錫盟蒙古族傳統(tǒng)發(fā)酵馬乳中功能性特征肽段的研究

吳培涵，王雨晴，皇甫潔，陳亮，欒春光，王憬，裴疆森，劉文穎*，王德良1,*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052) 2(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京，100015) 3(北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京，100015)

馬乳自古以來就被認為是具有特殊的營養(yǎng)和治療功能的食品。當(dāng)今，在蒙古和俄羅斯的游牧民族聚集地區(qū)，以及在歐洲的一些地方越來越受歡迎。馬乳中含有豐富的多不飽和脂肪酸、維生素以及最接近人乳的組成比，且脂肪和膽固醇較低，具有較高的營養(yǎng)價值[1]。發(fā)酵后的馬乳乳糖含量降低，微生素含量上升，蛋白質(zhì)和脂肪等其他營養(yǎng)成分基本不變。同時，在發(fā)酵過程中乳酸菌、酵母菌等益生菌以及微生物代謝產(chǎn)物，如肽類、乳酸、醇類、芳香化合物和抗菌素等，使發(fā)酵馬乳具有特殊的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用[2]。俄羅斯和蒙古已將發(fā)酵馬乳用于消化道和心血管疾病的治療[3]。

發(fā)酵乳基中的小分子蛋白功能活性肽因具有促進激素調(diào)節(jié)、增強免疫、降血糖和降血壓等生理活性，一直以來都是生物活性肽的研究重點。該研究通過解析內(nèi)蒙古錫盟地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵馬乳的相應(yīng)理化指標和小分子乳肽，為蒙古族傳統(tǒng)發(fā)酵馬乳的營養(yǎng)及功能性研究提供數(shù)據(jù)和理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 乳品樣本

將中國內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蒙古族聚居不同牧區(qū)具有相同乳源的新鮮馬乳以及自然發(fā)酵24 h后的發(fā)酵馬乳采集500 g，分別收集到無菌的自封袋中，封好立即置于冰上，-20 ℃保存。

1.2 試劑與耗材

甲酸、乙腈(色譜純)，美國Fluka公司；三氟乙酸(分析純)，德國Merck公司；相對分子質(zhì)量矯正曲線標準品：細胞色素C(M12500)、抑肽酶(M6500)、桿菌酶(M1450)、乙氨酸-乙氨酸-酪氨酸-精氨酸(M451)、乙氨酸-乙氨酸-乙氨酸(M189)，美國Sigma公司；其他化學(xué)分子試劑均為分析純，購自國內(nèi)公司。

1.3 儀器與設(shè)備

Nexera X2超高效液相色譜儀、三重四極桿質(zhì)譜儀聯(lián)用系統(tǒng)，日本島津公司；LC-20 AD高效液相色譜儀，日本島津公司；XBridge BEH130 C18色譜柱(4.6 mm×250 mm)，美國Waters公司；TSK gel G2000 SWXL凝膠過濾柱(7.8 mm×300 mm)，日本TOSOH公司；FOSS Kjeltec8400全自動凱氏定氮儀、TecatorTMDigestor2006消化儀，丹麥FOSS公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 基礎(chǔ)理化指標測定

蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準 食品中蛋白質(zhì)的測定》；脂肪含量參照GB 5009.6—2016《食品安全國家標準 食品中脂肪的測定》；乳糖含量參照GB 5413.5—2010《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中乳糖、蔗糖的測定》；酸度含量參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定(第三法)》；酒精度參照GB 5009.225—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定(第三法)》；氨基酸含量參照GB 5009.124—2016《食品安全國家標準 食品中氨基酸的測定》。

1.4.2 分子量分布測定

參照GB 22729—2008《食品安全國家標準 海洋魚低聚肽粉附錄A》，采用高效凝膠過濾色譜法進行測定。即以多孔性填料為固定相，依據(jù)樣本組分分子體積大小的差別進行分離，流動相為：V(乙腈)∶V(水)∶V(三氟乙酸)=45∶55∶0.1，紫外檢測波長為UV 220 nm，流速為0.5 mL/min，柱溫為30 ℃。稱取10 mL樣品，用流動相定容至25 mL，超聲振蕩10 min后，用孔徑為0.2～0.5 μm聚四氟乙烯膜過濾后，上機進樣分析，使用凝膠色譜圖及其數(shù)據(jù)進行處理，得到蛋白質(zhì)水解物的相對分子質(zhì)量大小及分布范圍，將樣品的色譜數(shù)據(jù)納入校正曲線方程中，以計算樣品中肽的相對分子質(zhì)量及其分布范圍。用峰面積歸一化計算不同相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)水解物(包括寡肽和少量游離氨基酸)的峰面積相對百分比之和。

