高效液相色譜法測定車?yán)遄又泄?、葡萄糖及蔗糖含?/h1>

2016-10-22 05:59:33毛善巧黃永春

中國釀造訂閱 2016年9期 收藏

關(guān)鍵詞：車?yán)遄?/a>果糖蔗糖

毛善巧，楊　鋒，黃永春

（1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

高效液相色譜法測定車?yán)遄又泄?、葡萄糖及蔗糖含?/p>

毛善巧1，2，3，楊鋒1，2，3，黃永春1，2，3

（1.廣西科技大學(xué) 生物與化學(xué)工程學(xué)院，廣西 柳州 545006；2.廣西糖資源綠色加工重點實驗室，廣西 柳州 545006；3.廣西高校糖資源加工重點實驗室，廣西 柳州 545006）

采用高效液相色譜法（HPLC）測定車?yán)遄又泄?、葡萄糖及蔗糖的含量。測定方法：Shodex SUGAR系列KS-801（鈉型）色譜柱（8 mm×300 mm，6 μm）、流動相為超純水，流速0.8 mL/min，柱溫80℃，示差折光檢測器（RID）溫度30℃，進(jìn)樣量20 μL，外標(biāo)法定量。該法對果糖、葡萄糖和蔗糖測定的平均回收率分別為99.96%、100.30%、99.26%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為1.54%、0.49%、0.48%，檢出限分別為3.50 μg/mL、4.88 μg/mL、7.50 μg/mL，果糖、葡萄糖和蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.999以上（n=5）。該法可快速準(zhǔn)確的對果糖、葡萄糖和蔗糖定性、定量分析。結(jié)果表明，車?yán)遄庸庵泄?、葡萄糖、蔗糖的含量分別為5.69%、5.83%、0.24%。

車?yán)遄?；高效液相色譜法；測定；蔗糖；葡萄糖；果糖

車?yán)遄樱?］是近年來從美國進(jìn)口的一種水果，其價格昂貴，被譽(yù)為“水果中的鉆石”。車?yán)遄庸饧?xì)膩爽口，汁水濃郁，甜嫩鮮美［2］，營養(yǎng)價值高，醫(yī)療保健價值更高［3］，車?yán)遄雍F量高，能夠促進(jìn)血紅蛋白再生，對貧血患者有一定的補(bǔ)益作用，且性溫、味甜，有調(diào)中益脾、調(diào)氣活血、平肝祛熱之功效。車?yán)遄映缩r食，還可以腌制或用于發(fā)酵飲料［4］和藥酒制備［5］。車?yán)遄又懈缓欠?，但其糖分種類及含量尚少見報道。水果中常見含量較高的糖分有蔗糖、葡萄糖和果糖。蔗糖是人們?nèi)粘Ｉ钪匾臓I養(yǎng)物質(zhì)之一，但過多攝入蔗糖有可能導(dǎo)致肥胖、齲齒、糖尿病等；葡萄糖是生命活動中不可缺少的物質(zhì)，在人體內(nèi)能直接參與新陳代謝過程；果糖的口感和甜度優(yōu)于其他糖且升糖指數(shù)低［6］，被稱為“健康糖”。目前，測定糖類物質(zhì)的方法主要有化學(xué)法［7-8］、近紅外光譜法［9-10］、氣相色譜法［11］、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法［12-18］等。以上方法中，化學(xué)法主要用于測定總糖，且誤差較大；近紅外光譜法的精確度難以達(dá)到HPLC法；氣相色譜法測定糖類物質(zhì)需要衍生，步驟比較繁瑣。HPLC法測定糖類物質(zhì)具有快速、準(zhǔn)確等諸多優(yōu)勢，已被廣泛應(yīng)用于［15-19］食品、飲料、水果中糖類物質(zhì)的分析檢測，是目前監(jiān)測糖類物質(zhì)的常用手段。

該實驗采用糖類化合物分析專用柱，建立了一種能同時測定果糖、葡萄糖、蔗糖含量的HPLC法。以該法準(zhǔn)確測定車?yán)遄又泄恰⑵咸烟羌罢崽堑暮?，為車?yán)遄由罴庸さ於ɑA(chǔ)，同時也為取材車?yán)遄拥难芯刻峁┛煽恳罁?jù)，對車?yán)遄赢a(chǎn)業(yè)的發(fā)展及應(yīng)用都十分有意義。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蔗糖、葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥99.5%）：北京世紀(jì)奧科生物技術(shù)有限公司；新鮮車?yán)遄樱罕镜爻兴徺I；實驗室用水為超純水和去離子水。

