核桃粕發(fā)酵乳菌種篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究

張洪禮，徐素云，彭邦遠(yuǎn)，丁筑紅*

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000）

核桃粕發(fā)酵乳菌種篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化研究

張洪禮，徐素云，彭邦遠(yuǎn)，丁筑紅*

（貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550000）

該試驗(yàn)對(duì)乳酸菌發(fā)酵核桃粕乳的不同菌株進(jìn)行篩選，通過(guò)pH值、酸度及感官評(píng)定分析，從9株乳酸菌中篩選出嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）兩株優(yōu)良菌種。研究?jī)芍耆樗峋膹?fù)配比例，并與傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵的核桃粕乳進(jìn)行品質(zhì)對(duì)比。結(jié)果表明，以嗜酸乳桿菌：植物乳桿菌（1∶1）接種發(fā)酵后得到的發(fā)酵核桃粕發(fā)酵乳綜合品質(zhì)最佳，其感官評(píng)分90分，氨基酸態(tài)氮含量57.0 mg/L，活菌總數(shù)7.35×107CFU/mL，經(jīng)發(fā)酵后的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值明顯優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵的核桃粕乳。

發(fā)酵劑；核桃粕乳；嗜酸乳桿菌；植物乳桿菌

核桃（Juglans regialL.）是傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)作物，我國(guó)核桃種植面積與產(chǎn)量均居世界首位，主要分布在云南、貴州、河北等地區(qū)，其中最具代表性的品種有貴州鐵核桃、河北核桃、山西汾陽(yáng)核桃等［1］。核桃具有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，核桃仁中蛋白質(zhì)含量15%左右，脂肪含量約63%，且核桃油中的不飽和脂肪酸大多是人體必需的不飽和脂肪酸，如油酸、亞油酸、亞麻酸和花生烯酸占核桃油總量的90%［2］。核桃仁具有藥食同源的特性，有極高的營(yíng)養(yǎng)保健和藥理作用，且其營(yíng)養(yǎng)易于吸收，對(duì)哮喘病人十分有利，因此核桃被歷代養(yǎng)生學(xué)家和醫(yī)學(xué)家視為益壽精品［3］。

核桃粕是核桃榨油后的副產(chǎn)物，蛋白質(zhì)含量豐富，可達(dá)到53.89%左右［4］，含18種氨基酸且人體必需的8種氨基酸配比合理，接近聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織（food and agriculture organization，F(xiàn)AO）和世界衛(wèi)生組織（worldhealthorganization，WHO）規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)，加之脂肪含量低，完全符合老年人對(duì)食品“四足四低”的要求。目前核桃粕的開(kāi)發(fā)主要用于提取生物活性肽，具有調(diào)節(jié)高血壓、增強(qiáng)抗氧化能力、緩解疲勞等功能［5-8］。在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)方面，其主要用于生產(chǎn)高蛋白核桃粉直接飲用或作為半成品添加在面包、蛋糕等各類(lèi)糕點(diǎn)中，或生產(chǎn)低脂核桃乳或復(fù)合類(lèi)低脂核桃乳，發(fā)酵乳有報(bào)道采用植物乳桿菌、嗜熱鏈球菌等菌種進(jìn)行發(fā)酵［9-11］。本研究多株食用乳酸菌種中篩選出最適菌種發(fā)酵，以期提高核桃粕發(fā)酵乳的營(yíng)養(yǎng)及風(fēng)味品質(zhì)，以滿(mǎn)足市場(chǎng)各類(lèi)人群的需要。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

核桃粕：市售飽滿(mǎn)、無(wú)損壞變質(zhì)核桃，經(jīng)壓榨去油后制得；RB-高脂乳花生奶穩(wěn)定劑：上海健鷹食品科技研究所；無(wú)水乙醚、乙醇、丙酮、異辛烷：天津市賦予精細(xì)化工有限公司；氯化鈉、硫代硫酸鈉、碘化鉀、氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀：成都金山化學(xué)試劑有限公司；硫酸、鹽酸、硼酸：重慶聯(lián)瑞化工有限公司；千里香酚藍(lán)、冰乙酸：成都科龍化工試劑廠(chǎng)；淀粉：徐州人和居食品廠(chǎng)。所用試劑均為分析純。

