JAK2/STAT3信號轉導通路在巖大戟內酯B誘導的前列腺癌細胞PC-3凋亡中的作用

王貽兵,劉　丹,王佳賀

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JAK2/STAT3信號轉導通路在巖大戟內酯B誘導的前列腺癌細胞PC-3凋亡中的作用

王貽兵a*,劉丹b,王佳賀b

目的探討巖大戟內酯B誘導的人前列腺癌細胞系PC-3細胞凋亡以及JAK2/STAT3信號轉導通路在此過程中的作用。方法不同濃度的巖大戟內酯B處理人前列腺癌細胞系PC-3細胞0、24、48、72 h后，采用臺盼藍染色法檢測PC-3細胞存活率；采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測PC-3細胞凋亡率；Western blot分析檢測巖大戟內酯B作用不同時間后JAK2/STAT3信號轉導通路的表達；預先用不同濃度的JSI-124(選擇性STAT3途徑抑制劑)處理PC-3細胞60 min，觀察巖大戟內酯B作用不同時間后PC-3細胞的凋亡情況。結果巖大戟內酯B能夠誘導前列腺癌細胞PC-3凋亡，降低磷酸化-JAK2/STAT3的表達，JSI-124可以提高巖大戟內酯B誘導的PC-3細胞凋亡率。結論JAK2/STAT3信號轉導通路參與了巖大戟內酯B誘導的PC-3細胞凋亡過程。JSI-124通過特異性地抑制STAT3活性提高了巖大戟內酯B誘導的PC-3細胞凋亡率。

巖大戟內酯B；前列腺癌；PC-3細胞；細胞凋亡

0　引言

前列腺癌好發(fā)于中老年男性，已成為危害男性生命的重要疾病之一。近年來，隨著我國人口老齡化及經(jīng)濟水平的提高，前列腺癌的發(fā)病率亦逐年上升[1]。狼毒大戟(EuphorbiafischerianaSteud)為大戟科植物，含有多種化學成分，巖大戟內酯B(Jolkinolide B)廣泛存在于狼毒大戟中，屬二萜類[2]。研究發(fā)現(xiàn)，巖大戟內酯B具有廣泛的抗腫瘤活性[3-5]，能夠誘導白血病、乳腺癌細胞等多種腫瘤細胞凋亡。然而關于巖大戟內酯B能否誘導人前列腺癌細胞凋亡及其相關機制的研究較少。本研究探討了巖大戟內酯B對前列腺癌細胞株PC-3細胞凋亡和JAK2/STAT3信號轉導通路的影響，以進一步探討巖大戟內酯B治療前列腺癌的機制。

1　材料和方法

1.1主要試劑及儀器RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清購自Gibco公司;Bcl-2、Bax抗體、磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3抗體及其他試劑均購自武漢博士德生物工程有限公司；流式細胞儀購自美國Backman公司；離心機購自德國Eppendorf 公司。PC-3細胞購自中國科學院上海細胞庫。

1.2細胞培養(yǎng)將PC-3細胞置于含有10% 胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3巖大戟內酯B作用于PC-3細胞當巖大戟內酯B的濃度分別為0、30、60 及120 μg/mL時，分別與PC-3 細胞培養(yǎng)0、24、48及72 h。

1.4細胞活力測定采用臺盼藍拒染法，同一實驗重復3次。將不同濃度的巖大戟內酯B分別與人前列腺癌細胞株PC-3細胞培養(yǎng)0、24、48及72 h后，取對數(shù)生長期的細胞，用0.4%臺盼藍染色5 min，在顯微鏡下觀察。其中，死細胞染成藍色。計數(shù)未染色的細胞數(shù)和總的細胞數(shù)，細胞存活率為未染色的細胞占總的細胞的百分率。

1.5AnnexinV-FITC/PI雙標記流式細胞儀檢測PC-3細胞的凋亡情況收集對數(shù)生長期的PC-3細胞，加入不同濃度的巖大戟內酯B，分別作用0、24、48及72 h后，收集細胞，調整待測PC-3細胞的濃度為5×105個/mL，用500 μL 的Binding Buffer 將PC-3細胞重懸，先加入5 μL AnnexinV-FITC，再加入5 μL Propidium iodide(PI)混勻，4 ℃避光結合15 min后，采用流式細胞儀測定PC-3細胞的凋亡率。

