佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血管新生COX—2、PI3K、AKT與細(xì)胞因子相關(guān)性研究

范為民　李艷　俞志超　葉玲梅

【摘要】 目的：觀察佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠環(huán)氧化酶-2（COX-2）、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）、絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶（AKT）的表達(dá)，以及其與白細(xì)胞介素-6（IL-6）、大鼠白細(xì)胞介素-10（IL-10）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）細(xì)胞因子的關(guān)系。方法：將20只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組）、模型對(duì)照組（MC組），每組10只。MC組每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 ml，復(fù)制佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型，NC組每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射蒸餾水0.1 ml，兩組均給藥18 d。結(jié)果：與NC組比較，MC組足腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組的IL-6、VEGF指標(biāo)也均明顯升高，而IL-10指標(biāo)明顯下降升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組的COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；AKT與IL-6、VEGF呈正相關(guān)。結(jié)論：COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF細(xì)胞因子密切相關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎； 環(huán)氧化酶-2； 磷脂酰肌醇3-激酶； 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶； 血管新生

中圖分類號(hào) R331.32 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 B 文章編號(hào) 1674-6805（2016）6-0146-02

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2016.6.081

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種以滑膜增生、關(guān)節(jié)破壞為主要特征的自身免疫系統(tǒng)疾病?；ぱ字饕±肀憩F(xiàn)為炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管增生。近些年，研究證實(shí)PI3K/AKT通路參與RA滑膜血管增生病變[1]。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）技術(shù)，檢測(cè)佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠血管新生相關(guān)的COX-2、PI3K、AKT的變化，研究其與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎IL-6、IL-10、VEGF等因子之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，體重（200±20）g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)碼：SCXK（滬）2013-0006。

1.2 藥品及試劑

弗氏完全佐劑（美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)），蒸餾水（弋磯山醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供），IL-6試劑盒、IL-10試劑盒、VEGF試劑盒、COX-2試劑盒、PI3K試劑盒、AKT試劑盒（武漢華美生物工程有限公司提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

離心機(jī)（安徽嘉文儀器有限責(zé)任公司），電熱恒溫箱（上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司），洗板機(jī)（雷杜生命科學(xué)股份有限公司），漩渦混合器（其林貝爾儀器制造有限公司），酶標(biāo)儀（雷杜生命科學(xué)股份有限公司）。

1.4 造模方法

將20只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常對(duì)照組（NC組），模型對(duì)照組（MC組），每組10只。MC組每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射弗氏完全佐劑0.1 ml，復(fù)制佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠模型，NC組每只大鼠右后足趾皮內(nèi)注射蒸餾水0.1 ml，兩組均給藥18 d。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

1.5.1 大鼠足腫脹率檢測(cè) 于致炎前、致炎后應(yīng)用排水法分別測(cè)定每只大鼠右后足容積，并計(jì)算出大鼠足腫脹率[腫脹率（%）=（致炎后足容積-致炎前足容積）/致炎前足容積×100%]。

1.5.2 大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)檢測(cè) 于致炎前、致炎后計(jì)算大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)：采用5級(jí)評(píng)分法，四肢關(guān)節(jié)炎指數(shù)之和代表每只大鼠的關(guān)節(jié)炎指數(shù)，積分越高，關(guān)節(jié)癥狀越嚴(yán)重，最高分值為16分。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，關(guān)節(jié)正常無(wú)紅腫；1分，趾關(guān)節(jié)紅腫；2分，趾關(guān)節(jié)和足趾腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的足爪腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹、關(guān)節(jié)嚴(yán)重變形[2]。

1.5.3 大鼠IL-6、IL-10、VEGF、COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)檢測(cè) 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠腹主動(dòng)脈取血，嚴(yán)格按照試劑盒要求，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)大鼠IL-6、IL-10、VEGF、COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0軟件對(duì)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，比較采用t檢驗(yàn)；非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性分析采用多元回歸相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組大鼠足腫脹率和關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較

給藥前，兩組大鼠足腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；給藥后，MC組足腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見(jiàn)表1。

2.2 兩組大鼠IL-6、IL-10、VEGF比較

給藥后，MC組的IL-6、VEGF指標(biāo)均明顯高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；而IL-10指標(biāo)明顯低于NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見(jiàn)表2。

2.3 兩組大鼠COX-2、PI3K、AKT比較

給藥后，與NC組比較，MC組的COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），詳見(jiàn)表3。

2.4 MC組大鼠COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF相關(guān)性分析

MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；AKT與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，詳見(jiàn)表4。

