布魯氏菌Omp10蛋白抗原表位的生物信息學(xué)分析

楊　妍， 朱玥潔， 胡金偉， 張峰波， 甫拉提·熱西提, 張春桃， 賈　斌， 龐　盼， 丁劍冰

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1輸血科， 2生殖助孕中心， 3檢驗科， 烏魯木齊　830054； 4新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 烏魯木齊　830011)

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·基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究·

布魯氏菌Omp10蛋白抗原表位的生物信息學(xué)分析

楊妍1， 朱玥潔2， 胡金偉3， 張峰波3， 甫拉提·熱西提4, 張春桃4， 賈斌3， 龐盼3， 丁劍冰4

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院1輸血科，2生殖助孕中心，3檢驗科， 烏魯木齊830054；4新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室， 烏魯木齊830011)

目的用生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測布魯氏菌Omp10蛋白的抗原表位，尋找布魯氏菌Omp10的優(yōu)勢表位。方法利用IEDB在線軟件、DNAStar軟件、ProPred MHC Class-Ⅱ Binding Peptide Prediction Server軟件和SYFPEITHI軟件，通過分子結(jié)構(gòu)、親水性、柔韌性、表面可及性以及抗原指數(shù)等在線分析Omp10蛋白的二級結(jié)構(gòu)、B細(xì)胞抗原表位及T細(xì)胞抗原表位。結(jié)果布魯氏菌Omp10蛋白B細(xì)胞抗原表位有4個，為26-34、65-75、97-102和115-120氨基酸殘基。Omp10蛋白T細(xì)胞抗原表位有6個，為64-79、72-87、104-119、6-21、9-24和78-93氨基酸殘基。結(jié)論通過綜合分析布魯氏菌Omp10蛋白有4個B細(xì)胞抗原表位和6個T細(xì)胞抗原表位，為進(jìn)一步篩選具有一定抗原保護(hù)性和免疫原性的優(yōu)勢表位和多價疫苗構(gòu)建奠定了基礎(chǔ)。

布魯氏菌； Omp10蛋白； 抗原表位

布魯氏菌病(Brucellosis)是公認(rèn)的一種常見的人獸共患疾病，是由布魯氏菌通過皮膚黏膜、呼吸道、消化道傳播感染宿主動物，通過接觸或食入感染動物的分泌物、體液等來建立感染的疾病[1-2]。引起的臨床癥狀有波狀熱[3-5]、睪丸炎[6-7]、脊柱炎、關(guān)節(jié)炎[8-9]、心內(nèi)膜炎等等，可引起人類全身性感染，且不受年齡和性別的影響，臨床癥狀多變，難以控制[10-11]。該病分布廣泛，目前已有170多個國家有該病的發(fā)生和流行。近年來，該病有逐年增多的趨勢，沒有有效的治療方法，使得患者和社會承受了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[12]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展，大量研究表明布魯氏菌的外膜蛋白有很強(qiáng)的免疫原性，可能與布魯氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)存活有關(guān)[13]。為了減少疾病的痛苦與社會的損失，有必要開發(fā)安全有效的疫苗。

Omp10是布魯氏菌重要的免疫原性蛋白，分子量大小為10 ku，屬于菌體外膜脂蛋白，存在于已知所有的種型中。Omp10蛋白具有良好的抗原性與免疫保護(hù)性，不僅可刺激體液免疫而且對細(xì)胞免疫也有刺激作用。在目前疫苗研制過程中，Omp10蛋白被認(rèn)為是一種較為理想的疫苗分子，越來越引起人們的關(guān)注，但是人們對Omp10蛋白的抗原特異性及表位研究較少，故本研究對布魯氏菌Omp10蛋白的抗原表位進(jìn)行了生物信息學(xué)結(jié)構(gòu)分析和預(yù)測。

1　材料與方法

1.1材料Omp10蛋白氨基酸序列：從GenBank中獲得的氨基酸序列：MESMDMKRFRIVAPLAL-

MSLALAACETTGPGSGNAPIIAHTPAGIEGSW-

VDPNGIASSFNGGIFETRTTDTNEKLAEGNYL-

YLSPQLVEINMRSIVRGTTSKVNCALVSPTQL-

NCTSSAGSRFSLTRRNAG，共131個氨基酸。運用IEDB在線分析軟件和DNAStar軟件進(jìn)行B細(xì)胞表位的分析預(yù)測。運用ProPred MHC Class-Ⅱ Binding Peptide Prediction Server軟件和SYFPEITHI軟件在線分析進(jìn)行T細(xì)胞表位預(yù)測。

