cRGD肽偶聯(lián)去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體的包封率測(cè)定方法研究

趙娟娟， 陳真真， 朱思曼， 李　蕊， 王　梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊　830011)

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cRGD肽偶聯(lián)去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體的包封率測(cè)定方法研究

趙娟娟， 陳真真， 朱思曼， 李蕊， 王梅

(新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院， 烏魯木齊830011)

目的建立葡聚糖凝膠柱洗脫法測(cè)定cRGD偶聯(lián)去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體的包封率方法。方法逆相蒸發(fā)法制備cRGD偶聯(lián)的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體，紫外分光光度法測(cè)定去氫駱駝蓬堿的含量，葡聚糖凝膠柱洗脫法測(cè)定cRGD偶聯(lián)的去氫駱駝蓬堿磁納米粒脂質(zhì)體的包封率，并考察葡聚糖凝膠類型、徑高比、洗脫液、上樣量對(duì)游離藥物去氫駱駝蓬堿洗脫的影響。結(jié)果選擇葡聚糖凝膠柱洗脫法，以sephadexG-50(100～300 μm)裝柱、徑高比為1∶10、上樣量為0.5 mL及PBS緩沖液為洗脫溶劑，能有效分離去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體中游離藥物和脂質(zhì)體，測(cè)得洗脫回收率為(98.68±1.08)% ，3批去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體的平均包封率為78.52%。結(jié)論葡聚糖凝膠柱洗脫法可以作為cRGD偶聯(lián)的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體的包封率測(cè)定方法，該法較簡(jiǎn)單可行。

去氫駱駝蓬堿； 脂質(zhì)體； 包封率； 葡聚糖凝膠柱洗脫法

磁納米脂質(zhì)體(Magnetoliposomes, ML)是近年來(lái)新發(fā)展起來(lái)的一種脂質(zhì)體，它是將磁納米粒包裹在脂質(zhì)體的內(nèi)水相或鑲嵌在脂質(zhì)雙分子層內(nèi)形成的具有磁性的脂質(zhì)體[1-2]。磁納米脂質(zhì)體兼具磁納米粒和脂質(zhì)體的雙重特性。一方面，磁納米脂質(zhì)體將磁納米粒包裹在脂質(zhì)體內(nèi)，可克服磁納米粒在體內(nèi)代謝、半衰期短的缺點(diǎn)，同時(shí)在外加交變磁場(chǎng)的作用下還可保留磁納米粒所具有的磁靶向及局部熱療作用；另一方面，磁納米脂質(zhì)體還具有脂質(zhì)體的易于包載藥物、靶向、緩釋、提高藥物穩(wěn)定性、減少藥物毒性等特點(diǎn)，從而磁納米脂質(zhì)體在腫瘤的治療研究中顯示出良好的應(yīng)用前景[3,4]。本研究將去氫駱駝蓬堿(Harmine, HM)包裹入磁納米脂質(zhì)體內(nèi)，并在表面連接cRGD肽，制備具有雙重靶向功能的cRGD肽偶聯(lián)的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體(cRGD conjugated harmine magnetoliposomes, cRGD-HM-MP)，并采用葡聚糖凝膠柱洗脫法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率，對(duì)影響柱洗脫法的因素進(jìn)行了考察，建立了包封率測(cè)定方法，為cRGD肽偶聯(lián)的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體的質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1　儀器與試藥

