蛋白酶活化受體1調(diào)控 Mcl-1和Bax 表達介導熱打擊致人臍靜脈內(nèi)皮細胞早期凋亡的研究

王鄭蓮　徐秋林　劉亞楠　周耿標　劉云松　邱俊明　蘇　磊

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學科，全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復重點實驗室，廣東　廣州　510010；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東　廣州　510403；3.廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東　廣州　510000）

論著

蛋白酶活化受體1調(diào)控 Mcl-1和Bax 表達介導熱打擊致人臍靜脈內(nèi)皮細胞早期凋亡的研究

王鄭蓮1,2徐秋林1劉亞楠1周耿標3劉云松1邱俊明1蘇磊1

（1.廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院重癥醫(yī)學科，全軍熱區(qū)創(chuàng)傷救治與組織修復重點實驗室，廣東廣州510010；2.廣州中醫(yī)藥大學，廣東廣州510403；3.廣東省中醫(yī)院芳村醫(yī)院重癥醫(yī)學科，廣東廣州510000）

目的：觀察熱打擊人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）后蛋白酶活化受體1（PAR1）對凋亡相關蛋白Mcl-1、Bax水平表達調(diào)控及細胞早期凋亡的影響，明確PAR1在熱打擊致HUVECs凋亡中的作用。方法:采用PAR1抑制劑SCH79797（SCH）、PAR1激動劑TFLLR-NH2（TF）、PAR1siRNA、PAR1腺病毒過表達預處理HUVECs，給予42 ℃熱打擊2 h，后于8 h提取各處理組總蛋白，western blot檢測Mcl-1、Bax、Caspase 3及Cleaved-Caspase 3蛋白表達，流式細胞計數(shù)儀檢測各處理組細胞早期凋亡。結果:與正常對照組比較，熱打擊組Mcl-1、Bax、Caspase 3表達增加及Cleaved-Caspase 3活化程度增加（P＜0.05）；與熱打擊組比較，PAR1抑制劑或PAR1siRNA聯(lián)合熱打擊組Mcl-1表達增加（P＜0.05），Bax減少（P＜0.05），Cleaved-Caspase 3活化程度降低，細胞早期凋亡數(shù)目減少（P＜0.05，P＜0.01），PAR1激動劑或PAR1腺病毒聯(lián)合熱打擊組Bax表達增加（P＜0.05），Mcl-1表達減少（P＜0.05），Cleaved-Caspase 3活化程度增加，且細胞早期凋亡數(shù)目增加（P＜0.05或P＜0.01）。結論:熱打擊HUVECs可發(fā)生細胞凋亡，Mcl-1、Bax蛋白表達增加；PAR1通過調(diào)控Mcl-1及Bax的表達最終起到促凋亡作用。

熱打擊人臍靜脈內(nèi)皮細胞細胞凋亡蛋白酶活化受體1Mcl-1Bax

重癥中暑是指核心溫度超過40 ℃并因熱損傷后繼發(fā)系統(tǒng)性炎癥反應和凝血功能障礙從而導致的多器官功能障礙綜合征，涉及細胞因子、炎性介質(zhì)、凝血系統(tǒng)的激活和內(nèi)皮細胞損傷之間的交互反應［1］。血管內(nèi)皮細胞是熱打擊的重要效應細胞［2］。細胞凋亡是中暑細胞死亡的主要特征，我們前期研究了p53及核因子-κB （NF-κB） 在熱打擊致人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVECs）凋亡中的作用及機制［3-4］，證實了細胞凋亡在HUVECs參與的重癥中暑發(fā)病機制中起著重要作用。蛋白酶活化受體1（PAR1）是一種損傷處血管內(nèi)皮細胞生成的多功能蛋白酶，在血管內(nèi)皮損傷后炎癥激活及屏障功能破壞中起著重要作用［5］。前期研究表明，熱打擊HUVECs可導致PAR1表達增加，且在熱打擊后8 h 其表達水平達到峰值［6］。Mcl-1、Bax是Bcl-2家族中的重要成員，二者在凋亡調(diào)控中具有重要作用［7］。本實驗旨在研究PAR1在熱打擊HUVECs后與Mcl-1、Bax及凋亡的關系，闡明熱打擊后細胞凋亡的信號轉(zhuǎn)導機制，探討重癥中暑致血管內(nèi)皮損害的發(fā)病機制。