1.2方法利用Gamier-Robson和Chou-Fasman方法預(yù)測Omp10蛋白的二級結(jié)構(gòu)。利用Emini法預(yù)測特定的氨基酸殘基組成的區(qū)域位于蛋白分子表面的可能性，反映了蛋白抗原內(nèi)外各層殘基的分布情況；利用Hydropathy-Kyte-Doolitte法來預(yù)測蛋白分子的疏水區(qū)和親水區(qū)；利用Karplus-Schulz法來預(yù)測蛋白分子多肽鏈骨架區(qū)的柔韌性；利用Antigenicity-Jameson-Wolf法來預(yù)測潛在的蛋白抗原決定簇。

2　結(jié)果

2.1Omp10 蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測分析

2.1.1IEDB在線軟件預(yù)測分析

2.1.1.1線性表位根據(jù)得分由高到低篩選了5段優(yōu)勢區(qū)段，分別為26-40、42-58、64-76、100-102、112-120(圖1)。

2.1.1.2β轉(zhuǎn)角得分最高的為28-34，其次為29-35、30-36、27-33、47-53、48-54、56-62、114-120、31-37、26-32、115-121(圖2)。高分的位置主要分布在27-37氨基酸區(qū)域。

2.1.1.3表面可及性得分最高的是69-74，其次為65-70、67-72、66-71、68-73、70-75、5-10、97-102、124-129、126-131(圖3)。高分的位置主要集中在65-75氨基酸區(qū)域。

2.1.1.4親水性得分最高的是68-74,其次是67-73、65-71、66-72、26-32、28-34、116-122、27-33、29-35、114-120(圖4)。高分的位置集中在65-74氨基酸區(qū)域。

2.1.1.5柔韌性得分由高到低依次為28-34、29-35、27-33、26-32、97-103、30-36、96-102、98-104、68-74、69-75(圖5)。高分位置主要分布在26-35氨基酸區(qū)域。

2.1.1.6抗原指數(shù)得分高的前10位是103-109、11-17、102-108、82-88、19-25、105-111、81-87、104-110、20-26、80-86氨基酸區(qū)域(圖6)。

圖1　線性表位預(yù)測

圖2　β轉(zhuǎn)角預(yù)測

圖3　表面可及性預(yù)測

圖4　親水性預(yù)測

圖5　柔韌性預(yù)測

圖6　抗原指數(shù)預(yù)測

2.1.2DNAStar軟件預(yù)測分析綜合Gamier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析，Omp10蛋白的α-螺旋優(yōu)勢表位區(qū)段為：1-29、71-79；β轉(zhuǎn)角的優(yōu)勢抗原表位區(qū)段為：24-28、34-41、46-50、55-60、63-68、79-97、101-116、121-126。在α-螺旋和β轉(zhuǎn)角之間分布著13段無規(guī)則卷曲，分別為：27-33、41-45、46-49、50-54、59-63、68-73、76-79、83-87、90-94、97-102、107-111、113-122、123-130。Emini法分析顯示，表面可及性較好的區(qū)段，分別為：1-8、64-75、123-127。Hydropathy-Kyte-Doolitte法分析表明，Omp10蛋白有5段親水性較好的區(qū)域，分別為：1-10、26-34、47-55、61-78、109-130。Karplus-Schulz法分析顯示，Omp10蛋白有8段柔韌性較好的區(qū)段，分別為：27-35、41-54、56-61、64-78、96-102、107-111、113-121、124-126。Antigenicity-Jameson-Wolf法分析顯示，Omp10蛋白抗原指數(shù)較高的區(qū)域有：1-11、26-34、41-55、59-76、94-102、115-130(圖7)。

綜上，根據(jù)兩款軟件的分析結(jié)果，顯示26-34、65-75、97-102、115-120氨基酸殘基區(qū)域可能為潛在B細(xì)胞抗原表位。

圖7　DNAStar分析Omp10蛋白的各項參數(shù)(二級結(jié)構(gòu)、表面可及性、親水性、柔韌性及抗原指數(shù)分析)

