缺血預(yù)處理和后處理對兔移植肺缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用的比較

魏　琴， 劉媛媛， 姜　濤， 馬　嵋， 張　春， 伊力亞爾·夏合丁， 朱　輝

(1新疆醫(yī)學(xué)動物模型研究重點實驗室，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2次消毒供應(yīng)室；3教學(xué)科； 4胸外科, 烏魯木齊　830054)

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缺血預(yù)處理和后處理對兔移植肺缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用的比較

魏琴1， 劉媛媛2， 姜濤1， 馬嵋3， 張春1， 伊力亞爾·夏合丁4， 朱輝4

(1新疆醫(yī)學(xué)動物模型研究重點實驗室，新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床醫(yī)學(xué)研究院；新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2次消毒供應(yīng)室；3教學(xué)科；4胸外科, 烏魯木齊830054)

目的比較缺血預(yù)處理和缺血后處理2種方法對大白兔肺移植術(shù)中缺血-再灌注損傷的保護(hù)作用。方法對48只新西蘭大白兔建立異體兔肺移植模型，隨機等分為缺血再灌組(IR組)、缺血預(yù)處理組(IPC組)、缺血后處理組(IPOST組)。監(jiān)測移植再灌注后60、120 min時氧分壓(PaO2)的變化，觀察各組動物肺組織的病理改變，檢測血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量，計算肺濕/干重比(W/D)。結(jié)果成功制備新西蘭大白兔肺移植模型，對缺血-再灌注損傷采用缺血預(yù)處理和后處理2種方法干預(yù)，病理結(jié)果顯示，IPC組和IPOST組肺組織的損傷較輕，但I(xiàn)PC組損傷最輕；各組在不同時間點PaO2含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。在60、120 min時，IPOST、IPC組PaO2高于IR組，IPOST組PaO2低于IPC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；3組SOD、MDA、NO、TNF-α及W/D差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與IR組比較，IPC組SOD、NO高于IR組，而MDA、TNF-α及W/D低于IR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IPOST組SOD、NO低于IPC組，而MDA、TNF-α及W/D高于IPC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論缺血預(yù)處理及缺血后處理對兔肺移植缺血-再灌注損傷均有保護(hù)作用，其中缺血預(yù)處理的效果最明顯。

缺血預(yù)處理； 缺血后處理； 缺血再灌注損傷； 肺移植

缺血-再灌注損傷(IRI)在肺移植術(shù)中是導(dǎo)致移植失敗的一個重要因素，在72 h內(nèi)移植肺再灌注可引起肺水腫、彌漫性肺損傷、低氧血癥等，嚴(yán)重會導(dǎo)致原發(fā)性移植物功能障礙[1-2]。缺血預(yù)處理(IPC)已經(jīng)被證實在IRI中對心[3]、肝[4]、腦[5-6]、腎[7]等多器官有保護(hù)作用。已有研究證實缺血后處理(IPOST)能提高心肌、肝臟及肺臟等臟器對較長時間缺血的耐受性[8-10]。本研究制備新西蘭大白兔肺移植模型，檢測氧分壓(PaO2)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)含量和肺濕/干重比(W/D)，探討IPC和IPOST在缺血-再灌注損傷中的保護(hù)作用，為以后肺移植模型成功建立和降低IRI風(fēng)險提供實驗依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實驗動物及分組新西蘭健康大白兔48只，2月齡，體質(zhì)量3.0～3.5 kg，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[動物許可證號：SYXK(新)2013-0001]。動物實驗在新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物科學(xué)研究部進(jìn)行，該部門具有國際AAALAC資質(zhì)認(rèn)證，動物實驗按照國際標(biāo)準(zhǔn)化操作流程執(zhí)行。按隨機數(shù)字表將實驗動物隨機均分為3組(n=16)，分為缺血再灌注(IR)組、缺血預(yù)處理(IPC)組、缺血后處理(IPOST)組，每組按體質(zhì)量相近原則配對成供體和受體。

