上調(diào)miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞AGS增殖和凋亡的影響

余鈞輝，孫學(xué)軍，鄭見寶，王孝瓏，魏光兵，高　琪，王　愷

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，陜西西安　710061)

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◇基礎(chǔ)研究◇

上調(diào)miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞AGS增殖和凋亡的影響

余鈞輝，孫學(xué)軍，鄭見寶，王孝瓏，魏光兵，高琪，王愷

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院普通外科，陜西西安710061)

目的探討miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、周期及凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)5種胃癌細(xì)胞及人胃黏膜細(xì)胞系GES-1中miR-181a的表達(dá)情況，以及胃癌細(xì)胞AGS瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-181amimic后miR-181a的表達(dá)情況；MTT法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)上調(diào)miR-181a表達(dá)對(duì)胃癌細(xì)胞AGS增殖、周期和凋亡等生物學(xué)行為的影響；Westernblot檢測(cè)上調(diào)miR-181a后細(xì)胞周期調(diào)控蛋白(CDC25A、cyclinA2、cyclinD1、p21)和凋亡相關(guān)蛋白(Bcl-2和Bax)的表達(dá)變化。結(jié)果與人胃黏膜細(xì)胞系GES-1比較，miR-181a在人胃癌細(xì)胞株SGC-7901和MKN28表達(dá)升高(P均<0.01)，在MGC-803、BGC-823、AGS表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-181amimic后，胃癌細(xì)胞AGS中miR-181a的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR-181amimics后AGS細(xì)胞增殖明顯，G0/G1期細(xì)胞減少，S期細(xì)胞明顯增多，細(xì)胞凋亡明顯減弱(P均<0.05)。Westernblot結(jié)果顯示，上調(diào)miR-181a后胃癌細(xì)胞AGS中CDC25A、cyclinA2和Bcl-2表達(dá)升高(P均<0.05)，cyclinD1和p21表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，Bax表達(dá)降低(P<0.05)。結(jié)論上調(diào)miR-181a可以促進(jìn)胃癌細(xì)胞AGS增殖，其作用機(jī)制可能與CDC25A、CyclinA2表達(dá)升高有關(guān)；上調(diào)miR-181a可抑制胃癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制可能與Bcl-2表達(dá)升高及Bax表達(dá)降低有關(guān)。

miR-181a；胃癌；增殖；凋亡；細(xì)胞周期

胃癌是最為常見的消化道腫瘤之一，全球的胃癌發(fā)病率達(dá)到第四位，并且在腫瘤相關(guān)的死亡中位列第二[1]。microRNA(miRNA,miR)是一類19～25個(gè)核苷酸大小的內(nèi)源非編碼小分子RNA，是真核生物中廣泛存在的一類重要的調(diào)控分子，通過(guò)與靶基因信使RNA(mRNA)的3′非編碼區(qū)(3′-UTR)特異性的堿基配對(duì)引起mRNA的降解或翻譯抑制，從而發(fā)揮對(duì)靶基因的轉(zhuǎn)錄后沉默作用[2]。生物學(xué)分析認(rèn)為，miRNA調(diào)控著人類大約30%的基因，參與調(diào)控包括分化、增殖以及凋亡等多個(gè)細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程[3]。因此，miRNA的表達(dá)失調(diào)與腫瘤等疾病密切相關(guān)。目前的研究顯示，所有的實(shí)體腫瘤中都存在miRNA表達(dá)譜的顯著差異，而這些差異表達(dá)的miRNA有望成為癌癥治療的新靶點(diǎn)[4]。miR-181a是miR-181家族成員之一，在多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。本課題組前期的工作已經(jīng)證實(shí)miR-181a在胃癌組織中高表達(dá)，為了進(jìn)一步探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，本研究采用miR-181amimics上調(diào)人胃癌細(xì)胞AGS中miR-181a的表達(dá)，檢測(cè)其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的影響，探討可能的作用機(jī)制。

