葡萄皮渣多酚提取及其對五種食源性致病菌的抑制作用

聶相珍，申麗媛

（揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225127）

葡萄皮渣多酚提取及其對五種食源性致病菌的抑制作用

聶相珍，申麗媛

（揚州大學 旅游烹飪學院，江蘇 揚州 225127）

以葡萄皮渣為原料，采用乙醇溶液對葡萄皮渣中的多酚類物質進行浸提，用Folin-Ciocalteu法測定多酚含量，通過單因素及正交試驗得出浸提的最佳工藝條件為：乙醇體積分數(shù)45%，浸提溫度48℃，浸提時間8 h，料液比1∶15（g∶mL），多酚得率為：16.48 mg/g。采用濾紙片法進行葡萄皮渣多酚的抑菌試驗，發(fā)現(xiàn)其對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）都有一定的抑菌作用，其中對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果最好。

葡萄皮渣；多酚；乙醇浸提；抑菌活性

葡萄皮渣中富含酚類物質，如沒食子酸、原花青素、兒茶素、鞣酸及白藜蘆醇等［1-4］。近年來，很多研究證實了這些酚類物質具有多種生物活性，如延緩衰老、抗癌、抗氧化、抑制微生物生長、抗病毒等［5-10］。我國葡萄產(chǎn)量位居世界水果產(chǎn)量的前列［11］，大部分釀酒葡萄皮渣用于生產(chǎn)飼料和肥料，有的釀酒廠則將葡萄皮渣直接丟棄，造成資源浪費，并且也給環(huán)境帶來沉重的壓力［12-13］。而法國、西班牙、意大利等葡萄酒大國其大部分葡萄酒渣都已被應用到食品、醫(yī)學等領域，具有一定的市場規(guī)模，70%以上的釀酒葡萄廢棄物都得到了很好地利用［11］。研究和解決葡萄廢棄物的利用問題，不僅可產(chǎn)生很高的經(jīng)濟價值和社會價值［14］，而且有利于葡萄酒產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

目前，葡萄皮渣中多酚類物質的提取方法主要有溶劑提取法［15］、（主要包括浸漬法、煎煮法、滲漉法、回流提取法）、超聲波輔助提取法［16-17］、微波輔助提取法［18］、生物酶水解提取法［19］、超臨界流體萃取法［20］、大孔吸附樹脂純化法［21］等。其中，溶劑提取法由于對操作設備要求簡單、產(chǎn)品得率較高、低成本等原因成為目前應用最為廣泛的方法；因此，本實驗采用溶劑提取法中的乙醇浸提法從釀酒剩余的赤霞珠葡萄皮渣中提取多酚物質，優(yōu)化提取工藝，并探究其對金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、志賀氏菌（Shigella）、單增李斯特菌（Listeria monocytogenes）、沙門氏菌（Salmonella）、大腸桿菌（Escherichia coli）的抑制作用，以期為新型食品防腐劑的開發(fā)提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

赤霞珠葡萄皮渣：市售。

志賀氏菌、沙門氏菌、單增李斯特菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌：實驗室保存。

無水乙醇（分析純）：北京化工廠；福林酚（Folin-Ciocalteu）、沒食子酸（分析純）：北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5 g/L，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

1.2儀器與設備

BS2443電子分析天平：北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；85-2A數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：上海璽袁科學儀器有限公司；FZ102微型植物粉碎機：上海書培實驗設備有限公司；722G可見分光光度計：上海精密科學儀器有限公司；PYX-DHS-50×60-BS-Ⅱ隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海躍進醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1乙醇浸提法提取葡萄皮渣中的多酚類物質

原料預處理：將釀酒下腳料赤霞珠葡萄皮渣，經(jīng)分離、陰干后，將葡萄皮渣放入50℃的烘箱中干燥2 h，烘干后，粉碎得到葡萄皮渣干粉，備用。

單因素試驗：稱取一定量的葡萄皮渣粉末置于錐形瓶中，按一定的料液比加入適當體積分數(shù)的乙醇溶液，封口，在適當溫度下水浴浸提一段時間。分別考察料液比（1∶7、1∶9、1∶11、1∶13、1∶15、1∶17（g∶mL））、乙醇體積分數(shù)（30%、40%、50%、60%、70%）、浸提溫度（30℃、35℃、40℃、45℃、50℃）和浸提時間（3 h、5 h、7 h、9 h、11 h）對葡萄皮渣中多酚得率的影響。