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、食果糖乳桿菌（Lactobacillus fructivorans）、雙發(fā)酵乳桿菌（Double fermentationofLactobacillus）、短乳桿菌（Lactobacillusbrevis）、戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pedicoccus acidilacticii）、發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum）、德氏乳桿菌乳酸亞種（Lactobacillus delbrueckiisubsp.lactis）：貴州輕化工中心；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus）和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的復(fù)合菌株：中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基：北京陸橋公司；MRS液體培養(yǎng)基、MRS瓊脂培養(yǎng)基：實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2儀器與設(shè)備

HH-S26六孔恒溫水浴鍋：上海梅香儀器有限公司；TU-1810型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)：北京普析通用儀器公司；MLS-3780MLS-3780高壓蒸汽滅菌鍋：杭州亞旭生物科技有限公司；LD4-2型離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠(chǎng)；SKD-800半微量凱式定氮儀：上海旦鼎國(guó)際貿(mào)易有限公司；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；SHP-250型智能生化培養(yǎng)箱：上海興都儀器設(shè)備有限公司。

1.3方法

1.3.1發(fā)酸乳加工工藝流程與操作要點(diǎn)

核桃粕汁的制備［12］：核桃粕與水以1∶8質(zhì)量比，85℃浸泡30 min。

磨漿、過(guò)濾：采用160目篩網(wǎng)過(guò)濾得到核桃粕汁，加入0.2%復(fù)合穩(wěn)定劑后調(diào)配均質(zhì)。

滅菌：121℃恒溫15 min殺菌，冷卻至40℃以下，得到核桃粕汁。

菌株的活化與馴化［13］：將9株菌種進(jìn)行活化復(fù)壯，以3%的接種量（V/V）接種到MRS培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為（37± 1）℃，以24 h內(nèi)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（活菌數(shù)＞106CFU/mL）停止。將活化的9株菌種，分別在核桃乳與MRS培養(yǎng)基體積比0∶10、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、10∶0混合培養(yǎng)基中依次馴化，使菌株在100%樣液中能夠很好的生長(zhǎng)（活菌數(shù)＞106CFU/mL）。

接種［14］：將馴化好的9株乳酸菌液，以3%的接種量（V/V）接種到裝有核桃粕汁樣液的錐形瓶中，

發(fā)酵：在42℃條件下培養(yǎng)發(fā)酵，分析發(fā)酵品質(zhì)變化。

單菌株復(fù)配的研究：將實(shí)驗(yàn)篩選出的優(yōu)良菌株復(fù)配接種培養(yǎng)，通過(guò)理化指標(biāo)與感官分值比較，篩選最佳復(fù)配比。

傳統(tǒng)發(fā)酵劑（保加利亞乳桿菌與嗜熱鏈球菌的復(fù)合菌株）與實(shí)驗(yàn)復(fù)合菌株均在接種量3%、培養(yǎng)溫度42℃、發(fā)酵時(shí)間6 h的條件下制備發(fā)酵核桃乳，比較發(fā)酵液的感官指標(biāo)和理化指標(biāo)［9］。

1.3.2分析方法

感官品質(zhì)評(píng)定：邀請(qǐng)10名專(zhuān)家及工作人員對(duì)發(fā)酵核桃粕乳及發(fā)酵核桃粕復(fù)合乳的感官品質(zhì)進(jìn)行分析滿(mǎn)分100分，核桃粕發(fā)酵乳感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1　核桃粕發(fā)酵乳感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Sensory evaluation standard of fermented walnut dregs milk

感官評(píng)價(jià)模糊數(shù)學(xué)模型的建立［15］：以色澤、香氣、滋味、體態(tài)為因素集，以好、較好、一般、差為評(píng)語(yǔ)集，根據(jù)感官評(píng)定結(jié)果，建立4個(gè)單因素評(píng)價(jià)矩陣，用模糊數(shù)學(xué)評(píng)價(jià)方法對(duì)其進(jìn)行分析。