1　材料與方法

1.1主要試劑和儀器Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit(ThermoScientific公司)；Real-timePCR(日本TaKaRa公司)；Real-timePCR檢測(cè)儀(美國(guó)Bio-Rad公司，CFX96TMReal-timePCRDetectionSystem)；miR-181a、U6引物由廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成；RPMI-1640培養(yǎng)基(美國(guó)Corning公司)；胎牛血清(法國(guó)Biowest公司)；LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn)染試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；OPTI-MEN(美國(guó)Gibco公司)；AnnexinV-FITC試劑盒(美國(guó)BD公司)；MTT(美國(guó)Sigma公司)；miR-181amimics及NegativeControl(NC)(上海吉瑪公司)；CDC25A、cyclinA2、cyclinD1和GAPDH抗體(美國(guó)SantaCruz公司)，Bcl-2和Bax(美國(guó)Abcam公司)；凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)GES-1、SGC-7901、MGC-803、AGS、BGC-823和MKN28為本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期保存，采用RPMI1640培養(yǎng)基(含100mL/L胎牛血清)，于37 ℃、50mL/LCO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每天觀察并更換細(xì)胞培養(yǎng)液1次，待細(xì)胞長(zhǎng)滿約80%時(shí)，用2.5g/L胰蛋白酶消化傳代，取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3總RNA提取及Real-timePCR用Trizol試劑按照操作說(shuō)明書，分別提取人胃黏膜細(xì)胞系GES-1和5株胃癌細(xì)胞的總RNA，各取2μgRNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，行Real-timePCR。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性30s；然后按95 ℃ 5s，60 ℃ 30s進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。以每個(gè)樣本的U6作為內(nèi)參，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-△△Ct方法進(jìn)行計(jì)算分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC-7901細(xì)胞按2×104個(gè)接種于6孔板，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)分組，實(shí)驗(yàn)組(轉(zhuǎn)染miR-181amimics)、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染negativecontrol)和空白對(duì)照組(untreatedcell，只加轉(zhuǎn)染試劑)。用250μLOPTI-MEN稀釋LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑5μL，室溫下靜置5min，再用250μLOPTI-MEN稀釋miR-181amimics或negativecontrol5μL，兩者混合室溫下靜置20min，每孔加入500μL中的轉(zhuǎn)染復(fù)合液，在50mL/LCO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育4～6h，用新鮮的完全培養(yǎng)基(含血清)替換含有轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，供后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖將胃癌細(xì)胞按照5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，按1.4項(xiàng)隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔；未接種細(xì)胞的孔中加入RPMI1640培養(yǎng)基作為調(diào)零孔。接種后24、48、72、96h各檢測(cè)1次，每孔加入MTT20μL繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育4h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其490nm處吸光度(A)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期按2×105個(gè)/孔接種胃癌細(xì)胞于6孔板中，按1.4項(xiàng)分組為實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，轉(zhuǎn)染48h換為無(wú)血清培養(yǎng)基，24h后再換成含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，用胰酶消化收集各組細(xì)胞，并用預(yù)冷PBS洗滌3次，1 000r/min，5min/次，棄上清。加入―20 ℃ 預(yù)冷的750mL/L冰乙醇1mL固定細(xì)胞，置于4 ℃冰箱過(guò)夜。檢測(cè)前離心(1 000r/min，5min)，PBS洗滌2次；加入100μLPBS并將細(xì)胞吹懸；用含0.1g/LRNase和5g/L碘化丙錠(PI)4 ℃處理細(xì)胞20min。過(guò)300目尼龍網(wǎng)。送流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7AnnexinV-FITC染色檢測(cè)凋亡胃癌細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板并按1.4項(xiàng)分組，轉(zhuǎn)染后24h按照AnnexinV-FITC試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色，并在1h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8Westernblot檢測(cè)CDC25A、cyclinA2、cyclinD1、p21、Bcl-2及Bax的表達(dá)胃癌細(xì)胞按2×105個(gè)/孔接種于6孔板并按1.4項(xiàng)分組，轉(zhuǎn)染72h后收集各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白并用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度，每組樣本取10μL進(jìn)行100g/LSDS-PAGE垂直電泳，濕轉(zhuǎn)法將膠中蛋白水平轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，50g/L脫脂牛奶在37 ℃搖床上封閉1h，先后分別加入TBST稀釋后的一抗(4 ℃過(guò)夜)、二抗，經(jīng)ECL顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描，采用相關(guān)圖像分析軟件(Bio-radQuantityOne,CA)進(jìn)行條帶灰度分析。GAPDH作為參照蛋白。

