-NH-的質(zhì)子吸收峰,8.55(d)處為-N=CH-的質(zhì)子吸收峰,表明成功合成含腙鍵的聚乙二醇大分子引發(fā)劑. 圖2B為嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL的1H NMR譜圖,δ2.31、1.65、1.38、4.06(f、g、h、i)處分別為PCL的質(zhì)子吸收峰,峰面積之比為2:4:2:2. 與圖2A相比,聚合物PEG-NH-N=CH-PCL中其他質(zhì)子的位置基本保持不變,說明腙鍵在聚合的過程中沒有被破壞,以上分析證明成功合成了兩親性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL. 根據(jù)圖2B中PEG在δ3.63(b)處的特征峰積分面積Sb=1可得Si=0.24,因此由下面的公式計算出聚合物中PCL的聚合度(DP)為54, 則PEG-NH-N=CH-PCL的數(shù)均相對分子質(zhì)量Mn=11 324.

(3)

2.2PEG-NH-N=CH-PCL膠束的粒徑、形貌及pH響應(yīng)性

粒徑是藥物遞送的一個關(guān)鍵參數(shù),對體內(nèi)藥代動力學和膠束的分布有顯著影響[28]. TEM照片(圖3B)表明聚合物膠束為核-殼球形結(jié)構(gòu),在水中分散性良好,粒徑為98 nm 左右. 與DLS測量結(jié)果(圖3A)相比，數(shù)值偏小,這可能是因為TEM測試的是銅網(wǎng)上干燥狀態(tài)下的聚合物膠束, PEG外殼收縮,粒徑變小. 由于在聚合物制備的過程中引入了腙鍵,在弱酸性條件下,腙鍵會發(fā)生斷裂,引起PCL核裂解和PEG外殼脫落. 因此,為了證實這一響應(yīng)機理,在37 ℃條件下,利用DLS測定膠束在pH 7.4和5.0的緩沖溶液中不同時間間隔內(nèi)的粒徑變化,如圖

圖3　聚合物膠束的動態(tài)光散射圖(A)和透射電鏡照片(B)Fig.3　Size distribution determined by DLS (A) andTEM micrographs (B) of the polymeric micelles

圖4　PEG-NH-N=CH-PCL膠束響應(yīng)pH的粒徑變化圖Fig.4　Size change of PEG-NH-N=CH-PCL micellesin response to pH determined by DLS

4所示,結(jié)果表明,pH 5.0時,膠束迅速溶脹或聚集,3 h內(nèi),膠束粒徑從起初的110 nm增加到204 nm,24 h后粒徑達到809 nm. 相反,pH 7.4時,24 h 內(nèi),膠束粒徑幾乎沒有任何改變.由此證明,聚合物膠束具有明顯的pH響應(yīng)性,同時也表明了制備的膠束具有良好的穩(wěn)定性.

2.3阿霉素的體外藥物釋放研究

為了進一步研究載藥膠束作為藥物載體對DOX的緩釋行為,我們分別在pH 7.4 和5.0的緩沖溶液中模擬體外藥物釋放,釋放曲線如圖5所示. pH 7.4時,DOX的累積釋放率十分緩慢,48 h后累計釋放率僅為18.3%. 而pH 5.0時, 起初1 h內(nèi)DOX的累計釋放率為12.5%,出現(xiàn)明顯的暴釋現(xiàn)象,8 h后累積釋放率逐漸變緩,48 h后累計釋放率高達91.1%.這一釋放結(jié)果說明聚合物膠束對pH具有響應(yīng)性,可以對細胞內(nèi)酸性環(huán)境作出響應(yīng),實現(xiàn)細胞內(nèi)藥物的可控釋放,同時有利于提高藥物在腫瘤細胞中的累積,減少藥物毒副作用.

圖5　pH 響應(yīng)性載藥膠束的體外藥物釋放圖Fig.5　In vitro release behavior of DOX frompH-sensitive drug-loaded micelles

3　結(jié)論

合成了一種簡單的基于腙鍵pH響應(yīng)的兩親性嵌段共聚物PEG-NH-N=CH-PCL. 該共聚物在水溶液中自組裝形成核-殼結(jié)構(gòu)的球形聚合物膠束，膠束分散性良好且穩(wěn)定存在，粒徑在98 nm左右. pH 5.0時,連接PEG和PCL的腙鍵斷裂,導致膠束尺寸變大或解離. 載藥膠束的體外模擬釋放研究結(jié)果表明, pH 5.0時的藥物累計釋放率明顯較高,48 h內(nèi)DOX的累積釋放率達91.1%,而pH 7.4時DOX的累積釋放率為18.3%. 總之, PEG-NH-N=CH-PCL膠束為智能藥物載體系統(tǒng)提供了一個高效的平臺,在癌癥治療中有著極為廣闊的應(yīng)用前景.

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[責任編輯：張普玉]

pH-sensitive polymeric micelles: preparation, characterization and controlled release of DOX

YUAN Yingzhi, MA Min, ZHANG Dan, YUAN Jianchao*

(KeyLaboratoryofGansuPolymerMaterials,CollegeofChemistryandChemicalEngineering,NorthwestNormalUniversity,Lanzhou730070,Gansu,China)

A novel pH-sensitive block copolymer (PEG-NH-N=CH-PCL) containing hydrazone bond was synthesized by ring-opening polymerization ofε-caprolactone (ε-CL) in the presence of PEG macromolecular initiator containing hydrazone bond (PEG-NH-N=CH-OH). The structure of polymer, morphology and particle size of micelles were confirmed by nuclear magnetic resonance (1H NMR), transmission electron microscopy (TEM) and dynamic light scattering (DLS).The results showed that polymeric micelles had regular spherical structure and mean size was about 98 nm, the diameter of the micelles increased significantly in pH 5.0. The drug loading content and loading efficiency of DOX-loaded micelles were 16.4% and 57.4%, respectively. The in vitro release studies suggested that the drug release of micelles in pH 5.0 was much faster than that in pH 7.4. The cumulative release rate was up to 91.1% within 48 h. Thus, the pH-responsive polymer micelles have potential applications as anti-cancer drug carrier.

polymeric micelle； amphiphilic block copolymer； pH-sensitive； doxorubicin； controlled release

2016-07-05.

國家自然科學基金資助項目(21364011， 20964003).

苑瑩芝(1990-)，女，碩士生，研究方向為靶向抗腫瘤高分子藥物、生物高分子材料等.*

，E-mail: jianchaoyuan@nwnu.edu.cn.

O63；TB381

A

1008-1011(2016)05-0630-06