1.6Western blot檢測磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3的表達巖大戟內酯B分別處理PC-3 細胞0、24、48及72 h，提取總蛋白。檢測蛋白濃度，進行蛋白定量。等量蛋白用SDS-聚丙烯酰氨凝膠電泳。電泳條帶轉移至PVDF 膜。用2%脫脂奶粉室溫封閉1 h；加入一抗(兔抗人非磷酸化-JAK2、非磷酸化-STAT3以及磷酸化-JAK2、磷酸化-STAT3、Bcl-2、Bax、β-actin)，4 ℃過夜。TBST (含0.1% Tween 20-Tris 緩沖液)洗膜 2 次，每次15 min；加入稀釋后的羊抗兔 IgG 二抗(稀釋比例為1∶6 000)，室溫條件下反應 1 h；洗膜后按PIERCE 化學發(fā)光試劑盒說明書，進行蛋白條帶的灰度值檢測。實驗重復3次。

2　結果

2.1細胞活力測定臺盼藍染色結果發(fā)現(xiàn)，當巖大戟內酯B的濃度逐漸升高及作用時間逐漸延長時，各實驗組被染成藍色的細胞數(shù)量亦逐漸增多,提示壞死的PC-3細胞逐漸增多,并且?guī)r大戟內酯B對PC-3細胞的抑制作用呈濃度及時間依賴性，見圖1。

圖1　巖大戟內酯B對前列腺癌細胞PC-3生長的影響

2.2流式細胞儀分析檢測前列腺癌細胞系PC-3細胞凋亡分別以0、30、60及120 μg/mL濃度的巖大戟內酯B作用于前列腺癌細胞系PC-3不同時間后，細胞均發(fā)生凋亡，并且呈濃度及時間依賴性。當巖大戟內酯B濃度為30、60及120 μg/mL時，作用48 h后，PC-3細胞的凋亡率與0 μg/mL相比，以及當巖大戟內酯B濃度為60 μg/mL 時，分別作用24、48及72 h后，PC-3細胞的凋亡率與0 h相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.001)。結果見圖2。

圖2　Annexin V FITC/PI 雙染流式細胞儀分析檢測前

2.3巖大戟內酯B對磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3以及Bcl-2、Bax蛋白表達的影響巖大戟內酯B作用不同時間后，免疫印跡法檢測磷酸化及非磷酸化JAK2/STAT3的表達。結果顯示，經(jīng)巖大戟內酯B作用PC-3細胞0、24、48及72 h后，磷酸化JAK2/STAT3蛋白的表達水平隨著巖大戟內酯B作用時間的延長逐漸下降，提示巖大戟內酯B可抑制JAK2/STAT3的活化。同時，結果發(fā)現(xiàn)，隨著巖大戟內酯B作用時間的延長，促凋亡蛋白Bax 的表達水平逐漸升高，而抗凋亡蛋白Bcl-2的表達逐漸下降(圖3)。

2.4STAT3抑制劑JSI-124對PC-3細胞凋亡率的影響預先用不同濃度的JSI-124處理PC-3細胞60 min，觀察巖大戟內酯B作用不同時間后PC-3細胞的凋亡情況，結果顯示，PC-3細胞的凋亡率隨著JSI-124濃度的增加而逐漸升高。

圖3　巖大戟內酯B對JAK-STAT3、Bcl-2和Bax表達的影響

3　討論

研究表明，腫瘤細胞增殖和凋亡的失調控是導致惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因之一。因此，抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡已成為治療腫瘤的主要手段之一[6-7]。但目前誘導腫瘤凋亡的西藥多因合并嚴重的不良反應而使其臨床應用受到了限制。因此，從中藥中提取高效低毒的抗腫瘤藥物已經(jīng)成為國內外研發(fā)新藥的重要途徑[8]。藥理學研究證實，巖大戟內酯B具有抗白血病、前列腺癌、乳腺癌等多種腫瘤的作用，其機制包括誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤組織生長等[9-10]。但是，關于巖大戟內酯B如何誘導前列腺癌細胞凋亡及其機制，目前研究較少。