1　材料與方法

1.1主要實驗材料HUVECs（中國科學院上海細胞生物學研究所）；PAR1抗體（Sigma，美國，鼠抗），Mcl-1、Bax抗體、Caspase3、Cleaved-Caspase3（CST，美國，兔抗），GAPDH抗體（兔抗）、山羊抗兔二抗（北京中杉金橋），凋亡檢測試劑盒（上海聯(lián)科生物科技），PAR1激動劑TFLLR-NH2（TF，Sigma，美國），PAR1抑制劑SCH79797（SCH，Abcam，英國），裂解液、BCA蛋白定量試劑盒（上海碧云天），DMEM-F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、雙抗、25 cm2細胞培養(yǎng)瓶、35 mm培養(yǎng)皿（Hyclone，美國），PVDF膜、ECL顯影液（Millipore，美國）；30%丙烯酰胺（廣州捷倍斯），預染蛋白Marker（Fermentas，立陶宛），5×上樣緩沖液（廣州晶欣），封閉液（Mpbio，美國）。PAR1siRNA 基因序列（20 μmol/L，上海吉瑪，中國）； PAR1siRNA正義鏈5'-GAACCCUGCUCGAAGGCUACUATT-3'；反義 鏈5'-UAGUAGCCUUCGAGCAGGGUUCTT-3'。NCsiRNA基因序列（20μmol/L）：正義鏈5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3'，反義鏈5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3'。siRNA-MateTM轉(zhuǎn)染試劑（上海吉瑪）， PAR1腺病毒（山東維真生物科技有限公司）：基因序列號NM-001992 ORF克隆至pAD-kan載體。

1.2方法

1.2.1細胞復蘇培養(yǎng)HUVECs復蘇后收入離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清，用DMEM-F12完全培養(yǎng)液（含10%胎牛血清，1×105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素）混勻細胞，轉(zhuǎn)入25 cm2培養(yǎng)瓶中，在37 ℃、5 %CO2濃度及飽和濕度條件下培養(yǎng)，次日換液，以后根據(jù)細胞生長情況每48～72 h 更換培養(yǎng)液1次，每周傳代1～2次。

1.2.2PAR1siRNA 及陰性對照組（NCsiRNA）轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)染前提前一天將正常細胞接種在35 mm的培養(yǎng)皿上，接種細胞數(shù)量控制在 1×105個/皿，使第2天轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度控制在30%～50%。轉(zhuǎn)染時移除原有的培養(yǎng)基，加入 500 μl 的無血清培養(yǎng)基，分別取siRNA及NCsiRNA儲液（濃度是20 μmol/L）1 μl加入19 μl去核糖核酸酶水，稀釋至1 μmol/L，取1 μmol/L的siRNA稀釋液11 μl加入到100 μl無血清DMEM培養(yǎng)基，輕輕混勻，室溫放置5 min；取10 μl siRNA-MateTM加入到經(jīng)培養(yǎng)基稀釋的siRNA 溶液中，立即用加樣器吹打10次以上，充分混勻，輕微離心后，室溫放置10 min，以便 siRNA-siRNA-MateTM復合物形成；將siRNA-siRNAMateTM復合物逐滴滴加到每一個包含細胞和培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，輕輕地前后搖動培養(yǎng)板混合均勻，4～6 h后改換完全培養(yǎng)基。然后放置在37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱孵育48～72 h。

