腺病毒與慢病毒感染牛肌肉原代細(xì)胞的研究

趙璐 付長(zhǎng)振 趙志東等

摘要[目的]比較腺病毒和慢病毒侵染牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞MOI值的差異，選擇較優(yōu)的侵染方式。[方法]從新生牛犢背最長(zhǎng)肌中分離并純化出牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，通過病毒侵染靶細(xì)胞的方法比較腺病毒和慢病毒對(duì)牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的侵染能力，確定最佳感染復(fù)數(shù)（Multiplicity of infection，MOI）。[結(jié)果]成功分離出牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，經(jīng)過體外培養(yǎng)，可以用于細(xì)胞侵染研究；隨著MOI值的增大，腺病毒和慢病毒侵染的細(xì)胞熒光強(qiáng)度均逐漸增強(qiáng)；當(dāng)腺病毒侵染牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的MOI值為3 000，慢病毒侵染靶細(xì)胞的MOI值為300時(shí)，熒光強(qiáng)度均較強(qiáng)，細(xì)胞形態(tài)即將發(fā)生變化。相對(duì)而言，慢病毒較腺病毒更易侵染原代肌肉細(xì)胞，并且熒光強(qiáng)度較強(qiáng)，但侵染效率比較低。[結(jié)論]對(duì)于原代細(xì)胞，選擇慢病毒侵染更為合適。該試驗(yàn)結(jié)果為應(yīng)用腺病毒或慢病毒介導(dǎo)的功能基因在牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中的過表達(dá)或干擾沉默研究提供了參考資料。

關(guān)鍵詞牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞；腺病毒；慢病毒；MOI

中圖分類號(hào)S858.23文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2016）04-147-04

Study on Adenovirus and Lentivirus Infection of Bovine Muscle Primary Cells

ZHAO Lu1， FU Changzhen2， ZHAO Zhidong2， LIU Yongfeng1* et al（1.College of Food Engineering and Nutritional Science， Shaanxi Normal University， Xian， Shaanxi 710062； 2. College of Animal Science and Technology， Northwest A&F University， Yangling， Shaanxi 712100）

Abstract[Objective] The aim was to compare the difference of MOI values between the adenovirus and the lentivirus infected bovine muscle satellite cells， and to select the best method of infection.[Method] Bovine muscle satellite cells were isolated and purified from newborn calf of longissimus muscle， infection ability of adenovirus and lentivirus to bovine muscle satellite cells were compared to determine the optimal MOI.[Result] Bovine muscle satellite cells were successfully isolated， which can be used for the study of cell infection by cultured in vitro. It was found that， with the increase of MOI values fluorescence intensity gradually increased for infected cells， the MOI infection of bovine muscle satellite cells was 3 000 for adenovirus with strong fluorescence. While， lentivirus infection of target cells MOI increased to 300 having strong fluorescence， and morphology will be changed. In comparison， lentivirus more easily than adenovirus infected primary cells， and the fluorescence intensity was stronger， but the infection efficiency was relatively low.[Conclusion] It is appropriate to select lentivirus infection of primary cells. The result provides reference for research of cattle genes function via using denovirus or lentivirus genes mediated bovine muscle satellite cells express or disturbanced in silence.

Key wordsBovine muscle satellite cells； Adenovirus； Lentivirus； MOI

骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞是附著在骨骼肌肌纖維上對(duì)出生后骨骼肌生長(zhǎng)和肌肉再生修復(fù)具有重要作用的一類干細(xì)胞[1]。激活后的肌衛(wèi)星細(xì)胞即為肌肉前體細(xì)胞，經(jīng)過多個(gè)回合的分裂，最后形成肌纖維[2]。肉牛不論是產(chǎn)肉量還是肉品質(zhì)都與骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的數(shù)量、性質(zhì)有密不可分的關(guān)系。出生以后的骨骼肌的生長(zhǎng)主要依靠肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的補(bǔ)充，這些具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞經(jīng)過增殖和分化以后最終融合到已存在的肌纖維中[3]。肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的增殖和分化能力還影響著肌纖維的組織學(xué)特性，因此其對(duì)肉品質(zhì)也有重要影響[4]。

