基于核酸適配體的熒光法檢測水胺硫磷和丙溴磷

王麗 葉華 桑宏慶 王丹丹

摘要：建立了基于適配體的農(nóng)藥水胺硫磷和丙溴磷的熒光檢測方法。采用可特異性識別水胺硫磷和丙溴磷、且5′ 端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM的核酸適配體（FssDNA），與3′ 末端標(biāo)記猝滅基團(tuán)DABCYL的短鏈序列（QssDNA）互補(bǔ)雜交形成雙鏈結(jié)構(gòu)，熒光基團(tuán)的熒光被淬滅，熒光信號很弱；此時加入靶分子，特異性結(jié)合核酸適配體，引起互補(bǔ)短鏈序列從雙鏈結(jié)構(gòu)中解離，使適配體熒光信號增強(qiáng)，基于此可實現(xiàn)水胺硫磷、丙溴磷的定量檢測。優(yōu)化后的檢測條件為：將終濃度為25 nmol/L FssDNA與50 nmol/L QssDNA在25℃孵育20 min，使二者雜交形成雙鏈適配體探針復(fù)合物，加入等體積的農(nóng)藥樣品孵育60 min，然后檢測體系的熒光信號變化值ΔI。在最佳條件下，ΔI與水胺硫磷和丙溴磷的濃度均在50～500 μmol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。水胺硫磷的檢出限（LOD，3σ）為11.4 μmol/L，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （RSD）為5.8%（n=10）；丙溴磷的檢出限為14.0 μmol/L，RSD為4.9%（n=10）。用于實際水樣中兩種農(nóng)藥的檢測，加標(biāo)回收率為85.8%～95.3%

關(guān)鍵詞 ：核酸適配體； 熒光； 水胺硫磷； 丙溴磷

1 引 言

水胺硫磷（Isocarbophos）是一種速效廣譜的有機(jī)磷殺蟲劑，主要用于防治果樹、水稻和棉花害蟲，禁止用于果、茶、煙、菜、中草藥植物，屬于高毒農(nóng)藥，對人畜的危害很大，主要通過食道、皮膚和呼吸道引起中毒[1，2]。丙溴磷（Profenofos）是一種中等毒性的非內(nèi)吸性廣譜有機(jī)磷殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，對棉花、果樹、水稻、蔬菜等作物上的害蟲有很好的防治效果[3，4]。我國規(guī)定在谷物中水胺硫磷最大殘留限量為0.1 mg/kg，丙溴磷在柑橘和結(jié)球甘藍(lán)中最大殘留限量分別為0.2和0.5 mg/kg[5]。目前，水胺硫磷和丙溴磷的準(zhǔn)確定量分析主要采用色譜法和色譜質(zhì)譜聯(lián)用法，這些方法靈敏度和準(zhǔn)確度較好，但前處理復(fù)雜，需要昂貴的儀器以及專業(yè)人員操作，不適合基層分析實驗室的推廣應(yīng)用。因此，開發(fā)新的農(nóng)藥殘留檢測技術(shù)十分必要。

核酸適配體（Aptamer）[6，7]是通過指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）從體外合成的寡核苷酸庫中篩選得到的，能與靶分子特異性結(jié)合寡核苷酸序列，具有靈敏度高、親和力強(qiáng)、識別靶分子范圍廣、特異性好、易合成等優(yōu)點，在藥物篩選、藥物檢測、疾病診斷、食品分析等方面得到了廣泛應(yīng)用[8，9]。目前，在食品安全領(lǐng)域，通過與納米材料、電化學(xué)、熒光技術(shù)等結(jié)合，適配體已成功應(yīng)用于抗生素、生物毒素、重金屬等的檢測分析[10～17]。在前期的研究中，本課題組利用SELEX技術(shù)成功篩選了兩條識別甲拌磷、丙溴磷、水胺硫磷、氧化樂果的核酸適配體[18]，并對兩條核酸適配體的進(jìn)行了改造，改造后的SS24PJ35 適配體對水胺硫磷和丙溴磷表現(xiàn)出了較高的活性[19]。本研究利用前期改造的SS24PJ35 適配體，采用高靈敏的熒光檢測技術(shù)，初步建立了檢測水胺硫磷和丙溴磷的方法。本方法簡單、快速、成本低、需樣量少，對水胺硫磷和丙溴磷具有較高的特異性，適用于水胺硫磷和丙溴磷農(nóng)藥制劑及高含量農(nóng)藥多殘留的快速檢測。2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Filter Max F3多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；Costar黑色96孔板（美國Costar公司）；LX100手掌性離心機(jī)（江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；WH2微型漩渦混合儀（上海滬西分析儀器廠有限公司）；PHS3B精密pH計（上海虹益儀器有限公司）；TGL16臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）。