1.2儀器與設(shè)備

Waters 1515pump系列高效液相色譜儀（具有針孔進(jìn)樣器）：美國Waters公司；Universal 32R高速臺式冷凍離心機(jī)：德國Hitachi公司。

1.3方法

1.3.1高效液相色譜分析條件

Shodex SUGAR系列KS-801（鈉型）色譜柱（8 mm× 300 mm，6 μm）；流動相為超純水；柱溫80℃；檢測池溫度30℃；檢測器靈敏度為4 mV；流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精確稱取果糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品各0.500 0 g、蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品0.100 0 g，分別用超純水定容于50 mL容量瓶中。用移液管分別準(zhǔn)確吸取果糖和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、2 mL、4 mL、6mL、8mL，全部定容至10mL；分別吸取蔗糖標(biāo)準(zhǔn)液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，全部定容至50 mL。配制得到果糖和葡萄糖質(zhì)量濃度為1.00 g/L、2.00 g/L、4.00 g/L、6.00 g/L、8.00g/L，蔗糖質(zhì)量濃度為0.04g/L、0.08g/L、0.12g/L、0.16g/L、0.20 g/L的標(biāo)準(zhǔn)系列。上機(jī)前均過0.45 μm濾膜。

1.3.3樣品溶液制備

按照文獻(xiàn)［2］中的方法挑選新鮮優(yōu)質(zhì)的車?yán)遄?，去核搗碎。按照文獻(xiàn)［14］的方法提取糖類物質(zhì)，方法修改后簡述如下：稱取2.50g搗碎后的樣品，用10mL體積分?jǐn)?shù)為80%的乙醇溶液研磨，10 000 r/min離心10 min，殘渣加入5 mL提取液再提取，合并上清液，90℃水浴蒸干，定容至50 mL，搖勻，靜置備用。上機(jī)前經(jīng)0.45 μm濾膜過濾。

1.3.4糖含量計算方法

式中：W為糖含量，%；C0為糖分質(zhì)量濃度，g / L；V為樣品溶液體積，m L；m為樣品質(zhì)量，g。

2　結(jié)果與分析

2.1色譜條件的選擇

2.1.1色譜柱及流動相的選擇

采用高效液相色譜法測定蔗糖、葡萄糖及果糖的文獻(xiàn)中大多采用氨基鍵合柱［17］，其流動相為一定比例的乙腈和水。乙腈是一種易揮發(fā)的有毒致癌物質(zhì)，容易對研究人員的身體造成傷害，處理不當(dāng)還會污染環(huán)境；氨基柱固定相上的氨基易與還原糖（葡萄糖、果糖）發(fā)生反應(yīng)，不僅影響柱子壽命［19］，還可能對還原糖的定量分析產(chǎn)生影響。該實驗采用Shodex SUGAR系列KS-801（鈉型）色譜柱，以超純水為流動相，消除以上隱患。

2.1.2色譜柱柱溫的選擇

Shodex SUGAR系列KS-801（鈉型）色譜柱為高溫柱，分析時至少要選擇60℃以上的柱溫，但不能超過85℃，因為溫度過低時水的黏度會比較高，帶來很高的反壓容易損壞色譜柱，而溫度過高，會破壞色譜柱的填料。將柱溫為60℃、70℃、80℃時色譜柱對蔗糖、葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品混合液（蔗糖∶葡萄糖∶果糖=10∶0.7∶0.3）的分離效果進(jìn)行了對比，結(jié)果見圖1。由圖1可知，柱溫為80℃時各峰峰形最好，故選擇柱溫為80℃。

圖1　不同柱溫條件下高效液相色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of different column temperature

2.1.3流動相流速的選擇

色譜柱工作時能承受最大的反壓是5 MPa（≈725 psi），在使用中發(fā)現(xiàn)流速越大，反壓越大，當(dāng)流速達(dá)到0.9 mL/min，反壓達(dá)到682psi。故選擇流速分別為0.5mL/min、0.6mL/min、0.7 mL/min、0.8 mL/min考察流速對分離效果的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，流速對蔗糖、葡萄糖、果糖混合液（蔗糖∶葡萄糖∶果糖=2∶1∶1）的分離效果影響不大，但流速越大，分離速度越快，流速為0.5mL/min時，采集時間需要17min，流速為0.6mL/min時，需要14 min，流速為0.7 mL/min時，需要12 min，流速為0.8 mL/min時，需要11 min，為了提高工作效率，選擇流速為0.8 mL/min。