腺病毒最早發(fā)現(xiàn)于1953年，由于它們傾向于感染上皮細(xì)胞而被命名為腺病毒（Adenovirus）。腺病毒是直徑為70～90 nm的無囊膜病毒，呈二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)[5]。根據(jù)宿主范圍的不同，將腺病毒分為哺乳動(dòng)物腺病毒屬（Mastadenovirus）和禽類腺病毒屬（Aviadenovirus）2個(gè)屬。根據(jù)免疫學(xué)、生物學(xué)、生物化學(xué)特性的不同，將其分為A～G 7個(gè)亞種，共有52個(gè)血清型[6]。慢病毒屬（Lentivirus）在分類上屬于逆轉(zhuǎn)錄病毒科，為二倍體RNA病毒。原發(fā)感染的細(xì)胞以淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞為主，導(dǎo)致感染個(gè)體發(fā)病。由于慢病毒感染的主要臨床特點(diǎn)是在出現(xiàn)典型的臨床癥狀以前經(jīng)歷較長(zhǎng)的潛伏期，之后緩慢發(fā)病，因此被稱為慢病毒。例如，人類免疫缺陷病毒（HIV）、猴免疫缺陷病毒（SIV）、馬傳染性貧血（EIA）、貓免疫缺陷病毒（FIV）均隸屬慢病毒屬[7]。隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，腺病毒和慢病毒載體已經(jīng)廣泛用于基因功能以及基因治療的研究。

目前，對(duì)牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的研究相對(duì)較少，也沒有成熟的細(xì)胞系，需要原代培養(yǎng)，并且這種原代培養(yǎng)的細(xì)胞在傳代培養(yǎng)幾代后細(xì)胞狀態(tài)就會(huì)發(fā)生變化，不能繼續(xù)使用。另外，試驗(yàn)也表明很難實(shí)現(xiàn)應(yīng)用脂質(zhì)體介導(dǎo)外源基因高效導(dǎo)入牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞。考慮到病毒載體具有能夠侵染各種難侵染的細(xì)胞以及高侵染效率等優(yōu)點(diǎn)，目前最廣泛應(yīng)用的病毒載體有腺病毒載體和慢病毒載體，由于這2種病毒在使用上各有特點(diǎn)，并且暫沒有發(fā)現(xiàn)應(yīng)用這2種病毒載體介導(dǎo)的外源基因?qū)肱＜∪庑l(wèi)星細(xì)胞來研究基因功能。筆者分離培養(yǎng)原代牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞，獲得高純度與高滴度的慢病毒與腺病毒，然后應(yīng)用這2種病毒分別侵染牛肌肉衛(wèi)星原代細(xì)胞，通過綠色熒光蛋白表達(dá)情況在顯微鏡下觀察不同病毒的侵染效果，確定不同病毒侵染牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的最佳感染復(fù)數(shù)（MOI），旨在為在牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞中應(yīng)用病毒載體介導(dǎo)的基因功能的研究提供參考資料。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1試驗(yàn)材料。牛背最長(zhǎng)肌，取自西北農(nóng)林科技大學(xué)國(guó)家肉牛改良中心良種繁育場(chǎng)的1頭新生秦川牛公牛。

1.1.2試劑。慢病毒Lenti6.3RNAi和腺病毒AdeGFP，均購(gòu)自Invitrogen公司；DMEM、FBS和polybrene，均購(gòu)自Life公司；胎牛血清和馬血清，均購(gòu)自Gibco公司；Ⅰ 型膠原酶和牛血清蛋白（BSA），購(gòu)自Sigma公司。

1.1.3耗材與儀器。細(xì)胞培養(yǎng)瓶，購(gòu)自Corning公司；96孔板，購(gòu)自Thermo Fisher公司；CO2培養(yǎng)箱，為Thermo公司產(chǎn)品；熒光顯微鏡，為Olympus公司產(chǎn)品；離心機(jī)，為Sigma公司產(chǎn)品。