水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷、氧化樂果、馬拉硫磷、辛硫磷、甲基對硫磷標(biāo)準(zhǔn)品（上海市農(nóng)藥研究所）；核酸適配體序列：5′FAMAGCTTGCTGCAGCGATTCTTGATCGCCACAGAGCT3′（FssDNA），互補(bǔ)雜交序列：5′CAAGAATCGCTGCAGDABCYL3′（QssDNA1），5′GAATCGCTGCAGCAADABCYL3′（QssDNA2），5′TCGCTGCAGCAAGCTDABCYL3′（QssDNA3）（上海生工生物工程股份有限公司）；三羥甲基氨基甲烷（Tris，純度≥99.9%，美國Sigma公司）；其它試劑均為國產(chǎn)分析純；實驗用水為超純水。緩沖溶液1×Buffer：300 mmol/L NaCl，50 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2，50 mmol/L Tris，pH 8.3。

2.2 實驗方法

2.2.1 QssDNA的選擇 針對FssDNA序列設(shè)計了3條不同雜交部位的互補(bǔ)序列QssDNA1、QssDNA2、QssDNA3，在100 μL含0.5%丙酮的1×Buffer緩沖體系中，分別測定 FssDNA、FssDNA+QssDNA、FssDNA+QssDNA+水胺硫磷、FssDNA+QssDNA+丙溴磷的熒光強(qiáng)度，實驗采用黑色96孔板，在Filter Max F3多功能酶標(biāo)儀上測定熒光信號，激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長535 nm。其中， FssDNA、QssDNA的終濃度均為25 nmol/L，水胺硫磷、丙溴磷的終濃度均為0.5 mmol/L，25℃下，F(xiàn)ssDNA和QssDNA先避光孵育20 min，然后再與農(nóng)藥孵育40 min，進(jìn)行3組平行實驗。

2.2.2 FssDNA與最適QssDNA雜交條件的優(yōu)化 實驗對FssDNA與2.2.1小節(jié)篩選的最適QssDNA雜交的添加比例、孵育時間、孵育溫度進(jìn)行了優(yōu)化。具體操作步驟：取若干1.5 mL離心管，加入26 μL 100 nmol/L FssDNA，再分別加入26 μL一定濃度的最適QssDNA，振蕩混勻，在一定溫度下避光孵育一段時間，制備適配體探針復(fù)合物。然后加入52 μL 1 mmol/L 農(nóng)藥（含1%丙酮的1×Buffer緩沖溶液），常溫下避光孵育40 min，同時以52 μL含有 1%丙酮的1×Buffer緩沖溶液作為對照，進(jìn)行3組平行實驗。取100 μL反應(yīng)液于黑色96孔板中測定熒光強(qiáng)度，對照組的熒光強(qiáng)度為I0，農(nóng)藥組的熒光強(qiáng)度為I，熒光強(qiáng)度變化ΔI=I-I0。

2.2.3 樣品的測定 采集安徽科技學(xué)院人工湖水，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后，配制成含有一定濃度農(nóng)藥（含1%丙酮的1×Buffer緩沖體系）的水樣，在優(yōu)化的實驗條件下進(jìn)行測定，計算回收率。

3 結(jié)果與討論

3.1 實驗原理

檢測原理見圖1。在適配體5′ 末端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán)，設(shè)計了一段與適配體互補(bǔ)雜交的序列，并在3′ 末端標(biāo)記淬滅基團(tuán)DABCYL。當(dāng)適配體與互補(bǔ)序列雜交形成雙鏈時，熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)在空間上接近，發(fā)生熒光能量共振轉(zhuǎn)移，體系熒光信號很弱。當(dāng)水胺硫磷、丙溴磷特異性識別結(jié)合適配體，形成特定的空間結(jié)構(gòu)時，適配體與互補(bǔ)序列解離，導(dǎo)致熒光信號增強(qiáng)。因此可利用熒光強(qiáng)度的變化檢測靶分子。