3 討論

RA滑膜血管新生是滑膜炎癥的主要病理特點(diǎn)和病理結(jié)果之一，是造成關(guān)節(jié)破壞的重要原因，防治血管新生成為RA治療的主要靶點(diǎn)[3]。

IL-6主要由單核或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的單核因子，起促炎作用。IL-10主要由T細(xì)胞產(chǎn)生的淋巴因子，起抑炎作用。正常情況下，二者的動(dòng)態(tài)平衡是維持機(jī)體正常免疫功能的必要條件。但是當(dāng)IL-6產(chǎn)生過(guò)高，或IL-10產(chǎn)生相對(duì)過(guò)低，機(jī)體正常免疫功能相對(duì)平衡就被打破，機(jī)體就會(huì)出現(xiàn)異常，從而導(dǎo)致RA等免疫性疾病的發(fā)生。VEGF是一種糖基化分泌性多肽因子，作用于滑膜血管內(nèi)皮，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，增加RA微血管通透性，導(dǎo)致RA血管新生形成和滑膜炎癥、滑膜血管翳程度的加重[4]。因此，IL-6和IL-10動(dòng)態(tài)不平衡及VEGF過(guò)度表達(dá)對(duì)滑膜血管新生及RA病情加重有重要影響。COX-2是環(huán)氧化酶（COX）的亞型，COX-2的選擇性抑制劑可以減輕關(guān)節(jié)炎的新生血管形成[5]。PI3K、AKT是血管生成的重要調(diào)節(jié)因子[6-7]，眾多研究結(jié)果表明，PI3K/AKT信號(hào)通路與RA的滑膜細(xì)胞增殖、血管新生有重要關(guān)系[8-11]。

本研究結(jié)果顯示，MC組足腫脹率、關(guān)節(jié)炎指數(shù)均明顯高于NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組的IL-6、VEGF指標(biāo)明顯升高，而IL-10指標(biāo)明顯下降升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組的COX-2、PI3K、AKT指標(biāo)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；MC組大鼠COX-2與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；PI3K與IL-6、VEGF呈正相關(guān)，與IL-10呈負(fù)相關(guān)；AKT與IL-6、VEGF呈正相關(guān)。研究結(jié)果證實(shí)，血管新生相關(guān)的COX-2、PI3K、AKT與IL-6、IL-10、VEGF細(xì)胞因子有密切相關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]張曉軍，劉健，萬(wàn)磊，等.佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜血管新生與PTEN/PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路的關(guān)系[J].中國(guó)骨傷，2015，28（1）：71-74.

[2] Stenmark K R，F(xiàn)agan K A，F(xiàn)rid M G.Hypoxia-induced pulmonary vascular remodeling： cellular and molecular mechanisms[J].Circ Res，2006，99（7）：675-691.

[3] Rabquer B，Koch A E.NK4 therapy：a new approach to target angiogenesis and inflammation in rheumatoid arthritis[J].Arthritis Res Ther，2013，15（5）：119.

[4] Hah Y S，Koh Y J，Lim H S，et al.Double antiangiogenic protein，DAAP，targeting vascular endothelial growth factor-A and angiopoietins attenuates collagen-induced arthritis[J].Arthritis Res Ther，2013，15（4）：R85.

[5] Evans R.Anti arthritic drugs-SMi conference：dual inhibitors[J].Idrugs the Investigational Drugs Journal，2003，6（6）：552-554.

[6]趙婧，屈藝，母得志.PTEN/PI3K/AKT信號(hào)節(jié)點(diǎn)與血管生成研究進(jìn)展[J].廣東醫(yī)學(xué)，2010，31（19）：2595-2597.

[7]王漢琴，姜宗來(lái).PI3K/Akt信號(hào)通路與血管重建[J].鄖陽(yáng)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，26（5）：320-324.

[8] Wu T，Mohan C.The AKT Axis as a Therapeutic Target in Autoimmune Diseases[J].Endocrine Metabolic and Immune Disorders Drug Targets，2009，9（2）：145-150.

[9]張曉軍.基于PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路探討新風(fēng)膠囊改善佐劑關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜血管新生的機(jī)制[D].武漢：湖北中醫(yī)藥大學(xué)，2014.

[10]阮麗萍，劉健，葛瑤，等.骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨PI3K/Akt-mTOR及Beclin-1自噬通路的表達(dá)及相關(guān)性分析[J].華中科技大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2015，44（4）：429-433.

[11]鄭振中.CD151基因轉(zhuǎn)移對(duì)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和血管新生影響的研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2007.

（收稿日期：2015-10-09）