凋亡是一個高度復雜的、嚴格的細胞程序性死亡的過程，是細胞自身的一種受促凋亡因子和抑制凋亡因子共同調節(jié)的生理性死亡機制[11-12]。本實驗結果發(fā)現(xiàn)：巖大戟內酯B能夠誘導前列腺癌細胞株PC-3細胞發(fā)生凋亡，抑制PC-3細胞增殖，并且呈時間及劑量依賴性。

Bcl-2、Bax在細胞凋亡調控過程中起非常關鍵的作用。Bax促進凋亡，而Bcl-2的作用與之相反[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著巖大戟內酯B作用時間的延長，Bax的表達水平逐漸升高，而Bcl-2的表達逐漸下降，進一步證實巖大戟內酯B能夠誘導PC-3細胞凋亡。STAT3是轉錄因子STAT 家族的成員，同時也是表皮生長因子受體(Epidermal growth factor receptor，EGFR)下游信號通路JAK-STAT3的關鍵因子[14-15]。磷酸化-STAT3(p-STAT3)可作用于細胞核內特異的DNA結合位點，調節(jié)下游基因表達，直接或間接上調Bcl-2、Bcl-XL和cyclin D1/D2等抑制凋亡的基因的表達[16-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，磷酸化JAK2/STAT3蛋白的表達隨巖大戟內酯B作用時間延長明顯下降，說明JAK2/STAT3信號轉導通路參與了巖大戟內酯B誘導的前列腺癌細胞凋亡的調控。加入不同濃度的STAT3抑制劑JSI-124后，隨著JSI-124濃度的逐漸增加，PC-3細胞的凋亡率亦逐漸升高。提示JSI-124通過特異性地抑制STAT3信號轉導通路，提高了巖大戟內酯B誘導的PC-3細胞凋亡率。進一步證明了JAK2/STAT3信號轉導通路參與了巖大戟內酯B誘導的PC-3細胞凋亡過程。

綜上所述，巖大戟內酯B能夠抑制前列腺癌PC-3細胞的增殖，促進其凋亡，其機制可能與巖大戟內酯B下調PC-3細胞磷酸化JAK2/STAT3的表達，繼而啟動細胞凋亡相關。

[1]馬繼慈,張青川.腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體在前列腺癌治療中的研究進展[J].中華男科學雜志,2015,21(10):941-944.

[2]Uto T,Qin GW,Morinaga O,et al.17-Hydroxy-jolkinolide B,a diterpenoid from Euphorbia fischeriana,inhibits inflammatory mediators but activates heme oxygenase-1 expression in lipopolysaccharide-stimulated murine macrophages[J].Int Immunopharmacol，2012,12(1):101-109.

[3]Xu HY,Chen ZW,Hou JC,et al.Jolkinolide B induces apoptosis in MCF-7 cells through inhibition of the PI3K/Akt/mTOR signaling pathway[J].Oncol Rep，2013,29(1):212-218.

[4]Sun C,Cui H,Yang H,et al.Anti-metastatic effect of jolkinolide B and the mechanism of activity in breast cancer MDA-MB-231 cells[J].Oncol Lett,2015,10(2):1117-1122.

[5]Ma X,Liu Y,Zhang Y,et al.Jolkinolide B inhibits RANKL-induced osteoclastogenesis by suppressing the activation NF-κB and MAPK signaling pathways[J].Biochem Biophys Res Commun，2014,445(2):282-288.

[6]Chatterjee A,Chattopadhyay D,Chakrabarti G.MiR-16 targets Bcl-2 in paclitaxel-resistant lung cancer cells and overexpression of miR-16 along with miR-17causes unprecedented sensitivity by simultaneously modulating autophagy and apoptosis[J].Cell Signal，2015,27(2):189-203.

[7]Gao J,Morgan WA,Sanchez-Medina A,et al.The ethanol extract of Scutellaria baicalensis and the active compounds induce cell cycle arrest and apoptosis including upregulation of p53 and Bax in human lung cancer cells[J].Toxicol Appl Pharmacol，2011,254(3):221-228.

[8]宋佳玉,游顏杰,王建剛.壁虎醇提物體外誘導人前列腺癌PC-3細胞凋亡及機制研究[J].中國實驗方劑學雜志，2016,22(4):137-141.