（1）建立評(píng)判集

對(duì)各菌種發(fā)酵得到的核桃粕乳樣液分別編號(hào)后，根據(jù)表1對(duì)發(fā)酵核桃粕乳的品質(zhì)要求進(jìn)行模糊綜合評(píng)判，建立評(píng)判集。

因素集U=｛色澤u1，香氣u2，滋味u3，組織狀態(tài)u4｝；

評(píng)語(yǔ)集V=｛好，較好，一般，差｝；

（2）權(quán)重的確定

權(quán)重集X=｛0.25，0.25，0.30，0.20｝，即色澤25分，香氣25分，滋味30分，組織狀態(tài)20分，共100分。

（3）模糊關(guān)系綜合評(píng)判集

模糊關(guān)系綜合評(píng)判集Y=X×R，其中X為權(quán)重集，R為模糊矩陣。

加權(quán)綜合性評(píng)分法［16］：取實(shí)驗(yàn)的考察指標(biāo)為因素，則因素集U=｛U1、U2｝，其各因素隸書(shū)函數(shù)，如下：

選取評(píng)價(jià)函數(shù)為Di=a1U1i+a2U2i式中a1，a2權(quán)重系數(shù)。

1.3.3理化及微生物指標(biāo)的測(cè)定

氨基酸態(tài)氮含量：電位滴定法；可溶性固形物含量：折光計(jì)法；pH值：參照GB/T 9724—2007《化學(xué)試劑pH值測(cè)定通則》中方法；酸度：參照GB 541334—2010《乳和乳制品酸度的測(cè)定》中方法。

菌落總數(shù)、大腸菌群、致病菌檢驗(yàn)：參照GB/T4789.21—2003《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)冷凍飲品、飲料檢驗(yàn)》；乳酸活菌數(shù)的測(cè)定：參照GB 4789.35—2010《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》。

2　結(jié)果與分析

2.1單菌株發(fā)酵pH、酸度變化結(jié)果分析

圖1　不同菌種發(fā)酵核桃粕發(fā)酵乳pH值變化曲線(xiàn)Fig.1 pH change curve of fermented walnut dregs milk with different strains

圖2　不同菌種發(fā)酵核桃粕發(fā)酵乳酸度變化曲線(xiàn)Fig.2 Acidity change curve of fermented walnut dregs milk with different strains

由圖1、圖2可知，不同菌種發(fā)酵核桃粕乳的pH值與時(shí)間成負(fù)相關(guān)，其中短乳桿菌的pH變化緩慢，其他8株菌株的pH值降低變化趨勢(shì)相似；不同菌種發(fā)酵酸度變化與時(shí)間大致呈正相關(guān)，其中短乳桿菌的產(chǎn)酸能力較差，而嗜酸乳桿菌桿菌在6 h時(shí)產(chǎn)酸能力最強(qiáng)，其他7株菌株的產(chǎn)酸能力的增強(qiáng)基本趨于一致。各菌種間pH和酸度差異顯著（P＜0.05）。

2.2不同菌株核桃粕發(fā)酵乳感官品質(zhì)的模糊數(shù)學(xué)分析結(jié)果

2.2.1感官評(píng)定結(jié)果及建立模糊矩陣

10名評(píng)價(jià)員對(duì)9種不同菌種的核桃粕發(fā)酵乳樣液進(jìn)行感官評(píng)定，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2　單菌發(fā)酵核桃粕發(fā)酵乳樣液感官評(píng)定結(jié)果Table 2 Sensory evaluation results of fermented walnut dregs milk with single strain fermentation

由表2可知，以編號(hào)為1的發(fā)酵核桃粕乳樣液為例，可建立色澤、香氣、滋味和組織狀態(tài)，4個(gè)單因素的模糊評(píng)價(jià)矩陣：A色澤=［0.5 0.3 0.2 0.0］，A香氣=［0.5 0.4 0.1 0.0］，A滋味=［0.5 0.5 0.0 0.0］，A組織狀態(tài)=［0.4 0.4 0.2 0.0］。把上述對(duì)1號(hào)樣品的4個(gè)單因素評(píng)價(jià)結(jié)果寫(xiě)成一個(gè)模糊矩陣，

同理可得1、2、3、4、5、6、7、8、9樣品的模糊矩陣分別為R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9。