3.2 不同QssDNA序列的影響

本實驗針對FssDNA序列，設(shè)計了3條與適配體不同部位雜交的互補(bǔ)序列QssDNA1、QssDNA2、QssDNA3，考察了不同序列對測定結(jié)果的影響， 如圖2所示。3條QssDNA序列與FssDNA結(jié)合后，體系熒光強(qiáng)度均發(fā)生不同程度的降低，當(dāng)加入水胺硫磷、丙溴磷農(nóng)藥時，熒光強(qiáng)度又有不同程度的回升。其中QssDNA2對FssDNA的熒光淬滅效果最好，且加入農(nóng)藥后，QssDNA2組的熒光強(qiáng)度變化最大。原因可能是QssDNA1的雜交位點從FssDNA 5′末端第7個堿基開始，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)離的相對較遠(yuǎn)；QssDNA3的雜交位點從第1個堿基開始，理論上淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)離得最近，但可能由于標(biāo)記基團(tuán)本身的空間位阻效應(yīng)，雜交效果并不理想，熒光強(qiáng)度下降最??；QssDNA2的雜交位點從第4個堿基開始，淬滅基團(tuán)與熒光基團(tuán)距離適中，熒光強(qiáng)度下降最大。因此選擇QssDNA2作為雜交序列。

3.3 FssDNA與QssDNA2的比例的優(yōu)化

固定 FssDNA終濃度為25 nmol/L，按照1∶1.0， 1∶1.5， 1∶2.0， 1∶2.5和1∶3.0的濃度比例添加QssDNA2，考察對體系熒光強(qiáng)度的影響。實驗發(fā)現(xiàn)， 對于兩種農(nóng)藥，隨著QssDNA2添加比例的增加，ΔI都逐漸增加，當(dāng)比例達(dá)到1∶2之后ΔI開始降低，尤其丙溴磷組的ΔI下降明顯。可能是當(dāng)QssDNA2的濃度過大時，影響了農(nóng)藥與FssDNA的識別結(jié)合。因此確定FssDNA與QssDNA2最佳添加比為1∶2，即FssDNA終濃度為25 nmol/L，QssDNA2終濃度為50 nmol/L。

3.4 FssDNA與QssDNA2的孵育時間和溫度

固定FssDNA終濃度為25 nmol/L，QssDNA2終濃度為50 nmol/L，在25℃避光孵育10， 20， 30， 40和50 min后進(jìn)行實驗，結(jié)果表明，對于兩種農(nóng)藥，孵育10 min時ΔI較低，可能是孵育時間若太短時FssDNA與QssDNA2不能充分雜交結(jié)合，隨著孵育時間延長，ΔI逐漸升高，但20 min后ΔI趨于穩(wěn)定，因此確定孵育時間為20 min。

在優(yōu)化的實驗條件下， 分別在4℃， 25℃， 35℃制備適配體探針復(fù)合物，加入農(nóng)藥進(jìn)測定熒光信號。對于兩種農(nóng)藥，當(dāng)FssDNA與QssDNA2的孵育溫度為35℃時，ΔI均偏低；孵育溫度為4℃和25℃時，ΔI較高。在25℃條件下，水胺硫磷的ΔI比4℃時略有降低，丙溴磷的ΔI比4℃有較大增加，綜合考慮，選擇孵育溫度為25℃。

3.5 農(nóng)藥與適配體探針復(fù)合物的反應(yīng)時間

在優(yōu)化的條件下，制備適配體探針復(fù)合物，按照2.2.2節(jié)的操作加入52 μL 1 mmol/L 農(nóng)藥后，取100 μL反應(yīng)溶液于黑色96孔板中，每隔20 min測定一次熒光強(qiáng)度，計算ΔI，進(jìn)行3次平行實驗。實驗結(jié)果表明，隨著反應(yīng)時間延長，ΔI逐漸升高；當(dāng)反應(yīng)時間達(dá)到60 min后，ΔI趨于穩(wěn)定。因此，農(nóng)藥的反應(yīng)時間選擇60 min。