2　結(jié)　　果

2.1人胃黏膜細(xì)胞系和胃癌細(xì)胞的miR-181a表達(dá)變化與人胃黏膜細(xì)胞系GES-1組比較，人胃癌細(xì)胞MKN28和SGC-7901中miR-181a相對(duì)高表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.01)，而MGC-803、BGC-823、AGS等胃癌細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)與GES-1細(xì)胞相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，圖1)。后續(xù)功能學(xué)研究選用miR-181a表達(dá)較低的胃癌細(xì)胞AGS為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞，采用miR-181amimics上調(diào)其miR-181a表達(dá)。

圖1人胃黏膜細(xì)胞系GES-1及5種人胃癌細(xì)胞中miR-181a的表達(dá)

Fig.1ExpressionofmiR-181ainfivegastriccancercelllinesandnormalgastriccancercelllineGES-1

2.2轉(zhuǎn)染24h后miR-181a的表達(dá)變化胃癌細(xì)胞AGS轉(zhuǎn)染miR-181amimics后，miR-181a的表達(dá)較陰性對(duì)照組顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖2)。

圖2胃癌細(xì)胞株AGS轉(zhuǎn)染miR-181amimics24h后miR-181a的表達(dá)

Fig.2ExpressionofmiR-181aingastriccancercellAGSaftertransfectionwithmiR-181amimics

2.3miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，胃癌細(xì)胞AGS轉(zhuǎn)染miR-181amimics后24、48、72h的生長(zhǎng)速度相對(duì)陰性對(duì)照組，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)，96h生長(zhǎng)速度明顯增快，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖3)。

圖3胃癌細(xì)胞AGS轉(zhuǎn)染miR-181amimics后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

Fig.3CellgrowthcurvesofgastriccancercellAGSaftertransfectionwithmiR-181amimics

2.4miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞周期的影響流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，人胃癌細(xì)胞AGS轉(zhuǎn)染miR-181amimics組的G0/G1期細(xì)胞比例較陰性對(duì)照組明顯減少(P<0.05)，S期細(xì)胞比例增多(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞比例差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P>0.05)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖4、表1)。

圖4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)胃癌細(xì)胞AGS轉(zhuǎn)染miR-181amimics時(shí)的細(xì)胞周期變化

Fig.4CellcycledistributionofgastriccancercellAGSaftertransfectionwithmiR-181amimicsdetectedbyflowcytometry

A：miR-181amimics(轉(zhuǎn)染組)；B：Negativecontrol(陰性對(duì)照組)；C：Untreatedcell(空白對(duì)照組)。

表1胃癌細(xì)胞AGS轉(zhuǎn)染miR-181amimics時(shí)細(xì)胞周期時(shí)相的分布

Tab.1　Cell cycle distribution of gastric cancer cell AGS after transfection with miR-181a mimics(%, ±s)

與陰性對(duì)照組比較，*P<0.05；與空白對(duì)照組比較，#P<0.05。2.5miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響轉(zhuǎn)染miR-181amimics的人胃癌細(xì)胞AGS的凋亡比例較陰性對(duì)照組減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖5)。

圖5流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組AGS細(xì)胞凋亡的結(jié)果(A、B、C)及凋亡率的比較(D)

Fig.5ApoptosisineachgroupofAGScellsdetectedbyflowcytometryandcomparisonofapoptosisratesamonggroups

A、B、C：分別為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組；D：1～3分別為轉(zhuǎn)染組、陰性對(duì)照組、空白對(duì)照組。