[9]Wang JH,Zhou YJ,Bai X,et al.Jolkinolide B from Euphorbia fischeriana steud induces apoptosis in human leukemic U937 cells through PI3K/Akt and XIAP pathways[J].Mol Cells，2011,32(5):451-457.

[10]Wang JH,Zhang K,Niu HY,et al.Jolkinolide B from Euphorbia fischeriana Steud induces in human leukemic cells apoptosis via JAK2/STAT3 pathways[J].Int J Clin Pharm Th，2013,51(3):170-178.

[11]Wang J,Hansen K,Edwards R,et al.Mitochondrial division inhibitor 1(mdivi-1)enhances death receptor-mediated apoptosis in human ovarian cancer cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2015,456(1):7-12.

[12]Rogalska A,Marczak A,Gajek A,et al.Induction of apoptosis in human ovarian cancer cells by new anticancer compounds,epothilone A and B[J].Toxicol In Vitro，2013,27(1):239-249.

[13]Gu Y J,Sun W Y,Zhang S,et al.Targeted blockade of JAK/STAT3 signaling inhibits proliferation,migration and collagen production as well as inducing the apoptosis of hepatic stellate cells[J].Int J Mol Med,2016,38(3):903-911.

[14]王競,姜斌,郭躍輝,等.JSI-124 特異性阻斷STAT3 通路抑制非小細胞肺癌細胞H1975增殖的研究[J].中華臨床醫(yī)師雜志，2012,6(24):8033-8037.

[15]Dai F,Gao L,Zhao Y,et al.Farrerol inhibited angiogenesis through Akt/mTOR,Erk and Jak2/Stat3 signal pathway[J].Phytomedicine，2016,23(7):686-693.

[16]Hsieh FC,Cheng G,Lin J.Evaluation of potential Stat3-regulated genes in human breast cancer[J].BiochemBiophys Res Commun,2005,335(2):292-299.

[17]馬向濤,余力偉,王彬,等.Stat3信號轉導通路調控bcl-2成員表達及抑制結腸癌細胞凋亡的機制[J].腫瘤防治研究,2007,34(3):182-184.

[18]TurksonJ,Jove R.STAT proteins:novel molecular targets for cancer drug discovery[J].Oncogene,2000,19(56):6613-6626.

Effect of JAK2/STAT3 signaling transduction on the apoptosis of PC-3 cells of prostate cancer induced by Jolkinolide B

WANG Yi-binga*,LIU Danb,WANG Jia-heb

(a.Department of Urinary Surgery，b.Department of Geriatrics，Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004, China)

ObjectiveTo investigate the role of the JAK2/STAT3 pathway in the apoptosis of prostate cancer PC-3 cells induced by Jolkinolide B,a bioactive diterpene isolated from the roots ofEuphorbiafischerianaSteud.MethodsThe PC-3 cells were treated with different doses of Jolkinolide B at different time points.Growth inhibition was analyzed by trypan blue stain.Cell apoptosis of PC-3 cells was detected by Annexin V-FITC/PI staining.Expression of JAK2/STAT3 was detected by Western blot.In some experiments,PC-3 cells were pretreated with JSI-124(an inhibitor for STAT3),and the apoptosis rates of PC-3 cells were detected.ResultsWe found that Jolkinolide B reduced cell viability and induced apoptosis in a dose- and time- dependent manner in PC-3 cells.The induction of apoptosis was accompanied by the down-regulation of phosphorylation-JAK2/STAT3.Moreover,we observed that JSI-124 treatment resulted in apoptosis of PC-3 cells.ConclusionThe signaling pathway JAK2/STAT3 participates in the apoptosis of PC-3 cells induced by Jolkinolide B.JSI-124 increases PC-3 cell apoptosis induced by Jolkinolide B by inhibiting the activity of JAK2/STAT3.

Jolkinolide B;Prostate cancer;PC-3 cells;Apoptosis

2016-07-07

中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院a.泌尿外科，b.老年病科， 沈陽110004

遼寧省科技攻關項目(2013225086);國家自然基金青年基金項目(81101224);盛京自由研究者計劃項目(201206)

10.14053/j.cnki.ppcr.201609002