2.2.2確定模糊關(guān)系綜合評(píng)判集

其中Y11=（0.25∧0.5）∨（0.25∧0.5）∨（0.3∧0.5）∨（0.2∧0.4）=0.25∨0.25∨0.3∨0.2=0.3，經(jīng)歸一化處理后得Y1=（0.375，0.375，0.25，0.00）同理得：

Y2=（0.300，0.300，0.300，0.100），Y3=（0.273，0.273，0.273，0.182）

基于前文分析，從深層原則與基礎(chǔ)理念看，近代以來(lái)西方社會(huì)管理的基本要素或基本原則主要有兩個(gè)：一是個(gè)人主義，二是理性主義。

Y4=（0.273，0.273，0.273，0.182），Y5=（0.316，0.316，0.263，0.500）

Y6=（0.375，0.375，0.250，0.000），Y7=（0.300，0.300，0.300，0.100）

Y8=（0.273，0.273，0.273，0.182），Y9=（0.273，0.273，0.273，0.182）

2.2.3模糊綜合評(píng)判總分

設(shè)定感官特殊性：好為100分，較好為80分，一般為60分，較差為40分，可建立感官特殊性數(shù)集V=（100，80，60，40），則樣品的模糊綜合評(píng)判總分為：T=Y×V。得到1號(hào)核桃粕乳：T1=（0.375，0.375，0.25，0.00）×（100，80，60，40）=0.375× 100+0.375×8+0.25×60+0.00×40=82.50分；同理得編號(hào)為2、3、4、5、6、7、8、9的發(fā)酵核桃粕乳樣液模糊綜合評(píng)判結(jié)果為：T2=80.00分，T3=72.80分，T4=72.80分，T5=76.86分，T6= 82.50分，T7=80.00分，T8=72.80分，T9=72.80分。由此可選出嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌發(fā)酵的核桃乳樣總分較高，因此選擇這兩種菌進(jìn)行復(fù)合菌株配比試驗(yàn)。

2.3復(fù)合菌株最佳配結(jié)果分析

2.3.1感官評(píng)定結(jié)果

表3　復(fù)合菌發(fā)酵核桃粕發(fā)酵乳樣液感官評(píng)定結(jié)果Table 3 Sensory evaluation results of fermented walnut dregs milk with multi-strains fermentation

根據(jù)表3數(shù)據(jù)，分別對(duì)10、11、12樣品建立模糊矩陣為R10、R11、R12。

2.3.2確定模糊關(guān)系綜合評(píng)判集

對(duì)其進(jìn)行歸一化處理后得Y10=（0.500，0.500，0.000，0.000），同理得Y11=（0.316，0.316，0.263，0.105），Y12=（0.300，0.300，0.300，0.100）。

2.3.3模糊綜合評(píng)判總分

設(shè)定感官特殊性：好為100分，較好為80分，一般為60分，較差為40分，可建立感官特殊性數(shù)集V=（100，80，60，40），則樣品的模糊綜合評(píng)判總分為：T=Y×V。得到10號(hào)核桃粕乳樣液的總分為：T10=（0.500，0.500，0.000，0.000）×（100，80，60，40）=0.500×100+0.500×80+0.000×60+0.000×40=90.00

同理得編號(hào)為11、12核桃粕乳樣液模糊綜合評(píng)判結(jié)果為：T11=76.86分，T12=76.00分。綜合以上模糊綜合評(píng)判結(jié)果可知，單一菌種嗜酸乳桿菌T1=82.50分，植物乳桿菌T6= 82.50分，得到嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌的單一菌種和復(fù)合菌種發(fā)酵的核桃粕乳樣液的感官質(zhì)量?jī)?yōu)劣順序?yàn)椋篢10＞T1=T6＞T11＞T12。

2.3.4發(fā)酵核桃粕乳的理化指標(biāo)

表4　復(fù)合菌發(fā)酵核桃粕發(fā)酵乳的理化指標(biāo)Table 4 Physicochemical indexes of fermented walnut dregs milk with multi-strains