2.6miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響AGS細(xì)胞miR-181amimics轉(zhuǎn)染組的CDC25A、cyclinA2 表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯升高(P<0.05)，cyclinD1 及p21表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖6)。

2.7miR-181a對(duì)胃癌細(xì)胞Bcl-2及Bax表達(dá)的影響AGS細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-181amimics組的抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)較陰性對(duì)照組明顯升高，凋亡蛋白Bax表達(dá)降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，圖7)。

3　討　　論

胃癌的發(fā)生發(fā)展涉及到多種癌基因、抑癌基因、凋亡調(diào)節(jié)基因等的異常表達(dá)，是一個(gè)復(fù)雜的病變過(guò)程[5]。miRNA作為新的研究切入點(diǎn)，為癌癥的診斷與治療開辟了一條新途徑。研究表明，胃癌組織中存在著差異表達(dá)的miRNA，可能與細(xì)胞增殖、凋亡的調(diào)控及癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性相關(guān)，理解這些miRNA有助于為胃癌的診斷和監(jiān)測(cè)提供新的潛在分子靶標(biāo)[6-7]。

miR-181a是近年來(lái)受到眾多關(guān)注的miRNA之一，家族成員包括已知的miR-181a、miR-181b、miR-181c及miR-181d等4個(gè)成熟序列。其中，miR-181a是miR-181家族的重要成員，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。miR-181a在乳腺癌[8]、肝癌[9]和頭頸部腫瘤[10]表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮著癌基因的作用，而在膠質(zhì)瘤[11]、結(jié)腸癌[12]中miR-181a表達(dá)下調(diào)，發(fā)揮抑癌基因的作用。此外，miR-181a參與腫瘤細(xì)胞增殖[13]、凋亡[14]及耐藥性[15]等生物學(xué)行為過(guò)程。然而，miR-181a在胃癌中的研究較少且存在爭(zhēng)議。本課題組前期工作采用Real-timePCR檢測(cè)了miR-181a在42例胃癌組織及配對(duì)的正常組織的表達(dá)情況，證實(shí)miR-181a在胃癌組織中高表達(dá)，但是對(duì)胃癌的細(xì)胞生物學(xué)行為的影響以及具體的作用機(jī)制，目前仍未見闡明。

圖6AGS各組細(xì)胞CDC25A、cyclinA2、p21及cyclinD1的表達(dá)變化

Fig.6ProteinexpressionsofCDC25A,cyclinA2,p21andcyclinD1ineachgroupofAGScells

A：Westernblot條帶；1：轉(zhuǎn)染組；2：陰性對(duì)照組；3：空白對(duì)照組；B：各組細(xì)胞周期蛋白表達(dá)量的比較。

圖7AGS各組細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的變化

Fig.7ProteinexpressionsofBcl-2andBaxineachgroupofAGScells

A：Westernblot條帶；1：轉(zhuǎn)染組；2：陰性對(duì)照組；3：空白對(duì)照組。B：蛋白表達(dá)結(jié)果的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

本研究上調(diào)miR-181a表達(dá)并觀察其對(duì)胃癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響并探討可能的作用機(jī)制。MTT結(jié)果顯示，上調(diào)miR-181a具有促進(jìn)胃癌細(xì)胞AGS增殖的作用；細(xì)胞周期結(jié)果表明，上調(diào)miR-181a時(shí)，G0/G1期細(xì)胞比例明顯減少，S期細(xì)胞比例增多。這提示miR-181a促進(jìn)胃癌細(xì)胞AGS增殖及G1/S期轉(zhuǎn)化。ZHANG等[16]采用MTT和軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示上調(diào)miR-181a可促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖。