1.2.3PAR1腺病毒（Ad-PAR1）及空載體腺病毒（Ad-empty）轉(zhuǎn)染①準備細胞：實驗前一天接種5×103個目的細胞于96孔培養(yǎng)板中（接種8個孔），加入培養(yǎng)基100 μl，確保進行病毒感染時細胞的融合率約40%～50%。②配制腺病毒溶液：準備6個無菌EP管，在第1個EP管中加入990 μl完全培養(yǎng)基，其余5個各加入 900 μl 完全培養(yǎng)基；取10 μl腺病毒原液加入990 μl EP管中做1∶100稀釋；然后以此為起點，再取100 μl稀釋液加入到900 μl的EP管中做1∶10稀釋，直至稀釋到107倍。③觀察腺病毒轉(zhuǎn)染對細胞生長狀態(tài)的影響：從孵箱中取出96孔板，在顯微鏡下確定每孔的細胞均生長良好；吸棄舊培養(yǎng)液，然后以此將上述不同稀釋度的病毒液加入到96孔板中，每種稀釋度的病毒取100 μl加入到96孔板中，未加入病毒的細胞孔中加入同樣量的完全培養(yǎng)基作為對照組。8～12 h后觀察細胞狀態(tài)，如果細胞狀態(tài)與未感染組無明顯差異，表明該病毒對細胞沒有明顯毒性作用，可繼續(xù)培養(yǎng)。④顯微鏡下觀察腺病毒轉(zhuǎn)染情況：腺病毒感染細胞速度快，分別在感染后12、24、48 h觀察細胞中熒光表達情況，根據(jù)細胞的生長狀況、熒光表達情況綜合判斷病毒在哪個稀釋度下作用效果最好，并以此稀釋度下的病毒濃度作為后繼實驗的依據(jù)。⑤轉(zhuǎn)染步驟：將HUVECs均勻接種于3.5 cm的培養(yǎng)皿，待細胞長至40%～50%融合時，分別更換含上述確定的最佳稀釋度的腺病毒的基礎培養(yǎng)基1 ml，繼續(xù)培養(yǎng)24～48 h后，吸去培養(yǎng)基，PBS洗1～2遍，更換新鮮無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后進行后續(xù)實驗。將細胞以合適的細胞數(shù)接種在3.5 cm的培養(yǎng)皿上，按照上述腺病毒轉(zhuǎn)染方法在HUVECs中轉(zhuǎn)染PAR1基因過表達腺病毒，通過Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.4PAR1抑制劑SCH及激動劑TF及DMSO的處理取對數(shù)生長期細胞，按2×105個/孔密度鋪入可拆卸35 mm小皿，待細胞長至90%融合時，取儲存濃度為10 μmol/L的SCH 5 μl加入1 ml無血清DMEM-F12，使終濃度為50 nmol/L，棄去舊培養(yǎng)基，將配制好的試劑加入細胞中，培養(yǎng)0.5 h后進行后續(xù)實驗；取儲存濃度為8 mmol/L的TF 6.25 μl 加入1 ml無血清DMEM-F12，使其終濃度為25μmol/L，棄去舊培養(yǎng)基，將配制好的試劑加入細胞中，培養(yǎng)0.5 h后進行后續(xù)實驗；設置DMSO組為對照，取1 μl 加入細胞培養(yǎng)基中，培養(yǎng)0.5 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.5HUVECs熱打擊取對數(shù)生長期細胞，按2×105個/孔密度鋪入可拆卸35 mm小皿，培養(yǎng)6 h貼壁后，更換無血清DMEM培養(yǎng)過夜后，更換DMEM完全培養(yǎng)液，將細胞分為兩組，給予相應刺激，每個獨立實驗重復3次：對照組細胞置于標準37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中同其余各組等時間培養(yǎng)；42 ℃熱打擊組細胞置于42 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，后置于37 ℃、5 % CO2孵箱分別培養(yǎng)0、2、6、12 h。

1.2.6蛋白質(zhì)免疫印跡試驗（Western blot）檢測PAR1、Mcl-1、Bax、Caspase 3、Cleaved-Caspase 3、GAPDH蛋白表達BCA 法定量，十二烷基硫酸鈉 - 聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用5%封閉液室溫封閉 2 h，加入PAR1、Mcl-1、Bax、Caspase3、Cleaved-Caspase 3、GAPDH 抗體（1∶1 000一抗），4 ℃過夜，含吐溫20的TBST洗3次后，加入結合辣根過氧化物酶標記的羊抗兔（1∶5 000）二抗室溫孵育2 h，用ECL顯影液進行反應、曝光。結果以待測蛋白與內(nèi)參GAPDH的灰度值比值表示。