1.3.2正交試驗

在單因素試驗結果的基礎上，以葡萄皮渣中多酚物質得率（Y）為評價指標，對乙醇體積分數(shù)（A）、浸提溫度（B）、浸提時間（C）和料液比（D）進行優(yōu)化正交試驗，確定最佳的提取條件。正交試驗因素與水平見表1。

表1　葡萄皮渣多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for extraction process optimization of grape pomace polyphenols

1.3.3Folin-Ciocalteu法測定多酚含量

沒食子酸標準曲線的繪制：準確稱10 mg沒食子酸于燒杯中，制成0.1g/L的標準溶液。準確移取100μL、200 μL、400 μL、600 μL、800 μL沒食子酸標準溶液于10 mL的棕色容量瓶中，用雙蒸水補充至2.0mL。然后再加入福林酚試劑1.0 mL和質量分數(shù)為26.7%的Na2CO3飽和溶液4.0 mL，充分混勻，再加入蒸餾水定容至10 mL。在室溫條件下靜置2 h，在波長760 nm處測定吸光度值（A），最后以沒食子酸的質量濃度（x）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標制作沒食子酸標準曲線。

葡萄皮渣多酚含量的測定：浸提液經(jīng)過旋轉蒸發(fā)濃縮后，用蒸餾水定容至50mL，準確移取50 μL浸提液于10 mL棕色容量瓶中，采用上述福林酚法測定吸光度值，根據(jù)沒食子酸標準回歸方程計算多酚含量及多酚得率。

1.3.4抑菌試驗

菌種的活化：將5種致病菌（金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌）分別接種至牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)24 h。

菌懸液的制備：在活化后的斜面培養(yǎng)基中注入1 mL無菌水，將斜面生長的細菌菌落刮下，振蕩搖勻，小心挑取一環(huán)接入到裝有9 mL無菌生理鹽水的試管中，振蕩、搖勻，制成菌懸液待用。

抑菌試驗：采用無菌操作將滅過菌的培養(yǎng)基傾注于培養(yǎng)皿中，每個培養(yǎng)皿裝15～20 mL（培養(yǎng)皿中培養(yǎng)基厚度約3～5 mm），待培養(yǎng)基凝固，用移液槍移取1 mL金黃色葡萄球菌的菌懸液于培養(yǎng)皿中，涂布均勻，靜置，菌液被充分吸收后，向4 mm滅菌濾紙圓片上注入20 μL配制好的3 mg/mL的葡萄皮渣多酚溶液，立即將濾紙片貼在培養(yǎng)基表面。按照十字形對稱貼4張濾紙圓片，其中3個是注入3 mg/mL的葡萄皮渣多酚溶液，另外的1個是注入20 μL無菌生理鹽水（對照），37℃培養(yǎng)24 h后，取出觀察抑菌圈大小，記錄結果。按照同樣的操作，分別在濾紙圓片上注入5 mg/mL、8 mg/mL、10 mg/mL、12 mg/mL的不同質量濃度葡萄皮渣多酚溶液，考察其抑菌效果。大腸桿菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌重復同樣操作步驟。

2　結果與分析

2.1標準曲線的繪制

橫坐標為沒食子酸的質量濃度（x），縱坐標為波長760 nm處的吸光度值（y），繪制沒食子酸標準曲線，結果如圖1所示。

圖1　沒食子酸標準曲線Fig.1 Standard curve of gallic acid

由圖1可知，沒食子酸標準曲線回歸方程為：y=0.110 33x+ 0.014 26，相關系數(shù)R2=0.999 040，在1～8 mg/L質量濃度范圍內，沒食子酸與吸光度值呈良好的線性關系。

2.2單因素試驗結果

2.2.1料液比對葡萄皮渣多酚得率的影響

由圖2可知，隨著料液比的逐漸增大，葡萄皮渣中多酚得率整體呈上升的趨勢。當料液比＜1∶15（g∶mL）時，多酚得率增加速度快，提取液體積較小時，葡萄皮渣可能與乙醇溶液接觸不充分，導致提取不完全；當料液比到達1∶15（g∶mL）后繼續(xù)增大料液比，多酚得率增加緩慢。因此，選擇料液比為1∶15（g∶mL）進行正交試驗。