1.2肺移植動物模型制備

1.2.1供體手術(shù)供體麻醉和手術(shù)的步驟與方法參見文獻(xiàn)[11]。麻醉：實驗動物先給予異丙酚(0.3 mg/kg體質(zhì)量)和萬可松(0.2 mg/ kg體質(zhì)量)進(jìn)行麻醉誘導(dǎo)。氣管插管，接容量控制呼吸機(HX-300，泰盟)，給氧濃度(FiO2)為100% ，雙肺通氣潮氣量15 mL/kg體質(zhì)量，呼吸頻率30次/min。給予異丙酚(30 mg·kg· h-1)和萬可松(0.2 mg·kg·h-1)靜脈注入維持麻醉。供肺的灌注前準(zhǔn)備：動物右側(cè)臥位固定后，按照外科手術(shù)常規(guī)方式消毒鋪巾，左側(cè)第5肋間開胸后解剖分離上、下腔靜脈和左肺動脈、靜脈及左主支氣管。靜脈給予肝素鈉(700 U/kg體質(zhì)量)進(jìn)行全身肝素化。灌注與保存：阻斷上、下腔靜脈回心血流，剪開胸腔動脈放血。經(jīng)右心室插管以4℃的乳酸林格氏液順行灌注(100 mL/kg體質(zhì)量)。隨后經(jīng)左心房向肺靜脈逆行灌注(50 mL/kg體質(zhì)量)。整塊切取左肺及左肺靜脈匯入處心房壁，修剪整齊，置入4℃的乳酸林格氏液備用。

1.2.2受體手術(shù)麻醉及移植前準(zhǔn)備麻醉及氣管插管同供體，雙肺通氣潮氣量15 mL/kg體質(zhì)量，單肺通氣潮氣量10 mL/kg體質(zhì)量,右側(cè)臥位置于40℃保溫毯上。開胸:解剖游離支氣管及血管，血管夾阻斷左肺動脈及支氣管，2把主動脈側(cè)壁鉗夾肺靜脈匯入處的左心房側(cè)壁。切斷血管、支氣管及心房壁，切除左肺。供肺植入：供肺以4℃的乳酸林格氏液紗布包裹后放入塑料袋，置入受體左胸腔。先行支氣管連續(xù)縫合的對端吻合。隨后受體左心房修剪成心房袖與供肺心房壁做連續(xù)縫合。最后間斷縫合吻合肺動脈并預(yù)留一針不打結(jié)。

1.2.3手術(shù)操作時間及缺血-再灌注時程的控制供肺移植前手術(shù)準(zhǔn)備時間為(20±5) min。植入手術(shù)操作時間為50 min，從開始吻合到再灌注的時間均控制在60 min。肺缺血時間控制在120 min。以再灌注時間120 min設(shè)定為指標(biāo)觀察終點。

1.2.4造模成功標(biāo)準(zhǔn)模型建立成功的評判標(biāo)準(zhǔn)是再灌注120 min留取標(biāo)本后，動物心臟及肢體血管搏動正常，剪開肺上、下靜脈均有持續(xù)通暢血流則模型判定為成功。

1.3不同組處理方法 IR組:實施異體肺移植但不做其他處理。IPC組：在供體肺灌注前，反復(fù)阻斷與開放左肺動脈血流3次，阻斷時間5 min，間隔時間5 min。IPOST組：受體肺移植操作完成后，先反復(fù)開放和阻斷肺動脈血流5次，每次阻斷與間隔時間為1 min，完全恢復(fù)植入肺的血流灌注。

1.4標(biāo)本采集所有新西蘭兔分別于受體肺切除(0 min)及移植再灌注后60、120 min 3個時點經(jīng)左肺下靜脈采血檢測血氧分壓(PaO2)。再灌注完后抽取左下肺靜脈血用于檢測SOD、MDA、NO和TNF-α。組織取左肺舌段部分約0.5 g稱濕重，干燥箱100℃烘干24 h，稱其干重，計算W/D，另取肺組織置于10%中性甲醛液固定，用于病理學(xué)檢測。

1.5組織病理學(xué)檢查固定于10%甲醛的肺組織經(jīng)石蠟包埋，脫水，切片機(Leica,德國)切片厚3 μm，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。組織形態(tài)由經(jīng)驗豐富的病理專家采圖并評估。