1.1儀器AB135-S分析天平(瑞士Metter telodo公司),UV-9100D紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) (北京萊伯泰科儀器有限公司),EYELAN-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司),OSB-2100水浴鍋(上海愛(ài)朗儀器有限公司),Malvern Nano-2S90型激光粒徑測(cè)定儀(英國(guó)馬爾文儀器有限公司),85-1磁力攪拌器(金壇市醫(yī)療儀器廠),KQ-50B超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥去氫駱駝蓬堿(HM，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司,含量98.02 %,批號(hào):20140108),大豆磷脂(批號(hào):201406，西安瑞禧生物有限公司),二棕櫚酰磷脂酰膽堿DPPC(美國(guó)，Avanti lipid公司),膽固醇(美國(guó)，Avanti lipid公司),馬來(lái)?；?二硬脂酸磷脂酰乙醇胺-聚乙二2000( Mal-DSPE-PEG-2000) (美國(guó) Avanti lipid 公司),cRGD-DSPE-PEG2000(實(shí)驗(yàn)室自制)，檸檬酸包裹的磁納米粒(實(shí)驗(yàn)室自制)，其余試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1cRGD偶聯(lián)的HM磁納米脂質(zhì)體的制備稱取大豆磷脂、DPPC、膽固醇、DSPE-PEG2000、cRGD-DSPE-PEG2000 (質(zhì)量比10∶10∶5∶1∶1)置于100 mL的圓底燒瓶中，用適量氯仿和乙醚混合溶劑溶解成溶液后，加入1.25 mg HM和制好的磁納米粒適量，冰浴超聲1.5 h，直至形成穩(wěn)定的乳劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，達(dá)到膠態(tài)后，加入適量水，繼續(xù)減壓蒸發(fā)除去殘留溶劑，得到HM磁納米脂質(zhì)體，將脂質(zhì)體液置于4 ℃冰箱內(nèi)放置4 h，備用。

2.2cRGD-HM-MP中HM含量測(cè)定方法建立稱取1 mgHM置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容成10 μg/mL的貯備液，從中吸取一定量，分別用甲醇溶解，制得1、2、4、8、10、20 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。取10 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液置于紫外分光光度計(jì)下200～800 nm范圍內(nèi)掃描波長(zhǎng)，結(jié)果顯示HM在299 nm處有最大吸收，空白脂質(zhì)體在此處沒(méi)有吸收，選定299 nm為最大吸收波長(zhǎng)。在最大吸收波長(zhǎng)處分別測(cè)定不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，得HM標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=11.289X-0.282 6,R2=0.999 2，線性范圍1～20 μg/mL。經(jīng)日內(nèi)精密度、日間精密度、回收率考察，結(jié)果日內(nèi)精密度RSD為(1.11±0.42)%，日間精密度為(1.07±1.04)%，RSD均<2%。回收率為(98.68±1.16)%，RSD為1.08%，說(shuō)明該法準(zhǔn)確性好，可作為HM含量的測(cè)定方法。

2.3葡聚糖凝膠柱洗脫法測(cè)定包封率

2.3.1葡聚糖凝膠的選擇分別采用葡聚糖凝膠(SephadexG-50)50～150 μm和100～300 μm 2種不同型號(hào)分別裝柱,柱徑高比保持在1∶10(cm∶cm)，洗脫液選擇pH7.2磷酸鹽緩沖液，洗脫速度控制在1 mL/min，吸取0.5 mL脂質(zhì)體上柱洗脫，每2毫升接取1個(gè)流份，共接取25個(gè)流份，接得流份用甲醇稀釋，測(cè)定吸光度，以流份作為橫坐標(biāo)，以吸光度作為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線。結(jié)果用50～150 μm的sephadexG-50制得的洗脫曲線游離藥物洗脫較慢，而100～300 μm的sephadexG-50游離藥物較易洗脫完全，而且本實(shí)驗(yàn)還對(duì)不同粒徑的sephadexG-50測(cè)定的包封率進(jìn)行了比較，50～150 μm的sephadexG-50測(cè)得的包封率很低，可能是粒徑較小的sephadexG-50使脂質(zhì)體不易通過(guò)，從而使包封率降低，因此在包封率的測(cè)定中選擇100～300 μm的sephadexG-50，見(jiàn)圖1。