1.4.3 肽組分及含量測定

參照王雨晴等[4]利用測定肌肽含量的分析條件，調(diào)整并優(yōu)化液相色譜條件和定量MRM參數(shù)。

樣品處理：用純水將樣品稀釋100倍，離心處理后(10 000 r/min離心10 min)取上清液，用孔徑為0.22 μm尼龍過濾膜過濾后，對待測樣品進行前處理。

首先，利用C18色譜柱對發(fā)酵馬乳進行液相色譜分離，隨后，利用電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對分離的產(chǎn)物進行產(chǎn)物離子掃描，利用特征離子對樣品中存在的肽段序列進行定性推算。結(jié)合定性結(jié)果，對肽段結(jié)構(gòu)進行定量分析。液相色譜條件：色譜柱：Inertsil ODS-3(2.1 mm×250 mm,5 μm)；流動相：A為體積分數(shù)為0.1%的甲酸水溶液，B為體積分數(shù)為0.1%的甲酸乙腈溶液；梯度洗脫程序：0～15 min，B(0%～50%)；15～20 min，B(50%～100%)；20～25 min，B(100%)；25.1～35 min，B(0%)；流速：0.2 mL/min；進樣體積：10 μL；柱溫：40 ℃。

質(zhì)譜條件：離子化模式：ESI，正離子模式；離子噴霧電壓：+4.5 kV；霧化氣流速：氮氣3.0 L/min；加熱氣流速：氮氣 10 L/min；干燥氣流速：氮氣10 L/min；DL溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；離子源溫度：300 ℃；掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測(multiple reaction monitoring, MRM)；駐留時間：100 ms；延遲時間：3 ms；MRM參數(shù)見表1。

表1 化合物的MRM優(yōu)化參數(shù)

注：*表示定量離子；未標*的產(chǎn)物離子用于定性

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 23.0分析處理數(shù)據(jù)，所有實驗數(shù)據(jù)為至少3個平行試驗的平均值，用平均值±標準誤(SE)表示；圖表由Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬乳與發(fā)酵馬乳理化指標分析

表2中DW.Y.1、WU.Y.1、XW.Y.1為新鮮馬乳樣品，DW.C.1、WU.C.1、XW.C.1為發(fā)酵24 h后的馬乳樣品。結(jié)果表明，發(fā)酵前3種馬乳的蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、酸度、酒精度、pH和氨基酸含量均無顯著性差異(P>0.05)。發(fā)酵后3個馬乳樣本的乳糖、酒精度、pH均與發(fā)酵前呈顯著性差異(P<0.05)，酸度與發(fā)酵前呈極顯著性差異(P<0.01)。蛋白質(zhì)、脂肪和氨基酸含量發(fā)酵前后則均無顯著性差異(P>0.05)。

表2 馬乳與發(fā)酵馬乳理化指標結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)上標不同小寫字母表示在P<0.05時有顯著性差異；N.D表示未檢出

本實驗所用原馬乳樣本采集自錫林郭勒不同牧區(qū)主要種屬的馬匹乳源泌乳中期。前期研究發(fā)現(xiàn)，來源于錫林郭勒主要種屬馬匹相同泌乳期乳源的原馬乳樣本在理化特性和營養(yǎng)成分并無顯著性差異，此研究結(jié)果與已有的文獻報道較為接近[5]。發(fā)酵后馬乳樣本理化特性與發(fā)酵前馬乳樣本差異顯著，推測馬乳發(fā)酵前后化學(xué)指標的變化可能與其所在環(huán)境的發(fā)酵菌群有關(guān)。馬乳在無氧發(fā)酵過程中，乳中的葡糖被乳酸菌和酵母菌分別轉(zhuǎn)換成乳酸和酒精，導(dǎo)致發(fā)酵后酸乳的乳糖含量與pH降低，酸度和酒精含量增加[6]。

2.2 蛋白質(zhì)水解物分子量分布

乳品在發(fā)酵過程中，大分子蛋白質(zhì)會被微生物產(chǎn)生的蛋白水解酶類分解成大小不等的肽段和單個氨基酸[7]，不同微生物由于產(chǎn)生蛋白水解酶的能力不同，使最終蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的分子質(zhì)量呈現(xiàn)差異。為了驗證發(fā)酵微生物對蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物的影響，采用高效凝膠過濾色譜技術(shù)對馬乳及發(fā)酵馬乳樣品中蛋白質(zhì)水解物的分子質(zhì)量分布進行分析(圖1)。