圖2　料液比對葡萄皮渣多酚得率的影響Fig.2 Effect of solid-liquid ratio on the yield of polyphenols in grape pomace

2.2.2乙醇體積分數(shù)對葡萄皮渣多酚得率的影響

圖3　乙醇體積分數(shù)對葡萄皮渣多酚得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on the yield of polyphenols in grape pomace

由圖3可知，隨著乙醇體積分數(shù)的逐漸增大，葡萄皮渣中多酚類物質的得率呈先上升后下降的趨勢。當乙醇體積分數(shù)為50%時，葡萄皮渣中多酚類物質的得率達到最大；繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，葡萄皮渣中多酚得率則開始下降。原因可能為多酚類物質的分子結構中存在著酚羥基、羥基等，在植物體內通常與其他物質通過氫鍵連接，而乙醇可以破壞這些氫鍵，當乙醇體積分數(shù)較低時，水的含量相對較大，從而會浸出許多水溶性雜質，多酚類物質得率便較低。隨著乙醇體積分數(shù)增大，多酚類物質得率也增加；而當乙醇體積分數(shù)過高時，可能會使多酚類物質在乙醇溶液中的溶解性降低，反而不利于多酚類物質溶解，導致得率降低。因此，選擇乙醇體積分數(shù)為50%進行正交試驗。

2.2.3浸提溫度對葡萄皮渣中多酚得率的影響

圖4　浸提溫度對葡萄皮渣多酚得率的影響Fig.4 Effect of extraction temperature on the yield of polyphenols in grape pomace

由圖4可知，隨著浸提溫度的升高，葡萄皮中多酚類物質的得率先呈上升趨勢，當浸提溫度為45℃時，多酚得率達到最高；當浸提溫度繼續(xù)提高時，葡萄皮中多酚類物質的得率則呈下降趨勢。通常情況下，隨著溫度的升高，分子運動速率會加快，多酚類物質從葡萄細胞中溶到乙醇溶液中的速度就會加快，得率也會逐漸增大。但是當溫度增大到一定程度時，多酚類物質可能被破壞，致使多酚類物質的得率下降。因此，選擇浸提溫度為45℃進行正交試驗。

2.2.4浸提時間對葡萄皮渣多酚得率的影響

圖5　浸提時間對葡萄皮渣多酚得率的影響Fig.5 Effect of extraction time on the yield of polyphenols in grape pomace

由圖5可知，隨著浸提時間的增加，葡萄皮渣中多酚類物質得率先呈上升趨勢，當浸提時間為7 h時，多酚得率達到最大。隨著浸提時間的繼續(xù)增大，葡萄皮渣中多酚類物質得率逐漸下降。一般情況下，浸提時間越長，溶解于乙醇溶液中的多酚類物質會越多，得率會越大。但是當浸提時間達到一定值時，多酚類物質已大體溶于溶劑乙醇溶液中，長時間加熱可能會使多酚類物質縮合，進而導致多酚得率下降。因此，選擇浸提時間7 h進行正交試驗。

2.3正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果，設計正交試驗因素水平表，采用L9（34）正交試驗設計，正交試驗結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2　葡萄皮渣中多酚提取工藝優(yōu)化正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for extraction process optimization of grape pomace polyphenols

表3　正交試驗結果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiments results

由表2極差R值可知，采用乙醇法提取葡萄皮渣中多酚類物質時，各因素對葡萄皮渣多酚得率影響的大小順序是：B＞D＞C＞A，即浸提溫度＞料液比＞浸提時間＞乙醇體積分數(shù)，最優(yōu)提取方案為A1B3C3D2，即乙醇體積分數(shù)45%，浸提溫度48℃，浸提時間8 h，料液比1∶15（g∶mL）。