3.6 特異性

在優(yōu)化條件下，考察1 mmol/L水胺硫磷、丙溴磷以及其它5種類似物甲拌磷、氧化樂果、馬拉硫磷、辛硫磷、甲基對硫磷對適配體探針復(fù)合物熒光強(qiáng)度的影響，發(fā)現(xiàn)馬拉硫磷、辛硫磷、甲基對硫磷的ΔI很小，可以忽略；甲拌磷、氧化樂果的ΔI稍高，約為水胺硫磷、丙溴磷的ΔI 的10%，是因為本研究使用的FssDNA是由前期工作[18，19]中篩選的識別水胺硫磷、丙溴磷、甲拌磷、氧化樂果的廣譜性適配體改造而來。

3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限和精密度

終濃度為25～700 μmol/L的不同濃度的水胺硫磷、丙溴磷對檢測體系體系熒光響應(yīng)（ΔI）的影響如圖3和圖4所示，可見隨著兩種農(nóng)藥濃度增大，ΔI也逐漸增大，兩種農(nóng)藥均在50～500 μmol/L濃度范圍內(nèi)與ΔI呈良好的線性關(guān)系，水胺硫磷檢測的相關(guān)系數(shù)為0.9917，檢出限（LOD，3σ）為11.4 μmol/L；丙溴磷檢測的相關(guān)系數(shù)為0.9908，檢出限為14.0 μmol/L。對終濃度250 μmol/L的農(nóng)藥平行測定10次，水胺硫磷的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.8%，丙溴磷的RSD為4.9%，表明本方法具有良好的精密度。

3.8 樣品分析

采用本方法，進(jìn)行了水樣中的加標(biāo)回收實驗，結(jié)果見表1，水胺硫磷的加標(biāo)回收率為86.6%～95.3%，丙溴磷檢測加標(biāo)的回收率為85.8%～92.6%。

4 結(jié) 論

本實驗將核酸適配體與高靈敏的熒光檢測技術(shù)有機(jī)結(jié)合，初步建立了一種水胺硫磷和丙溴磷的熒光檢測方法。與氣相色譜法[20]相比，本方法的檢出限偏高，仍需進(jìn)一步優(yōu)化，如對適配體進(jìn)行修飾等。但本方法對水胺硫磷和丙溴磷有一定的特異性和靈敏度，操作簡單、成本低，可用于農(nóng)藥制劑及高含量農(nóng)藥多殘留的快速篩查檢測。

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糙米中50種有機(jī)磷農(nóng)藥殘留量的測定. 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn).GB/T 5009.2072008

Abstract A fluorescence method for detection of isocarbophos and profenofos was established based on the specific recognition of aptamer. The aptamer recognizing isocarbophos and profenofos was labeled with fluorescent label FAM at 5′ end （FssDNA）. When it bound to complementary DNA chain labeled with quenching group DABCYL at 3′ end （QssDNA）， the doublestranded structure would be formed and the fluorescence signals became very weak due to the effect of fluorescence resonance energy transfer. While the QssDNA would be released from the doublestranded structure when the aptamer specifically recognized and bound the targets， and the fluorescence signals of the system would recover. Based on this， isocarbophos and profenofos could be quantitatively detected. The optimized experimental conditions were as follows： firstly， 25 nmol/L FssDNA and 50 nmol/L QssDNA2 were incubated for 20 min at 25℃， then an equal volume of pesticide was added and incubated for another 60 min， then the fluorescence intensity of the system was determined. Under the optimal conditions， the change of the fluorescence intensity of the system （ΔI） showed a linear relationship with the isocarbophos or profenofos concentration in the range of 50 to 500 μmol/L. The limit of detection （LOD， σ） was 11.4 μmol/L for isocarbophos with the relative standard deviation （RSD） of 5.8% （n=10）. The LOD was 14.0 μmol/L for profenofos with RSD of 4.9% （n=10）. The recovery ranged from 85.8% to 95.3% when this method was applied to detect isocarbophos and profenofos in real water samples.

Keywords Aptamer； Fluorescence； Isocarbophos； Profenofos