圖1 樣品中相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)水解物所占比例分布

結(jié)果表明，馬乳在發(fā)酵前蛋白質(zhì)水解物不同分子質(zhì)量的分布均無顯著差異(P>0.05)。發(fā)酵后，3種發(fā)酵馬乳蛋白水解物分子量分布與發(fā)酵前比有極顯著性差異(P<0.01)。以相對分子質(zhì)量<1 000 Da的蛋白質(zhì)水解物所占比例為例，馬乳經(jīng)發(fā)酵后，DW.C.1相對分子質(zhì)量<1 000 Da的蛋白質(zhì)水解物所占比例由(4.866±0.95)%增加為(17.667±0.86)%，WU.C.1由(4.498±1.14)%增加為(15.531±1.03)%，XW.C.1由(5.043±0.98)%增加為(29.109±1.26)%。值得注意的是，發(fā)酵馬乳WU.C.1相對分子質(zhì)量<1 000 Da的蛋白質(zhì)水解物所占比例(15.531±1.03)%與DW.C.1(17.667±0.86)%呈顯著性差異(P<0.05)，與XW.C.1(29.109±1.26)%呈極顯著性差異(P<0.01)。

本實驗研究發(fā)酵馬乳的樣本的發(fā)酵方式均為蒙古族傳統(tǒng)自然發(fā)酵模式，研究樣本分別采集自中國內(nèi)蒙古錫林郭勒盟蒙古族聚居的不同牧區(qū)，地理環(huán)境的差異影響當(dāng)?shù)氐奈⑸锓N群構(gòu)成，前期在郭梁等[8]研究中已證實。本實驗研究馬乳發(fā)酵前后的蛋白質(zhì)與氨基酸含量無顯著性差異(P>0.05)(表2)，通過測定蛋白質(zhì)水解物的分子質(zhì)量分布，進一步分析其不同相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)水解物所占比例分布呈極顯著性差異(P<0.01)(圖1)，推測馬乳發(fā)酵前后蛋白質(zhì)水解物分子質(zhì)量的分布變化可能與其發(fā)酵菌群有關(guān)。

2.3 發(fā)酵馬乳中肽譜分析

生物活性肽是指對生物機體的生命活動有益或是具有生理作用的蛋白質(zhì)片段[9]。這些生物活性肽通常相對分子質(zhì)量<6 000 Da，具有多種生物學(xué)功能如抗高血壓、抗菌、抗氧化等[10]。而相對分子質(zhì)量<1 000 Da的蛋白水解物(包括低聚肽和少量游離氨基酸)，由于含有的肽段體積小，更容易被人體直接吸收，發(fā)揮生理功能[11]。肽段的生物活性功能與其氨基酸種類和組成結(jié)構(gòu)有一定的關(guān)系，其中二肽為最基礎(chǔ)的活性肽[12]。高效凝膠過濾色譜法研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵馬乳樣品中相對分子質(zhì)量<1 000 Da的肽段所占比例較發(fā)酵前增加了10 %，如圖1所示，故進一步對發(fā)酵馬乳中特征二肽序列進行分析。

本實驗共鑒定出24條(組)肽段，分析DW.C.1、WU.C.1、XW.C.1中所有肽段的總含量，分別為(99.012±0.150)、(17.066±0.096)、(196.772±0.128)g/mL，其中，XW.C.1肽段總含量最高。在XW.C.1中，發(fā)現(xiàn)有4條獨有肽段，分別為SR、LM、FV、ST。而在DW.C.1與WU.C.1中，分別各有IR、TI與LV、IY 2條獨有肽段。發(fā)酵馬乳樣品XW.C.1不僅鑒定到的肽段數(shù)量最多，且獨有肽段的數(shù)量同樣最多。3種樣品對肽段的定量結(jié)果與前期小分子蛋白水解物所占比例分析結(jié)果(圖1)較為一致。3種發(fā)酵馬乳鑒定的肽段中，標記含量較高且有功能活性的肽段為特征肽段，分別為VP、AF(圖2)。

圖2 樣品中特征肽段的譜圖

其中，肽段VP在3個樣品中含量較高分別為(21.271±0.134)、(1.076±0.214)與(11.947±0.125)g/mL。AF在樣品XW.C.1含量最高為(14.986±0.121)g/mL。結(jié)合文獻中的相關(guān)ACE抑制肽的半抑制率(表3)，C端氨基酸為Pro，N末端氨基酸為Ile和Val時具有較高的ACE抑制率。