1.2.7流式細胞儀檢測細胞凋亡42 ℃熱打擊2 h再將標準培養(yǎng) 8 h的HUVECs及正常對照組標準培養(yǎng)8 h的細胞收集至2 ml EP管中，1 000 r/min 離心5 min，每管加入500 μl 1 ×緩沖液 ，按照凋亡檢測試劑盒說明書，每個EP管分別加5 μl異硫氰酸熒光素（FITC）標記的 Annexin V和10 μl碘化丙啶（PI），避光混勻，放置室溫搖床避光15 min后用流式細胞計數(shù)儀檢測早期細胞凋亡。

1.3統(tǒng)計學處理所有實驗均重復3次以上，數(shù)據(jù)以表示，統(tǒng)計由SPSS17.0軟件完成，多重比較采用單因素方差分析，兩組比較應用t檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2　結　果

2.1熱打擊HUVECs后Mcl-1、Bax蛋白的表達增加，Caspase3、Cleaved-Caspase3活化與正常對照組比較，熱打擊后早期Mcl-1的表達顯著增多，復溫12 h后其表達恢復至正常水平；熱打擊后Bax表達顯著增多，并在復溫12 h達到峰值；熱打擊組Caspase 3及Cleaved-Caspase3較正常組活化。見圖1。

2.2蛋白測定顯示，抑制PAR1可減輕熱打擊致HUVECs凋亡，激動PAR1可加重熱打擊致HUVECs凋亡分別采用DMSO、PAR1抑制劑SCH、PAR1siRNA及PAR1激動劑TF、PAR1腺病毒過表達預處理HUVECs后，42 ℃熱打擊2 h，于8 h后提取總蛋白，Western blot檢測PAR1、Mcl-1、Bax、Cleaved-Caspase 3蛋白水平。與DMSO熱打擊組比較，PAR1抑制劑聯(lián)合熱打擊組Mcl-1表達水平增加，PAR1激動劑組Mcl-1表達水平明顯降低；與DMSO常溫組及PAR1抑制劑常溫組比較，PAR1激動劑常溫組Bax表達水平顯著增高；與DMSO熱打擊組及PAR1抑制劑熱打擊組比較，PAR1激動劑熱打擊組Bax水平顯著增加。與NCsiRNA熱打擊組比較，PAR1siRNA聯(lián)合熱打擊Mcl-1表達水平顯著增加，Bax表達水平顯著減少，Cleavesd-Caspase3活化水平降低；與Ad-empty熱打擊組比較，Ad-PAR1聯(lián)合熱打擊組Mcl-1表達水平顯著降低，Bax表達水平明顯增加，Cleavesd-Caspase3活化水平增強。綜上所述：抑制PAR1的表達及PAR1siRNA可抑制細胞凋亡，激活PAR1或采用腺病毒使PAR1過表達可促使細胞發(fā)生凋亡。見圖2～4。

圖1　42 ℃熱打擊對HUVECs的Mcl-1、Bax、Caspase 3及Cleaved-Caspase 3蛋白表達水平的影響

圖2　PAR1激動劑和抑制劑對熱打擊HUVECs表達Mcl-1和Bax水平的影響

2.3流式細胞儀檢測結果顯示抑制PAR1可減少熱打擊致HUVECs早期凋亡，激活PAR1可加重熱打擊致HUVECs早期凋亡與DMSO熱打擊組比較，PAR1抑制劑聯(lián)合熱打擊組細胞早期凋亡數(shù)目明顯減少，PAR1激動劑聯(lián)合熱打擊組細胞早期凋亡數(shù)目明顯增多。綜上所述：抑制PAR1的表達可抑制細胞早期凋亡，激活PAR1加重細胞早期凋亡。見圖5和圖6。