圖2　不同流速下高效液相色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of different flow velocity

2.1.4檢測器及其參數(shù)的選擇

蔗糖、葡萄糖、果糖在結(jié)構(gòu)上沒有紫外吸收基團(tuán)，因此不能選擇紫外分光光度檢測器檢測，示差折光檢測器是根據(jù)樣品流路與參比流路之間折射率的變化以測定樣品濃度的通用檢測器，適用于糖類檢測，但對溫度變化敏感［20］，要求高于室溫5～10℃。實驗采用示差檢測器檢測，檢測池溫度設(shè)為30℃。檢測器靈敏度的選擇范圍為1～1 024 mV，靈敏度越大，信號響應(yīng)值越高，但噪音也越大，綜合考慮，靈敏度設(shè)置為4 mV。

2.2樣品定性分析

分別將蔗糖、葡萄糖、果糖的某一質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄保留時間和峰面積，然后進(jìn)混合標(biāo)準(zhǔn)液，考察最終色譜條件的分離效果。再將樣品溶液進(jìn)樣5次，記錄保留時間和峰面積，根據(jù)保留時間對樣品各峰定性，各標(biāo)準(zhǔn)液和樣品對應(yīng)峰的保留時間見表1，混合標(biāo)準(zhǔn)液和樣品色譜圖見圖3。

圖3　混合標(biāo)準(zhǔn)液（a）和樣品（b）高效液相色譜圖Fig.3 Chromatogram of mixed standard solution（a）and sample（b）

由表1及圖3可知，蔗糖、葡萄糖及果糖標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時間分別為7.558 min、9.195 min、9.823 min，樣品中峰1、2及3中的出峰時間分別為7.554 min、9.177 min、9.799 min，由此確定樣品中峰1為蔗糖峰，峰2為葡萄糖峰，峰3為果糖峰。在圖2b中，峰1的保留時間之前有一未知峰，按照色譜柱分離原理［21］，確定該未知峰的分子質(zhì)量遠(yuǎn)大于蔗糖分子質(zhì)量，該未知物可能是車?yán)遄又械乃苄院玫亩嗵腔蛘咂渌s質(zhì)，在此不做討論。

表1　蔗糖、葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)品和樣品各峰的保留時間Table 1 Retention time of sucrose，glucose，fructose standard solution and each peak of the sample　min

2.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將各級標(biāo)準(zhǔn)溶液使用0.45 μm微孔濾膜過濾上機(jī)進(jìn)樣，進(jìn)樣20 μL，以標(biāo)樣峰面積（y）為縱坐標(biāo)、標(biāo)樣質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，使用工作站Breeze version 3.30繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合線性回歸方程，按信噪比S/N=3計算出各組分檢測限，結(jié)果見表2。由表2可知，該方法蔗糖、葡萄糖、果糖的檢出限分別為：蔗糖7.50 μg/mL，葡萄糖4.88 μg/mL，果糖3.50 μg/mL。果糖、葡萄糖及蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，說明在所取范圍內(nèi)線性良好。

表2　標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍和檢出限Table 2 Regression equations，correlation coefficients，linear ranges and detection limits

2.4精密度試驗

按樣品測定方法，吸取蔗糖質(zhì)量濃度為0.16 g/L、葡萄糖質(zhì)量濃度為6.00 g/L、果糖質(zhì)量濃度為4.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行精密度實驗，分別連續(xù)進(jìn)樣5次，測定其峰面積，計算峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）考察該方法的精密度，結(jié)果見表3。

表3　精密度試驗結(jié)果Table 3 Results of precision tests

由表3可知，3種糖的RSD值分別為蔗糖0.48%、葡萄糖0.49%、果糖1.54%，均＜5%，表明該方法精密度高。

2.5回收率試驗

采用加標(biāo)樣回收法，取4份5 mL樣品溶液，一份加入5 mL去離子水，另外3份分別加入5 mL蔗糖、葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)液，標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度分別為蔗糖0.04 g/L，葡萄糖2.00 g/L，果糖2.00 g/L。平行測定5次，計算平均值，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，蔗糖、葡萄糖、果糖的平均回收率分別為99.26%、100.03%、99.96%，說明該方法具有較高的準(zhǔn)確度。