本研究進(jìn)一步采用Westernblot檢測(cè)了4個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子。CDC25A是細(xì)胞分裂周期基因CDC25 (celldivisioncycle25)家族中最為重要的成員，CDC25A對(duì)于G1/S、G2/M期轉(zhuǎn)換至關(guān)重要。CDC25A通過(guò)對(duì)細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2-細(xì)胞周期素E復(fù)合物(CDK2-cyclinE)和CDK2-cyclinA的去磷酸化作用而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入S期。因此，CDC25A高表達(dá)可加速G1/S期的轉(zhuǎn)化，下調(diào)其表達(dá)則會(huì)導(dǎo)致S期的阻滯[17]。本研究結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染了miR-181amimics的AGS細(xì)胞的CDC25A、cyclinA2表達(dá)明顯升高。提示miR-181a可能通過(guò)CDC25A、cyclinA2通路促進(jìn)胃癌細(xì)胞G1/S期轉(zhuǎn)化。抑癌基因p21是一個(gè)廣譜的細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑和細(xì)胞周期的負(fù)調(diào)控因子，具有阻止細(xì)胞通過(guò)G1/S期的作用；癌基因cyclinD1參與G1/S期轉(zhuǎn)換的調(diào)控，是細(xì)胞周期重要的正性調(diào)控因子。ZHU等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-181a可通過(guò)p21的表達(dá)促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞MG63增殖。本研究上調(diào)miR-181a時(shí)，p21和cyclinD1的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示miR-181a可能通過(guò)不同的信號(hào)途徑參與不同腫瘤細(xì)胞增殖的調(diào)控。

miR-181a是調(diào)節(jié)多種腫瘤細(xì)胞凋亡的重要因子。JIAO等[19]研究發(fā)現(xiàn)，乳腺癌耐藥株MCF-7/MX的miR-181a表達(dá)較親本MCF-7細(xì)胞株下調(diào)，而上調(diào)miR-181a表達(dá)可增加MCF-7/MX對(duì)抗腫瘤藥物米托蒽醌(mitoxantrone)的敏感性；還證實(shí)miR-181a通過(guò)調(diào)節(jié)乳腺癌耐藥蛋白(BRCP)表達(dá)而影響腫瘤藥物的耐藥性。Bcl-2和Bax是Bcl-2家族的兩個(gè)關(guān)鍵成員，Bax和Bcl-2通過(guò)形成同源或異源二聚體調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡：當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)則抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，上調(diào)胃癌細(xì)胞miR-181a時(shí)，凋亡比例降低，Westernblot結(jié)果可見Bcl-2表達(dá)升高，Bax降低。這提示miR-181a可能抑制Bax同源二聚體形成和促進(jìn)Bax/Bcl-2異源二聚體形成而抑制細(xì)胞凋亡，這與ZHU[17]在骨肉瘤中的miR-181a研究結(jié)論一致，但具體機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

研究表明血清中特異性表達(dá)的miRNA有望成為胃癌診斷及預(yù)后的監(jiān)測(cè)指標(biāo)。WANG等[20]發(fā)現(xiàn)，血清中miR-17-5p/20a的表達(dá)水平與胃癌的分化程度及TNM分期密切相關(guān)，生存曲線分析發(fā)現(xiàn)高表達(dá)的miR-17-5p/20a往往預(yù)示著不良的預(yù)后，提示miR-17-5p/20a有望成為判斷胃癌進(jìn)展程度及預(yù)后的良好的標(biāo)志物。GUO等[21]發(fā)現(xiàn)，血清中miR-181a診斷乳腺癌的靈敏度及特異度達(dá)到70.7%和59.9%，遠(yuǎn)高于傳統(tǒng)的乳腺癌診斷標(biāo)志物CA153和CEA，預(yù)示著miR-181a具有成為乳腺癌診斷標(biāo)志物的潛力。血清miRNA檢測(cè)具有無(wú)創(chuàng)性、穩(wěn)定性好、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，具備成為理想腫瘤標(biāo)記物的條件。本課題組前期的研究表明miR-181a在胃癌組織中高表達(dá)，提示miR-181a有可能成為胃癌的診斷的新一代標(biāo)志物。目前仍未有血清中miR-181a與胃癌研究的報(bào)道，這也是本課題今后研究的一個(gè)方向。

綜上所述，上調(diào)miR-181a能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞的增殖活性，抑制胃癌凋亡，提示miR-181a在胃癌中可能扮演致癌基因的角色，這與其在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)時(shí)的生物作用一致。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將通過(guò)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)尋找miR-181a的靶蛋白，為胃癌的發(fā)生機(jī)制及臨床生物治療提供新的靶點(diǎn)。

[1]JEMALA,BRAYF,CENTERMM,etal.Globalcancerstatistics[J].CACancerJClin, 2011, 61(2):69-90.