部分肽段已被證實在不同的pH和ACE抑制率下存在相對穩(wěn)定的狀態(tài)[13-16]，具有降血壓功能(表3)。ACE是一種含鋅二肽羧肽酶，主要存在于哺乳動物體細胞以及雄性生殖細胞內(nèi)，通過腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)和激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)發(fā)揮作用，從而導(dǎo)致血壓升高[17]。ACE抑制肽可通過與ACE活性位點結(jié)合，競爭性地抑制ACE的活性，調(diào)節(jié)RAS和KKS達到降低血壓的目的。目前研究表明，ACE抑制肽的分子質(zhì)量、氨基酸序列以及立體構(gòu)象等都會影響其抑制能力[18]。CHEUNG等[19]研究發(fā)現(xiàn)ACE抑制肽C端氨基酸為芳香族氨基酸(Trp、Tyr、Phe)或Pro時其降血壓效果較好。另外，N端為疏水性氨基酸，如Val、Leu、Ile等時表現(xiàn)出較強的ACE抑制活性。KHMURA、JANG等[20-21]做了更深入地研究發(fā)現(xiàn)，C末端氨基酸為芳香族氨基酸(Trp、Tyr、Phe)和脂肪族氨基酸(Ile、Ala、Leu、Met)，或C末端倒數(shù)第2個氨基酸為脂肪族氨基酸、芳香族氨基酸和堿性氨基酸(Arg、Asp)時，具有更高的ACE抑制活性。WU等[22]通過構(gòu)建大量二肽、三肽數(shù)據(jù)庫研究其構(gòu)效關(guān)系發(fā)現(xiàn)，帶有芳香環(huán)或疏水性氨基酸殘基的二肽具有較高的抑制活性。對于三肽，C末端為芳香氨基酸，C末端倒數(shù)第2個氨基酸為帶正電荷的氨基酸，以及N末端為疏水性氨基酸時ACE的抑制活性最高。

綜上所述，抑制肽中疏水性氨基酸的含量，或者說肽段的疏水性決定了其是否具有較高的ACE抑制活性。目前一些含有ACE抑制肽的功能性食品已被商業(yè)化，如日本的Calpis和芬蘭的Evolus中含有的VPP和IPP已被證實具有良好的抗高血壓的能力[23]。

表3 發(fā)酵馬乳樣品中鑒定的部分肽段

注：同列數(shù)據(jù)尾注不同字母表示在P<0.05時有顯著性差異；N.D表示未檢出；*為樣品特征肽段

近幾年發(fā)現(xiàn)，瑞士乳桿菌、乳酸乳球菌等已確定具有水解VPP和IPP等ACE抑制肽的功能[14,24]。JUILLARD、DOEVEN、BARS、閆彬等[25-27,6]研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵乳中球菌、桿菌和酵母菌的共生和拮抗作用可以提高酸乳菌群的多樣性水平，同時促進乳肽的產(chǎn)生。此外，已有研究分別從乳酸乳桿菌屬、乳酸乳球菌屬、嗜熱鏈球菌屬、釀酒酵母屬發(fā)酵的酸乳樣品中分離出了二肽YP、三肽VPP等小分子活性肽段，說明這些菌屬可能是具有高蛋白水解性能和釋放活性肽段能力的重要菌屬[28]。因此，針對錫盟地區(qū)發(fā)酵馬乳中小分子功能乳肽的生物合成與轉(zhuǎn)化機制，需結(jié)合發(fā)酵馬乳中微生物群落的多樣性的研究結(jié)果進行更深入地探討。

3 結(jié)論

近幾年來，我國對少數(shù)民族特色傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品的研究逐年增多，而發(fā)酵馬乳具有提高免疫能力、調(diào)節(jié)血壓、血糖及機體生理代謝的功能，研究價值不容小覷。該研究采集了錫盟地區(qū)的馬乳及發(fā)酵馬乳樣本，通過測定馬乳的基礎(chǔ)理化指標，結(jié)合高效凝膠過濾色譜與超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜，分析馬乳發(fā)酵前后蛋白水解的相關(guān)指標及發(fā)酵后的主要功能肽段。發(fā)酵馬乳XW.C.1鑒定出的總肽段與獨有肽段最多，具有潛在的ACE抑制肽含量最多，且特征肽段VP、AF含量最高。經(jīng)理化指標和發(fā)酵后相對分子質(zhì)量蛋白質(zhì)水解物所占比例綜合分析，表明發(fā)酵馬乳的菌種組成可能影響其功能肽段的含量。未來的研究中，需要結(jié)合馬乳發(fā)酵前后的菌群變化及馬乳中存在的小分子肽段的ACE抑制活性對其生物轉(zhuǎn)化機制進行更為深入地分析，以期從天然馬乳發(fā)酵微生物中挖掘制備相關(guān)功能肽的優(yōu)良菌劑。