由表3方差分析結果表明，乙醇體積分數(shù)、浸提溫度、浸提時間和料液比4個因素的F值均遠高于6.23，對多酚得率均有極顯著影響。而從表中4個因素的F值大小可以看出，F(xiàn)B＞FD＞FC＞FA，即各因素對葡萄皮渣多酚類物質得率影響的主次順序是浸提溫度＞料液比＞浸提時間＞乙醇體積分數(shù)，方差分析結果與極差分析得出的結果一致。

2.4驗證試驗結果

正交試驗理論結果的最優(yōu)方案為A1B3C3D2，而表2中最優(yōu)方案為A1B3C3D3。對兩種方案通過3次平行試驗進行驗證。在A1B3C3D3條件下葡萄皮渣多酚得率為15.71 mg/g，而驗證試驗中，在A1B3C3D2條件下葡萄皮渣多酚得率為16.48 mg/g，因此確定提取的最佳工藝為A1B3C3D2，即乙醇體積分數(shù)45%，浸提溫度48℃，浸提時間8 h，料液比為1∶15（g∶mL）。

2.5葡萄皮渣多酚物質對供試菌的抑菌效果

按照試驗方法，分別測定了不同質量濃度的葡萄皮渣多酚提取物對5種供試菌的抑菌圈大小，考察葡萄皮渣多酚類物質對5種供試菌的抑制效果，試驗結果見表4。

表4　不同質量濃度的葡萄皮渣多酚提取物對供試菌的抑菌效果Table 4 Inhibitory effect of different polyphenol extracts concentrations on tested bacteria

抑菌圈直徑越大，說明抑菌效果越明顯［22］。由表4可知，葡萄皮渣中多酚提取物質量濃度越大，抑菌圈直徑越大，當葡萄皮渣多酚提取物質量濃度為12 mg/mL時，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌和大腸桿菌的抑菌圈直徑分別為17.7mm、18.3mm、13.7mm、13.3mm、14.7 mm。與空白對照相比，葡萄皮渣中多酚提取物對5種致病菌具有明顯的抑菌效果，其中對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果最好，其次是大腸桿菌。

3　結論

本實驗采用乙醇浸提法提取葡萄皮渣中多酚類物質，利用單因素和正交試驗對提取工藝進行了優(yōu)化，并對葡萄皮渣多酚提取物的抑菌效果進行了研究。結果表明，葡萄皮渣多酚的最佳提取工藝為：乙醇體積分數(shù)為45%，浸提溫度為48℃，浸提時間為8 h，料液比為1∶15（g∶mL）。在此條件下，多酚得率為16.48 mg/g。抑菌效果結果表明，葡萄皮渣中的多酚提取物對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌、單增李斯特菌、沙門氏菌和大腸桿菌都表現(xiàn)了明顯的抑菌作用，并且隨著多酚物質質量濃度的增大抑制作用增強，其中對金黃色葡萄球菌和沙門氏菌的抑制效果最好。為葡萄皮渣多酚提取物作為新型天然食品防腐劑的開發(fā)和綜合利用提供理論基礎。

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Extraction of polyphenols in grape pomace and their inhibition on five kinds of food-borne pathogenic bacteria

NIE Xiangzhen，SHEN Liyuan
（School of Tourism and Culinary Science，Yangzhou University，Yangzhou 225127，China）

With the grape pomace as raw material，the polyphenols in grape pomace were extracted by ethanol method，and the polyphenols content was determined by Folin-Ciocalteu method.Through single factor and orthogonal experiments，the optimum process conditions were ethanol 45%，extraction temperature 48℃，extraction time 8 h and solid-liquid ratio 1∶15（g∶ml）.Under the conditions，the polyphenols yield was 16.48 mg/g.The antibacterial activity of grape pomace polyphenols was researched by filtering paper method.Results showed that the polyphenols had a certain inhibitory effect onStaphylococcus aureus，Shigella，Listeria monocytogenes，SalmonellaandEscherichia coli，and the inhibitory effect of the polyphenols onS.aureusandSalmonellawas the optimal.

grape pomace；polyphenols；ethanol extraction；antimicrobial activity

TS262.6

0254-5071（2016）09-0101-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.023

2016-05-23

江蘇省高校自然科學研究計劃項目（No.05KJB150148）

聶相珍（1991-），女，碩士研究生，研究方向為食物成分與人體健康的研究。