1.2牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞的分離培養(yǎng)參照劉揚(yáng)[4]的方法對(duì)牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞進(jìn)行分離與培養(yǎng)。取新鮮的牛背最長(zhǎng)肌，使用無菌的器械將肌肉塊從胴體上分離后，置于75%的乙醇中浸泡并輕輕振蕩，并在30 s內(nèi)將肌肉塊迅速轉(zhuǎn)移到無菌的PBS中。在超凈臺(tái)中用無菌的PBS將肌肉塊清洗3遍以后，用剪刀和鑷子將肌肉塊上的肌膜等結(jié)締組織剔除干凈，然后將肌肉剪碎成1 mm×1 mm×1 mm左右的小塊。將剪碎的肌肉團(tuán)轉(zhuǎn)移至0.2%的 Ⅰ 型膠原酶中，在37 ℃條件下消化2～3 h。消化到可以將肌肉塊吹散，加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)液（DMEM+10%FBS）終止消化。將終止消化后的懸液以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min。離心結(jié)束后棄去上清液，將下層的細(xì)胞團(tuán)用含10% FBS的DMEM清洗2遍，然后用400目細(xì)胞篩進(jìn)行過濾。

采用QuPetersen等[8]的方法對(duì)肌肉組織中不同的細(xì)胞類群進(jìn)行分離。首先將過濾到的細(xì)胞懸液以1 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄去上清，將細(xì)胞團(tuán)塊用牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞增殖培養(yǎng)液PM（DMEM+20%FBS+10%HS）重懸，加入到培養(yǎng)瓶1中，在37 ℃、含0.5% CO2的飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)。培養(yǎng)2 h后，將懸浮液轉(zhuǎn)移到另一個(gè)培養(yǎng)瓶2中，培養(yǎng)瓶1中貼壁的細(xì)胞在加入PM后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，并將此細(xì)胞類群記為pp1。培養(yǎng)瓶2中的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，又將懸浮液轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)瓶3中，貼壁的細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)并記為pp2。培養(yǎng)瓶3中的細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，將懸浮液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶4中，并將貼壁細(xì)胞記為pp3。用相同的方法得到pp4、pp5和pp6細(xì)胞類群。在此過程中，每2 d更換1次新鮮的PM。最后，分離得到牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞。

1.3腺病毒侵染牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞測(cè)定MOI值牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞用胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，按照1×104 cell/孔接種至96孔板中，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。更換DMEM+2%FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后根據(jù)細(xì)胞數(shù)量以MOI值分別為0、5、10、20、50、100、500、1 000、2 000和3 000，滴加不同量的重組腺病毒AdeGFP懸液，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。6 h后更換PM后繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后置于顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞感染百分率和細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞適合的最佳MOI值。

1.4慢病毒侵染牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞測(cè)定MOI值牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞用胰蛋白酶消化計(jì)數(shù)后，按照1×104cell/孔接種至96孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。更換DMEM+2%FBS+8 μg/mL polybrene培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后根據(jù)細(xì)胞數(shù)量，以MOI值分別為2、5、10、20、50、100、200和300，滴加Lenti6.3RNAi病毒懸液，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。侵染6 h后更換PM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，72 h后顯微鏡下觀察GFP的表達(dá)情況。根據(jù)細(xì)胞侵染百分率和細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞適合的最佳MOI值。

2結(jié)果與分析

2.1牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞分離與培養(yǎng)根據(jù)細(xì)胞貼壁能力的不同，分別將接種后2、24、48、72、96和120 h貼壁的細(xì)胞，在PM中培養(yǎng)至70%匯合度時(shí)，細(xì)胞均呈梭形。從pp1細(xì)胞到pp6細(xì)胞，細(xì)胞的長(zhǎng)軸呈變短的趨勢(shì)，轉(zhuǎn)瓶次數(shù)越多的細(xì)胞類群，貼壁的細(xì)胞需要時(shí)間越長(zhǎng)，其形態(tài)更接近于干細(xì)胞，而轉(zhuǎn)瓶次數(shù)越少的細(xì)胞，能夠很快貼壁的細(xì)胞更接近于成纖維細(xì)胞的形態(tài)。解凍鑒定后的牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞于PM培養(yǎng)基中，在37 ℃、飽和濕度5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從圖1可以看出，牛肌肉衛(wèi)星細(xì)胞呈梭狀貼壁生長(zhǎng)，狀態(tài)良好。

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