2.2Omp10蛋白T細(xì)胞抗原表位的預(yù)測分析為了提高預(yù)測的準(zhǔn)確性，本研究選取等位基因HLA-DRB1*0301，用ProPred MHC Class-ⅡBinding Peptide Prediction Server軟件在線分析得出9-17、88-103段出現(xiàn)了優(yōu)勢表位(圖8)。運用SYFPEITHI軟件在線分析，得分最高的區(qū)段為64-79，其次為72-87、104-119、6-21、9-24、78-93、71-86、89-104、45-60、52-67(圖9)。根據(jù)這兩款軟件的分析結(jié)果，顯示64-79、72-87、104-119、6-21、9-24、78-93氨基酸殘基區(qū)域為潛在T細(xì)胞抗原表位。

3　討論

布魯氏菌屬胞內(nèi)寄生菌，可在機(jī)體內(nèi)長期存活。急性期患者如得不到及時有效的治療，往往會轉(zhuǎn)為慢性感染，機(jī)體很難再將該病菌徹底清除，然而長期服用抗菌藥物很容易產(chǎn)生耐藥性。因此，預(yù)防布魯氏菌病最有效的途徑是對易感動物和人群進(jìn)行疫苗接種。減毒活疫苗是目前公認(rèn)的預(yù)防措施，具有良好的免疫效果，但卻難以廣泛開展，原因是普遍存在毒性較大、無法區(qū)分人工免疫與自然感染等問題，而表位疫苗可以解決這些問題，所以研究者們將關(guān)注的重點逐漸轉(zhuǎn)移到表位疫苗上，如馬秀敏等[14]通過對AgB1抗原表位預(yù)測分析為研制包蟲病表位疫苗提供了理論依據(jù)。李江英等[15]為研制抗結(jié)核疫苗對Rv1410c結(jié)核分枝桿菌抗原表位進(jìn)行分析預(yù)測。通過對抗原表位的預(yù)測，可為篩選優(yōu)勢的表位疫苗奠定基礎(chǔ)。表位也被稱為抗原決定簇，是決定抗原的特異性的化學(xué)基團(tuán)，是刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體并能夠被其識別的部位。表位可分為B細(xì)胞表位和T細(xì)胞表位。B細(xì)胞表位主要位于抗原分子表面，能與未經(jīng)抗原呈遞細(xì)胞加工的抗原發(fā)生反應(yīng)，誘導(dǎo)體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生特異性抗體；T細(xì)胞表位是短線性肽，從MHC分子抗原呈遞給T細(xì)胞受體與細(xì)胞免疫反應(yīng)相關(guān)聯(lián)[16]。線性表位由肽鏈上順序連續(xù)的氨基酸組成。完整蛋白的抗體可以與模擬這種表位的短線性肽結(jié)合，由于結(jié)合力弱且并不含完整天然蛋白的構(gòu)象，所以只能代表復(fù)雜表位的一部分。線性表位多見于T細(xì)胞表位和部分B細(xì)胞表位?？乖砦豢梢酝ㄟ^生物信息學(xué)分析預(yù)測，本研究對Omp10蛋白的抗原表位進(jìn)行預(yù)測，單參數(shù)預(yù)測的正確率不是很高，所以通常要綜合考慮多種參數(shù)[17]。