表4　加標(biāo)回收率試驗結(jié)果Table 4 Results of standard addition recovery tests

2.6重復(fù)性試驗

分別配制5份樣品溶液，分別測得峰面積，然后根據(jù)回歸曲線峰面積與濃度的關(guān)系式計算樣品中蔗糖、葡萄糖、果糖質(zhì)量濃度，以5次測定值考察該方法的重復(fù)性，結(jié)果見表5。由表5可知，重復(fù)性試驗結(jié)果RSD為0.59%～1.02%，表明該法重現(xiàn)性良好。

表5　重復(fù)性試驗結(jié)果Table 5 Results of reproducibility tests　g/L

2.7樣品中蔗糖、葡萄糖、果糖含量的測定

按照1.3.1中色譜條件，將樣品溶液過濾后進(jìn)樣，測定果糖、葡萄糖、蔗糖的色譜峰峰面積，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計算樣品中各糖分的質(zhì)量濃度，以1.3.4中計算公式計算樣品中各糖分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。結(jié)果見表6。

表6　車?yán)遄又刑穷愇镔|(zhì)種類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 6 Type and mass fractions of sugars in cherry

3　結(jié)論

通過對色譜條件的篩選建立了用Shodex SUGAR系列KS-801（鈉型）色譜柱測定蔗糖、葡萄糖及果糖的HPLC方法。標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999，對精密度、回收率及重復(fù)性試驗的考察證明該方法準(zhǔn)確可靠。此法對蔗糖、葡萄糖、果糖標(biāo)準(zhǔn)混合液分離效果良好，可快速準(zhǔn)確的對樣品中蔗糖、葡萄糖及果糖定性、定量分析。該實驗對車?yán)遄又械恼崽?、葡萄糖及果糖進(jìn)行測定，結(jié)果表明：車?yán)遄又姓崽?、葡萄糖和果糖的總含量達(dá)11.76%，其中果糖和葡萄糖含量較高，分別為5.69%和5.83%，蔗糖含量較少，只有0.24%。

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Determination of fructose，glucose and sucrose contents in cherry by HPLC

MAO Shanqiao1，2，3，YANG Feng1，2，3，HUANG Yongchun1，2，3
（1.Department of Biological and Chemical Engineering，Guangxi University of Science and Technology，Liuzhou 545006，China；2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources，Liuzhou 545006，China；3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes，Liuzhou 545006，China）

HPLC was used to determine the content of fructose，glucose and sucrose in cheery.The operating conditions were confirmed as follows：ShodexSUGARseriesKS-801（Na+）column（8mm×300mm，6 μm），which washeld ata constanttemperature of 80℃，usinga mobile phase composed of pure water at a flow rate of 0.8 ml/min.The refractive index detector temperature was set as 30℃and injection volume 20 μl.The average recovery of fructose，glucose and sucrose determination rate were 99.96%，100.30%，and 99.26%，respectively，the relative standard deviation（RSD）were 1.54%，0.49%，and 0.48%，respectively，and the detection limits were 3.50 μg/ml，4.88 μg/ml，7.50 μg/ml，respectively.The correlation coefficients of sucrose，glucose and fructose were all above 0.999（n=5）.The method can be used for qualitative and quantitative analysis of fructose，glucose and sucrose quickly and accurately.The results showed that the percentage composition of fructose，glucose and sucrose in cheery were 5.69%，5.83%，0.24%.

cheery；high performance liquid chromatography；determination；sucrose；glucose；fructose

O657.7

0254-5071（2016）09-0168-04doi：10.11882/j.issn.0254-5071.2016.09.038

2016-06-28

國家自然科學(xué)基金項目資助（31160348）；廣西高等學(xué)校高水平創(chuàng)新團(tuán)隊及卓越學(xué)者計劃資助（桂教人〔2014〕7號）；廣西科技大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊支持計劃資助；廣西高校糖資源加工重點實驗室開放課題（2015TZYKF04）

毛善巧（1991-），男，碩士研究生，研究方向為糖資源加工技術(shù)及過程強(qiáng)化。

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