[2]BARTELDP.MicroRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,andfunction[J].Cell, 2004, 116(2):281-297.

[3]YUZ,JIANZ,SHENSH,etal.GlobalanalysisofmicroRNAtargetgeneexpressionrevealsthatmiRNAtargetsarelowerexpressedinmaturemouseandDrosophilatissuesthanintheembryos[J].NucleicAcidsRes, 2007, 35(1):152-164.

[4]LANH,LUH,WANGX,etal.MicroRNAsaspotentialbiomarkersincancer:opportunitiesandchallenges[J].BioMedResInt, 2015, 2015:125094.

[5]TAMURAG.Alterationsoftumorsuppressorandtumor-relatedgenesinthedevelopmentandprogressionofgastriccancer[J].WorldJGastroenterol, 2006, 12(2):192-198.

[6]KIMCH,KIMHK,RETTIGRL,etal.miRNAsignatureassociatedwithoutcomeofgastriccancerpatientsfollowingchemotherapy[J].BMCMedGenomics, 2011, 4:79.

[7]UEDAT,VOLINIAS,OKUMURAH,etal.RelationbetweenmicroRNAexpressionandprogressionandprognosisofgastriccancer:amicroRNAexpressionanalysis[J].LancetOncol, 2010, 11(2):136-146.

[8]TAYLORMA,SOSSEY-ALAOUIK,THOMPSONCL,etal.TGF-betaupregulatesmiR-181aexpressiontopromotebreastcancermetastasis[J].JClinInvest, 2013, 123(1):150-163.

[9]MENGF,GLASERSS,FRANCISH,etal.FunctionalanalysisofmicroRNAsinhumanhepatocellularcancerstemcells[J].JCellMolMed, 2012, 16(1):160-173.

[10]NURUL-SYAKIMAAM,YOKE-KQUEENC,SABARIAHAR,etal.DifferentialmicroRNAexpressionandidentificationofputativemiRNAtargetsandpathwaysinheadandneckcancers[J].IntJMolMed, 2011, 28(3):327-336.

[11]SHIL,CHENGZ,ZHANGJ,etal.hsa-mir-181aandhsa-mir-181bfunctionastumorsuppressorsinhumangliomacells[J].BrainRes, 2008, 1236:185-193.

[12]LIY,KUSCUC,BANACHA,etal.miR-181a-5pinhibitscancercellmigrationandangiogenesisviadownregulationofmatrixmetalloproteinase-14[J].CancerRes, 2015, 75(13):2674-2685.

[13]FEIJ,LIY,ZHUX,etal.miR-181apost-transcriptionallydownregulatesoncogenicRalAandcontributestogrowthinhibitionandapoptosisinchronicmyelogenousleukemia(CML)[J].PLoSOne, 2012, 7(3):e32834.

[14]KEG,LIANGL,YANGJM,etal.MiR-181aconfersresistanceofcervicalcancertoradiationtherapythroughtargetingthepro-apoptoticPRKCDgene[J].Oncogene, 2013, 32(25):3019-3027.

[15]LIH,HUIL,XUW.miR-181asensitizesamultidrug-resistantleukemiacelllineK562/A02todaunorubicinbytargetingBCL-2[J].ActaBiochimBiophysSin(Shanghai), 2012, 44(3):269-277.

[16]ZHANGX,NIEY,LIX,etal.MicroRNA-181afunctionsasanoncomiringastriccancerbytargetingthetumoursuppressorgeneATM[J].PatholOncolRes, 2014, 20(2):381-389.

[17]VERDUZCOD,DOVEYJS,SHUKLAAA,etal.MultipleisoformsofCDC25opposeATMactivitytomaintaincellproliferationduringvertebratedevelopment[J].MolCancerRes, 2012, 10(11):1451-1461.