2.4流式細胞儀檢測結果顯示，PAR1siRNA可減少熱打擊致HUVECs早期凋亡，PAR1腺病毒可加重熱打擊致HUVECs早期凋亡與NCsiRNA聯(lián)合熱打擊組比較，PAR1siRNA聯(lián)合熱打擊組細胞早期凋亡數(shù)目明顯減少；與Adempty聯(lián)合熱打擊組比較，Ad-PAR1聯(lián)合熱打擊組細胞早期凋亡數(shù)目明顯增多。見圖7和圖8。綜上所述，熱打擊后PAR1表達增多起著促凋亡作用。

圖3　PAR1siRNA轉(zhuǎn)染（A）和PAR1腺病毒轉(zhuǎn)染（B）對熱打擊HUVECs的PAR1、 Mcl-1、Bax、Cleaved-Caspase3蛋白表達水平的影響

圖4　PAR1siRNA、PAR1腺病毒轉(zhuǎn)染及PAR1抑制劑和激動劑處理對HUVECs熱打擊后Mcl-1/Bax的影響

圖5　PAR1抑制劑及激動劑對熱打擊后HUVECs早期細胞凋亡的影響

圖6　PAR1抑制劑及激動劑作用后熱打擊HUVECs早期細胞凋亡的流式細胞分析結果

圖7　PAR1敲除及腺病毒過表達對熱打擊HUVECs早期細胞凋亡的影響的流式細胞分析結果

圖8　PAR1siRNA和Ad-PAR1處理后HUVECs的 PAR1表達

3　討　論

重癥中暑時，高熱刺激可誘導細胞凋亡，這在其病理生理過程中起著不可忽視的作用。研究表明細胞凋亡是重癥中暑血管內(nèi)皮損傷的重要發(fā)病機制［3-4，8-9］。凋亡是機體在進化過程中形成的一種保守的死亡途徑，細胞凋亡時通常伴隨抗凋亡及促凋亡基因及相關蛋白的同時存在。細胞凋亡是中暑細胞死亡的主要方式，研究表明熱打擊可導致細胞發(fā)生凋亡［7，10］。

Bcl-2 是一個多基因家族，按其功能分為兩類：抑制細胞凋亡和促進細胞凋亡。Mcl-1作為Bcl-2家族的一個抗凋亡成員，是唯一含有增殖細胞核抗原（PCNA）結構的蛋白分子，其在細胞凋亡調(diào)控中處于凋亡信號傳導的上游，調(diào)節(jié)導致細胞色素 C釋放的早期級聯(lián)反應。Bax是Bcl-2家族中最具代表性的促進細胞凋亡基因，是線粒體外膜通透性改變的關鍵蛋白。Caspase3作為Caspase家族中的一員，是凋亡機制的核心成分、直接誘導細胞凋亡最重要效應蛋白酶之一及凋亡的主要執(zhí)行者，其一旦活化，凋亡不可避免［10-12］。

PAR1 是G蛋白偶聯(lián)的血管受體，廣泛分布在血管內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、巨噬細胞、成纖維細胞等細胞膜上［5］。在腫瘤領域研究較多，有研究表明在腫瘤細胞PAR1可通過增加促凋亡蛋白Bax、Caspase3的表達及下調(diào)內(nèi)皮細胞血管生長因子的表達而促使細胞發(fā)生凋亡［13］。目前關于PAR1的激活介導細胞凋亡的機制包括：PAR1激活導致細胞屏障功能破壞、通透性增加［6］；通過激活JNK、p38信號通路促使細胞發(fā)生凋亡［14］；通過NF-κB信號轉(zhuǎn)導機制及Bcl-XL機制介導細胞凋亡［15］。另有研究表明，PAR1激動劑可促使運動神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞發(fā)生凋亡，而抑制人單核細胞、成肌細胞、腸上皮細胞發(fā)生凋亡［16］。