2　結(jié)果

2.1動物模型造模情況本研究共用新西蘭兔48只，供、受體分別24只，在供體手術(shù)中無死亡及麻醉意外，受體手術(shù)死亡3只，成功21只。

2.2肺組織病理改變IR組：鏡下可見肺泡腔大小不等、結(jié)構(gòu)紊亂、部分肺泡壁斷裂，呈現(xiàn)氣腫狀，肺泡內(nèi)可見大量出血、水腫,肺泡部分不張(圖1a)。IPC組：鏡下肺泡結(jié)構(gòu)不完整，部分肺泡壁斷裂，肺泡腔清晰，水腫及氣腫較輕，炎癥改變相對較輕(圖1b)。IPOST: 鏡下肺泡結(jié)構(gòu)不完整，部分肺泡壁斷裂，大量炎癥細(xì)胞浸潤，肺水腫明顯(圖1c)。

a: IR組b： IPC組c： IPOST組

圖1肺組織病理改變(HE×100)

2.3不同時間點PaO2的變化各組動物不同時間點PaO2含量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=306.811,P<0.05)。在60、120 min時，IPOST、IPC組PaO2高于IR組，IPOST組PaO2低于IPC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表1)。

2.4各組動物SOD、MDA、NO、TNF-α及肺濕/干重比的變化3組SOD、MDA、NO、TNF-α及W/D差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與IR組比較，IPC組SOD、NO高于IR組，而MDA、TNF-α及W/D低于IR組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，IPOST組SOD、NO低于IPC組，而MDA、TNF-α及W/D高于IPC組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

3　討論

缺血預(yù)處理和后處理是機體對于缺血再灌注損傷的一種內(nèi)源性保護(hù)措施，已經(jīng)證實其對心、肝、腦、腎、腸道等器官缺血再灌注損傷有保護(hù)作用。在臨床上肺移植術(shù)后最主要的并發(fā)癥是缺血再灌注損傷(IRI)，本研究選擇采用IPC和IPOST的干預(yù)方案,探討對IRI保護(hù)作用的方法。

表1　各組動物不同時間點PaO2比較(±s)

注：與IR組比較，*P<0.05； 與IPC組比較，△P<0.05。

表2　缺血預(yù)處理、缺血后處理對缺血再灌注的保護(hù)作用比較(±s)

注：與IR組比較，*P<0.05； 與IPC組比較，△P<0.05。

Jun等[12]報道在小動物肺缺血再灌模型中，IPC可以減少IRI，降低模型死亡率。本研究在肺移植模型的缺血-再灌注損傷中，經(jīng)缺血預(yù)處理和后處理干預(yù)，發(fā)現(xiàn)在移植后60 min和120 min時IPC組和IPOST組PaO2均高于IR組，推測IPC和IPOST均有助于提高PaO2，進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)IPC組的PaO2更高，說明IPC對IRI起到更好的保護(hù)作用。有關(guān)研究結(jié)果顯示，缺血再灌注損傷肺泡結(jié)構(gòu)破壞，部分肺泡壁斷裂，肺泡內(nèi)可見大量出血，呈現(xiàn)肺氣腫、水腫及肺不張，W/D升高，表現(xiàn)為肺組織通氣交換功能障礙[13-14]。本研究結(jié)果與其報道一致，IPC組病理損傷相對較輕，表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)不完整、水腫及氣腫較輕，炎癥改變相對較輕，W/D明顯較IR組低，W/D可直接反映肺組織含水量，間接反映肺泡毛細(xì)血管膜通透性的改變，提示在缺血再灌注損傷時IPC可減輕肺毛細(xì)血管損傷，減少肺組織含水量，改善肺換氣功能，本研究進(jìn)一步驗證IPC可能對IRI有保護(hù)作用。