[18]JIANWEIZ,FANL,XIANCHENGL,etal.MicroRNA181aimprovesproliferationandinvasion,suppressesapoptosisofosteosarcomacell[J].TumourBiol, 2013, 34(6):3331-3337.

[19]JIAOX,ZHAOL,MAM,etal.MiR-181aenhancesdrugsensitivityinmitoxantone-resistantbreastcancercellsbytargetingbreastcancerresistanceprotein(BCRP/ABCG2)[J].BreastCancerResTreat, 2013, 139(3):717-730.

[20]WANGM,GUH,WANGS,etal.CirculatingmiR-17-5pandmiR-20a:molecularmarkersforgastriccancer[J].MolMedRep, 2012, 5(6):1514-1520.

[21]GUOLJ,ZHANGQY.DecreasedserummiR-181aisapotentialnewtoolforbreastcancerscreening[J].IntJMolMed, 2012, 30(3):680-686.

(編輯國(guó)榮)

Influenceofup-regulationofmiR-181aexpressiononproliferationandapoptosisofgastriccancercellAGS

YUJun-hui,SUNXue-jun,ZHENGJian-bao,WANGXiao-long,WEIGuang-bing,GAOQi,WANGKai

(DepartmentofGeneralSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXi’anJiaotongUniversity,Xi’an710061,China)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofmiR-181aontheproliferationandapoptosisofgastriccancercellsanditspossiblemechanism.MethodsmiR-181aexpressionin5typesofgastriccancercellsandnormalgastricmucosalcelllineGES-1wasdetectedbyReal-timePCR.miR-181amimicswastransfectedtransientlyintogastriccancercelllineAGStoup-regulatetheexpressionofmiR-181a.Theinfluencesofup-regulationofmiR-181aoncellgrowth,cellcycleandapoptosiswereevaluatedbyMTTandflowcytometry.ProteinlevelsofCDC25A,cyclinA2,cyclinD1,p21,Bcl-2andBaxweredetectedbyWesternblot.ResultComparedwithGES-1,theexpressionlevelsofmiR-181aingastriccancercelllinesSGC-7901andMKN28weresignificantlyhigher(bothP<0.01),whilemiR-181ahadnosignificantdifferencesinMGC-803,BGC-823andAGS(allP>0.05).ThetransfectionofmiR-181amimicsup-regulatedmiR-181aexpressioninAGS(P<0.05).InAGScellaftertransfectionwithmiR-181aminics,theproliferativeabilitywasincreased,G0/G1phasecellratiowasdecreased,Sphasecellratiowasincreased,andapoptosisratewasreduced(allP<0.05).InmiR-181aup-regulatedAGScell,theproteinexpressionsofCDC25A,cyclinA2andBcl-2wasincreased,andtheexpressionofBaxwasdecreased(allP<0.05).ButtheexpressionsofcyclinD1andp21hadnostatisticaldifferences(bothP>0.05).ConclusionOverexpressionofmiR-181apromotescellgrowthandcellcycleinAGS;up-regulationofCDC25AandCyclinA2maybeoneofthemechanisms.OverexpressionofmiR-181ainhibitscellapoptosisinAGS,andup-regulationofBcl-2anddown-regulationofBaxmaybeinvolvedintheprocess.

miR-181a;gastriccancer;proliferation;apoptosis;cellcycle

2015-12-29

2016-03-30

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81101874；81172362)；陜西省科技統(tǒng)籌創(chuàng)新工程計(jì)劃資助項(xiàng)目(No.2013KTCQ03-08)

孫學(xué)軍.E-mail:sunxy@mail.xjtu.edu.cn

R735.2

A

10.7652/jdyxb201605008

SupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.81101874, 81172362)andtheCoordinatedandInnovativePlanProjectsofScienceandTechnologyofShaanxiProvince(No.2013KTCQ03-08)

優(yōu)先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20160803.1148.014.html(2016-08-03)