圖1　SephadexG-50(100～300 μm)的洗脫曲線

2.3.2徑高比的選擇選用柱內(nèi)徑為1 cm和1.5 cm2種洗脫柱,用已溶脹好的100～300 μm的SephadexG-50裝柱，使徑高比分別為1∶10和1.5∶10(cm∶cm)，吸取0.5 mLcRGD-HM-MP液上柱，采用PBS緩沖溶液洗脫，每2毫升為1個(gè)流份，共接取25個(gè)流份，每一流份用甲醇稀釋至10 mL，搖勻后，置于紫外分光光度計(jì)下299 nm處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算含量，以藥物含量為縱坐標(biāo)，流份為橫坐標(biāo)，繪制洗脫曲線，見(jiàn)圖2、3。由洗脫曲線結(jié)果可知，2種徑高比的柱均可以將脂質(zhì)體和游離藥物分開。對(duì)于徑高比1∶10的葡聚糖凝膠柱，脂質(zhì)體流份在3～8 mL流出。對(duì)于徑高比1.5∶10的葡聚糖凝膠柱，脂質(zhì)體流份在5～11 mL流出。從節(jié)約葡聚糖凝膠和洗脫液的角度考慮，本研究采用徑高比為1∶10的葡聚糖凝膠柱測(cè)定脂質(zhì)體包封率。

圖2　徑高比1∶10的洗脫曲線(n=3)

圖3　徑高比1.5∶10的洗脫曲線(n=3)

2.3.3上樣量的考察已溶脹好的粒徑為100～300 μm的SephadexG-50裝柱，保持徑高比為1∶10，洗脫液為pH7.2磷酸鹽緩沖液，控制洗脫流速為1mL/min。取制得的脂質(zhì)體1 mL和0.5 mL分別上樣洗脫，采用“2.3.1”項(xiàng)下方法分別測(cè)定洗脫曲線，見(jiàn)圖4。不同上樣量洗脫曲線基本一致，故從成本考慮，選擇0.5 mL上樣量為測(cè)定包封率的上樣量。

2.3.4洗脫液的考察按照“2.3.3”項(xiàng)下方法裝柱后，選擇PBS和水作為洗脫液，分別測(cè)定脂質(zhì)體洗脫曲線，見(jiàn)圖5。結(jié)果洗脫液對(duì)洗脫曲線有較大影響，PBS液可使游離藥物更好地洗脫下來(lái)，而水作洗脫液時(shí)，基本看不到游離藥物的洗脫峰，說(shuō)明游離藥物洗脫較慢，25個(gè)流份后仍可見(jiàn)有少量游離藥物的吸光度，所以本研究選擇PBS即pH=7.2的磷酸鹽緩沖液作為洗脫液。

圖4　不同上樣量的洗脫曲線

圖5　不同洗脫液的洗脫曲線

2.3.5包封率測(cè)定方法的回收率考察取0.5 mL的cRGD偶聯(lián)的去氫駱駝蓬堿磁納米脂質(zhì)體上柱洗脫，柱徑高比為1:10(cm:cm)，接取第3～8 mL流份共6 mL為純脂質(zhì)體流份，從純脂質(zhì)體流份中取0.5 mL第二次上柱洗脫，接取第3～8 mL流份共6 mL作為第二次過(guò)柱的純脂質(zhì)體流份，將第二次過(guò)柱純脂質(zhì)體流份和第一次過(guò)柱的純脂質(zhì)體流份分別取3 mL用甲醇溶解后，置于紫外分光光度計(jì)下299 nm處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，求算含量，以第二次過(guò)柱純脂質(zhì)體流份和第一次過(guò)柱的純脂質(zhì)體流份的含量進(jìn)行對(duì)比，計(jì)算回收率，平均回收率為98.68 μg，見(jiàn)表1。

表1　回收測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.4cRGD-HM-MP包封率的測(cè)定取已溶脹好的SephedexG-50裝柱，使徑高比為1∶10，用100 mL磷酸鹽緩沖液液平衡葡聚糖凝膠柱后，分別取3批制得的0.5 mLcRGD-HM-MP液上樣洗脫，棄去前2 mL流份,接取第3～8 mL流份共6 mL為純脂質(zhì)體流份，從中取3 mL用甲醇10 mL破乳溶解，取未過(guò)柱的脂質(zhì)體0.5 mL直接用甲醇破乳溶解并定容至10 mL，每個(gè)樣品共做3份；將制得的樣品置于紫外分光光度計(jì)下299 nm處測(cè)定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算濃度，計(jì)算包封率。包封率的計(jì)算公式為：包封率=過(guò)柱后含量/過(guò)柱前含量×100%，平均包封率為78.52%,見(jiàn)表2。