MDA作為脂質(zhì)過氧化物的代謝產(chǎn)物，與體內(nèi)氧自由基生成水平呈正相關(guān)，在一定程度上能反映細(xì)胞損傷的程度[15]。SOD是體內(nèi)抗氧化活化的重要物質(zhì)，能特異性清除超氧自由基，增強機體的抗氧化能力，可促進(jìn)再灌注損傷臟器的恢復(fù)[16]。本研究在缺血再灌注損傷時，經(jīng)比較IPC干預(yù)措施MDA表達(dá)最低,且SOD表達(dá)最高，與IR組、IPOST組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，可能是IPC抑制了氧自由基，減輕了肺泡細(xì)胞的損傷，這一結(jié)果與病理結(jié)果相一致。NO作為體內(nèi)重要的血管活性物質(zhì)，具有舒張血管和局部抗炎的功能[17]，肺內(nèi)主要表達(dá)eNOS，維持肺血管平滑肌適當(dāng)張力，使肺通氣與血流灌注維持恒定，在IRI，血管通透性增強，來源于eNOS的NO表達(dá)降低或是活性降低[18]。本研究顯示，在IRI，IPC組干預(yù)措施NO表達(dá)最高，推測IPC可通過提高機體NO水平，間接抑制中性粒細(xì)胞聚集，減少超氧陰離子的產(chǎn)生，引起內(nèi)源性抗氧化酶等活性增強，從而減輕IR損傷。TNF-α是IR早期促炎細(xì)胞因子，其主要通過促進(jìn)細(xì)胞因子的產(chǎn)生、中性粒細(xì)胞釋放氧自由基和蛋白酶等導(dǎo)致或加重缺血再灌注損傷[19]。本研究顯示，經(jīng)比較IPC干預(yù)措施TNF-α表達(dá)最低，而IR組表達(dá)最高，在IR時，大量細(xì)胞因子激發(fā)中性粒細(xì)胞釋放氧自由基引起肺組織損傷，另外TNF-α是造成肺損傷重要的細(xì)胞因子之一[19]。本研究IPC組中TNF-α表達(dá)較低，可能是IPC時高表達(dá)的SOD抑制了增強機體的抗氧化能力，同時低表達(dá)的TNF-α不足以導(dǎo)致肺組織嚴(yán)重?fù)p傷，因此IPC組的病理損傷表現(xiàn)較輕，死亡率最低。

本研究結(jié)果表明，在新西蘭大白兔肺移植的缺血-再灌注損傷過程中缺血預(yù)處理和后處理方案對再灌注損傷均有保護(hù)作用，但缺血預(yù)處理方案效果最佳。

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(本文編輯楊晨晨)

Comparation of the protective effection between ischemic preconditioning and ischemic postconditioning on lung transplantation ischemia reperfusion injury in Rabbits

WEI Qin1， LIU Yuanyuan2， JIANG Tao1， MA Mei3， ZHANG Chun1， Yiliyaer Xiaheding4， ZHU Hui4

(1XinjiangKeyLaboratoryofMedicalanimalModelResearch,ClinicalMedicalResearchInstitute;2SecondaryDisinfectionSupplyRoom;3TeachingSection;4ThoracicSurgery,theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830054，China)

ObjectiveTo compare the protective effects of ischemic preconditioning and ischemic postconditioning in ischemic reperfusion injury in a rabbit lung transplantation model. Methods48 rabbits were randomly divided into three groups：ischemia reperfusion, ischemic preconditioning, ischemic postconditioning. The PaO2reperfusion after transplantation at 60 min, 120 min were monitored. The pathological changes, serum superoxide dismutase (SOD), malondialdehyde (MDA), nitric oxide (NO), tumor necrosis factor alpha (TNF -α) and lung wet/dry weight ratio were assessed. ResultsAfter the model of left lung transplantation were established successfully，ischemia reperfusion injury were treated by two methods of intervention of ischemic preconditioning and postconditioning . Pathology showed that ischemic preconditioning and postconditioning can reduce lung injury, but ischemic preconditioning was better;There was significant difference in PaO2content at different times (P<0.05). At 60 min, 120min, in IPC and IPOST group, PaO2were higher than that in the IR group, which in IPOST group was lower than that in the IPC group, and the differences were statistically significant (P<0.05); SOD, MDA, NO, TNF-α and W/D in 3 groups were statistically significant different (P<0.05). Compared the IR group, SOD and NO in IPC group was higher while MDA, TNF-α and W/D were lower, and the differences were statistically significant (P<0.05). SOD and NO in IPOST group was less than those in the IPC group, while MDA, TNF-α and W/D were higher than those in IPC group, and the differences were statistically significant (P<0.05). ConclusionBoth ischemic preconditioning and postconditioning can reduce the ischemia reperfusion injury of transplanted lung, and the effects of ischemic preconditioning is stronger.

ischemic preconditioning; ischemic postconditioning； ischemia reperfusion injury； lung transplantation

新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2015211C083)

魏琴(1980-),女，研究生，實驗師，研究方向：動物模型制作。

朱輝,男，博士，主任醫(yī)師，研究方向：心胸疾病的診治，E-mail:zhuhui1973@163.com。

R363

A

1009-5551(2016)10-1281-05

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.017

2016-04-13]