Bcl-2/Bax比值對決定細胞是否進入凋亡狀態(tài)有重要意義。本研究從PAR1的活化水平及表達水平兩個方面研究其對凋亡蛋白的影響，對HUVECs采用PAR1抑制劑SCH及PAR1siRNA降低PAR1活化水平及蛋白表達水平，在給予熱打擊后PAR1可通過調(diào)節(jié)凋亡上游信號蛋白Mcl-1及主要促凋亡蛋白Bax表達從而降低細胞凋亡；采用PAR1激動劑TF及PAR1腺病毒使其活化或過表達，在熱打擊后加重了細胞凋亡，且PAR1siRNA熱打擊組與PAR1抑制劑熱打擊組比較，Mcl-1/Bax蛋白比值明顯升高，而在Ad-PAR1熱打擊組和PAR1激動劑熱打擊組，Mcl-1/Bax蛋白比值無明顯差別。結合前期研究可見，熱打擊可使PAR1表達水平增加［6］，其介導了下游促凋亡蛋白Bax表達增加及抗凋亡蛋白Mcl-1表達抑制，使Caspase 3活化水平增加，最終導致細胞凋亡。以往研究表明，當PAR1活化后，Bax表達水平增高［17］，這在本研究中也得到證明。PAR1通過調(diào)節(jié)Mcl-1及Bax表達水平參與熱打擊致HUVECs發(fā)生凋亡，其具體信號轉(zhuǎn)導機制有待進一步研究。本研究將有助于進一步了解重癥中暑的凋亡信號轉(zhuǎn)導機制，對重癥中暑的防治有指導意義。

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Early apoptosis of human umbilical vein endothelial cells resulting from heat stress mediated by proteaseactivated receptor 1 through regulating the expressions of Mcl-1 and Bax

Wang Zhenglian*， Xu Qiulin， Liu Ya'nan ， Zhou Gengbiao， Liu Yunsong， Qiu Junming， Su Lei.
Department of Critical Care Medicine， Guangzhou General Hospital of Guangzhou Command ，Guangzhou 510010 ， Guangdong， China； *Guangzhou University of Chinese Medicine， Guangzhou 510403， Guangdong， China Correspondingauthor : Su Lei（ E-mail : slei _ icu@163.com ）

Objective: To observe the effect of proteinase-activated receptor 1 （PAR1） on regulation of Mcl-1 and Bax expression and early apoptosis of human umbilical vein endothelial cells （HUVECs） after heat stress for making clear the role of PAR1 in the apoptosis of HUVECs induced by heat stress. Methods: HUVECs were pretreated with PAR1 inhibitor SCH， PAR1 agonist TFLLR-NH2（TF）， PRA1siRNA and PAR1 adenovirus respectively and then received heat stress（42℃）for 2 hours. After 8 hours， the total protein was extracted ， the protein expressions of Mcl-1， Bax， caspase 3 and cleaved-caspase 3 were detected， and early apoptosis of the cells was determined by flow cytometry for all the groups. Results: Compared to the normal control group， expressions of Mcl-1， Bax and caspase 3 increased after heat stress， with activation of cleaved-caspase 3 （P＜0.05）. Compard to the heat stress group，expression of Mcl-1 was up-regulated and Bax down-regulated in the groups of PAR1 inhibitor or PAR1siRNA combined with heat stress （P＜0.05）， while the activation of cleaved-caspase 3 weakened and the number of early apoptotic cells reduced （P＜0.05 or P＜0.01）. Otherwise， increasing PAR1 expression and PAR1 adenovirus-pretreated combined with heat stress lead to the increase of Bax expression （P＜0.05）， decrease of Mcl-1 expression （P＜0.05），activation of cleaved-caspase-3 and increase in number of apoptotic cells （P＜0.05 or P＜0.01）. Conclusions: Heat stress inducesapoptosis of HUVECs， at the same time the expression of apoptosis-related protein Mcl-1 and Bax could increase. PAR1 plays an important role in promoting apoptosis by regulating expressions of Mcl-1 and Bax.Study on the mechanisms of PAR1 mediating endothelial cell apoptosis contributes to further revealing of the pathological process of endothelial cells in heat stress and also provides a theoretical basis for clinical prevention and treatment of heatstroke.

Heat sress；Human umbilical vein endothelial cells；Apoptosis；Protease-activated receptor 1；Mcl-1；Bax

10. 3969/j. issn. 1672-8521. 2016. 02. 001

2016-02-20）

廣東省自然科學基金博士啟動項目（S2013040015661）；中國博士后科學基金（2014M552180）

蘇磊，主任醫(yī)師（E-mail:slei_icu@163.com）