圖8　ProPred MHC Class-ⅡBinding Peptide Prediction Server軟件在線分析優(yōu)勢表位

圖9　SYFPEITHI軟件在線分析得分區(qū)段

在蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋和β-折疊的氫鍵鍵能高，形成穩(wěn)定的剛性結(jié)構(gòu)，在蛋白質(zhì)內(nèi)部起骨架作用且不易變形，不易與抗體結(jié)合。相反，轉(zhuǎn)角和卷曲區(qū)域的氫鍵鍵能低，易形成盤旋、扭曲等松散的柔性結(jié)構(gòu)出現(xiàn)在蛋白質(zhì)抗原表面，利于與抗體結(jié)合，易形成抗原表位。預(yù)測Omp10蛋白抗原表位的多個參數(shù)包括表面可及性、親水性、柔韌性及抗原指數(shù)。表面可及性是指蛋白抗原內(nèi)、外殘基的分布情況，其反映了氨基酸殘基被溶劑分子接觸的可能性，表面可及性越大越易形成表位。蛋白親水部位與抗原表位有著密切的聯(lián)系，親水性殘基主要位于蛋白質(zhì)表面，而疏水性殘基主要包埋在蛋白質(zhì)的內(nèi)部。蛋白質(zhì)的多肽骨架具有折疊和彎曲的能力，也就是蛋白質(zhì)的柔性區(qū)域。柔韌性高的氨基酸殘基即靈活性強(qiáng)的位點容易形成抗原表位。抗原指數(shù)分析表明了抗原的免疫原性區(qū)域，潛在的占主導(dǎo)地位的表位很有可能位于高抗原指數(shù)區(qū)域。結(jié)合蛋白的多個參數(shù)各自的閾值，綜合其峰值可預(yù)測其表位[18]，并提高準(zhǔn)確率。本研究通過IEDB在線預(yù)測分析軟件預(yù)測的B細(xì)胞抗原表位位于26-35、65-75、97-102、114-120、126-129共5個氨基酸殘基區(qū)域。DNAStar軟件分析預(yù)測的Omp10蛋白B細(xì)胞抗原表位可能位于26-34、47-55、59-61、64-75、96-102、109-111、115-121、123-126共8個氨基酸殘基區(qū)域。由于IEDB在線預(yù)測分析軟件和DNAStar軟件在分析抗原指數(shù)參數(shù)時不盡相同，可能與不同軟件的分析方法不一致有關(guān)系，所以結(jié)合兩款軟件的分析結(jié)果，顯示26-34、65-75、97-102、115-120氨基酸殘基區(qū)域可能為潛在B細(xì)胞抗原表位。根據(jù)這兩款軟件的分析結(jié)果，顯示64-79、72-87、104-119、6-21、9-24、78-93氨基酸殘基區(qū)域為潛在T細(xì)胞抗原表位。64-79、72-87、104-119、6-21、9-24、78-93氨基酸殘基區(qū)域為潛在T細(xì)胞抗原表位。

表位疫苗的研究和開發(fā)是一項困難而有針對性的工作，疫苗制備的關(guān)鍵步驟是獲得所需信息相關(guān)的抗原表位，表位疫苗是根據(jù)抗原表位的氨基酸序列產(chǎn)生的。隨著生物信息學(xué)技術(shù)的發(fā)展，表位預(yù)測技術(shù)有了顯著的提高，多種方法多參數(shù)預(yù)測大大提高了抗原表位的預(yù)測準(zhǔn)確度。在目前研究中，Omp10的這些表位可以作為新的疫苗候選，為有效疫苗的開發(fā)提供新的途徑，為預(yù)防布魯氏菌病感染奠定一定的實驗基礎(chǔ)。

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(本文編輯王艷)

Bioinformatics analysis of Brucella′s Omp10 antigen epitope

YANG Yan1， ZHU Yuejie2， HU Jinwei3， ZHANG Fengbo3， Pulati Rexiti4, ZHANG Chuntao4， JIA Bin3，PANG Pan3， DING Jianbing4

(1DepartmentofBloodTransfusion，2DepartmentofReproductiveFertilityCenter，3DepartmentofClinicalLaboratory，theFirstAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity，Urumqi830054，China；4DepartmentofImmunology,SchoolofPreclinicalMedicine,XinjiangMedicalUniversity,Urumqi830011,China)

ObjectiveTo predicte the dominant epitopes of brucella Omp10 protein by bioinformatics analysis. MethodsThe secondary structure, B cell antigen epitope and T cell antigen epitope of OMP10 protein were infered from the molecular structure, hydrophily, flexibility, the surface accessibility, antigen index via the IEDB software, DNAStar software, ProPred MHC Class-Ⅱ Binding Peptide Prediction Server software and SYFPEITHI software online. ResultsOmp10 protein contains four B cell antigen epitopes(consist of 26-34, 65-75, 97-102 and 115-120 amino acid residues, respectively) and six T cell antigen epitopes(composed by 64-79, 72-87, 104-119, 6-21, 9-24 and 78-93 amino acid residues, separately). ConclusionThe results will provide a key clue for screening dominate epitope and constructing multivalent vaccines for the prevention of brucellosis.

Brucella； Omp10 protein； epitope

國家自然科學(xué)基金(81560322)； 新疆維吾爾自治區(qū)自然科學(xué)基金(2015211C100)； 新疆醫(yī)科大學(xué)科學(xué)創(chuàng)新基金(XYDCX201507)

楊妍(1983-)，女，碩士，主管技師，研究方向：布魯氏菌感染疾病的研究。

作者簡介：朱玥潔(1987-),女，在讀碩士，研究方向：生殖免疫。

丁劍冰,女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：感染免疫和生殖免疫研究，E-mail: djbing002@sina.com。

S852.61

A

1009-5551(2016)10-1261-06

10.3969/j.issn.1009-5551.2016.10.013

2016-02-18]