表2　樣品包封率的測(cè)定結(jié)果(n=3)

3　討論

包封率測(cè)定方法有多種,如葡聚糖凝膠柱法、魚精蛋白沉淀法、冷凍超速離心法、微型柱法、透析法及超濾法等,其原理都是采用一定的方法使包封的藥物和游離藥物分離,測(cè)定包封或游離藥物的濃度,計(jì)算包封率[11-14]。其中葡聚糖凝膠柱色譜法,利用分子排阻色譜原理及吸附原理將不同尺寸的微粒分離，使脂質(zhì)體和游離藥物分開,從而測(cè)定包封率。國(guó)外選用的凝膠范圍較廣,不同交聯(lián)度的葡聚糖凝膠和羥丙基交聯(lián)葡聚糖均有應(yīng)用,而國(guó)內(nèi)多沿用葡聚糖凝膠SephedexG-50[14]。選用SephadexG-50測(cè)定包封率時(shí)，凝膠的選擇要考慮被分離化合物的分子量大小和溶解度。另外在分離時(shí),所用葡聚糖凝膠柱的徑高比、洗脫液的流速及上樣量的多少都會(huì)影響脂質(zhì)體與游離藥物的分離, 宜選擇能使脂質(zhì)體達(dá)到最大分離程度的洗脫條件,才能保證包封率測(cè)定準(zhǔn)確[14]。本研究通過(guò)葡聚糖凝膠柱洗脫法測(cè)定脂質(zhì)體的包封率，并對(duì)凝膠種類、徑高比、上樣量進(jìn)行考察，建立了cRGD偶聯(lián)的HM磁納米脂質(zhì)體的包封率測(cè)定方法，通過(guò)回收率考察，表明該法較準(zhǔn)確可行。

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(本文編輯施洋)

Determination of entrapment efficiency of cRGD conjugated HM magnetoliposomes

ZHAO Juanjuan, CHEN Zhenzhen, ZHU Siman, LI Rui, WANG Mei

(CollegeofPharmacy,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo establish sephadex G-50 method to determine entrapment efficiency of cRGD conjugated Harmine magnetonanoliposomes. MethodsReverse phase evaporation method was used to prepare cRGD conjugated Harmin magnetonanoliposomes. UV spectrophotometric method was used to determine drug content. Sephadex G-50 column filtration method was used to determine the entrapment efficiency of Harmine. Furthermore, the type of sephadexG-50, ratio of diameter and height of column, sample amount and dilution solution were optimized. ResultsSepadex G-50 gel filtration method can be used to effectively separate liposomes and free drugs. SephadexG-50 (100-300μm) was chosen. The ratio of diameter and height of column was 1∶10. The volume of added sample was 0.5mLand the dilution solution was PBS solution. Recovery rate was (98.68±1.08)%. Average entrapment efficiency of Harmine magnetic nanoliposomes in three batches were 78.52%. ConclusionSephadex G-50 column filtration method can be used to determine the entrapment efficiency of Harmine magnetic nanoliposomes, and this method is simple and feasible.

Harmine; magneto nanoliposomes； Entrapment efficiency； Sephadex G-50 column filtration method

國(guó)家自然科學(xué)基金(81460539)

趙娟娟(1992-),女,本科,研究方向：藥學(xué)研究，E-mail:1226862870@qq.com。

王梅(1977-),女,博士,副教授,研究方向：藥物傳輸系統(tǒng)的研究,E-mail:wm630@163.com。

R943

A

1009-5551(2016)10-1315-04

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.025

2016-6-1]