由表4可知，在相同發(fā)酵條件下，嗜酸乳桿菌與植物乳桿菌接種比例為1∶1情況下，發(fā)酵品質(zhì)較好，可溶性固形物為7.6%，酸度為80°T，氨基酸態(tài)氮含量為57.0 mg/L。通過(guò)發(fā)酵核桃粕乳驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果得出產(chǎn)品的感官評(píng)分最高為90分。

2.4不同發(fā)酵劑菌種發(fā)酵產(chǎn)品比較

根據(jù)感官評(píng)定結(jié)果并結(jié)合模糊數(shù)學(xué)分析方法最終得出：傳統(tǒng)發(fā)酵核桃乳的感官評(píng)分為85.80分，本研究開(kāi)發(fā)的發(fā)酵核桃乳的感官評(píng)分為90分，即本研究開(kāi)發(fā)的核桃粕乳在感官程度上優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵核桃粕乳；由表5可知，本研究開(kāi)發(fā)的核桃粕乳的可溶性固形物含量為7.6%、氨基酸態(tài)氮含量為57.0mg/L、活菌總數(shù)為7.35×107CFU/mL，均優(yōu)于傳統(tǒng)發(fā)酵劑發(fā)酵核桃粕乳；表明本研究篩選的發(fā)酵菌株組合設(shè)計(jì)有更強(qiáng)的生長(zhǎng)活力，菌落總數(shù)、可溶性固形物、氨基酸態(tài)氮、膳食纖維等物質(zhì)含量得到提高。

表5　傳統(tǒng)發(fā)酵和試驗(yàn)核桃粕發(fā)酵乳的理化指標(biāo)比較Table 5 Physicochemical indexes comparison of fermented walnut dregs milk by traditional and experimental fermentation

3　結(jié)論

通過(guò)對(duì)9株乳酸菌及復(fù)合菌株的發(fā)酵特性進(jìn)行分析和篩選。結(jié)果表明：發(fā)酵核桃粕乳最佳復(fù)合發(fā)酵菌株為嗜酸乳桿菌/植物乳桿菌（1∶1），接種量3%本研究開(kāi)發(fā)的核桃粕發(fā)酵乳感官評(píng)分90分，可溶性固形物含量7.6%，酸度80°T，氨基酸態(tài)氮57.0 mg/L，活菌總數(shù)7.35×107CFU/mL，膳食纖維含量5.43%。通過(guò)對(duì)核桃粕發(fā)酵乳的最佳發(fā)酵劑進(jìn)行篩選優(yōu)化，獲得新型核桃粕乳發(fā)酵產(chǎn)品，可進(jìn)一步提高核桃的綜合開(kāi)發(fā)利用水平，提高核桃粕的食用價(jià)值，滿(mǎn)足現(xiàn)階段人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)高品質(zhì)蛋白產(chǎn)品的需求。

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Strains screening and fermentation condition optimization for fermented walnut dregs milk

ZHANG Hongli，XU Suyun，PENG Bangyuan，DING Zhuhong*
（School of Liquor and Food Engineering，Guizhou University，Guiyang 550000，China）

The paper focused on screening lactic acid bacteria for walnut dregs milk fermentation.According to pH and acid determination and sensory evaluation analysis，Lactobacillus acidophilusandLactobacillus plantarumwere the optimal strains among the nine lactic acid bacteria.The compound proportion of the two strains of lactic acid bacteria was studied and the quality of walnut dregs milk was compared with the one fermented by traditional fermentation starter.The results showed thatL.acidophilusandL.plantarumratio 1∶1 exhibited optimal comprehensive quality for fermented walnut dregs milk，the sensory evaluation score was 90，amino acid nitrogen was 57.0 mg/L，bacteria count was 7.35×107CFU/ml，and the nutritional value of the multi-strains fermented milk was superior to those fermented with traditional fermentation starter.

fermentation starter；walnut dregs milk；Lactobacillus acidophilus；Lactobacillus plantarum

TS201.3

0254-5071（2016）09-0180-05doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.041

2016-04-15

黔科合重大專(zhuān)項(xiàng)（［2011］6011號(hào)）

張洪禮（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称芳庸ぁ?/p>

丁筑紅（1966-），女，教授，碩士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏加工與綜合利用。