白酒中鄰苯二甲酸二乙酯的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法

黃少文，羿利華，孫遠(yuǎn)明,2,3，雷紅濤,2,3，柳春紅,2,3*，沈玉棟,2,3*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東　廣州，510642)　2(廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642)　3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642)

?

白酒中鄰苯二甲酸二乙酯的化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法

黃少文1，羿利華1，孫遠(yuǎn)明1,2,3，雷紅濤1,2,3，柳春紅1,2,3*，沈玉棟1,2,3*

1(華南農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，廣東廣州，510642)2(廣東省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642)3(農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州，510642)

以鄰苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate，DEP)為研究目標(biāo)，以4-氨基鄰苯二甲酸二乙酯為半抗原，通過重氮法偶聯(lián)載體蛋白并免疫動(dòng)物，制備針對DEP的特異性兔多克隆抗體。通過棋盤滴定法和單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，即包被抗原濃度為50ng/mL，4 ℃環(huán)境下包被12h；抗體用T液稀釋；藥物緩沖液選用pH5.4、0.005mol/L的PBS緩沖液；酶標(biāo)二抗用P液稀釋，稀釋度為1/3000；反應(yīng)時(shí)間是：一抗∶二抗=30min：40min?；诖私⒘碎g接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫法檢測DEP。該方法對DEP的最低檢測限(LOD)為3.09ng/mL，檢測范圍(IC20～I(xiàn)C80)為5.93～42.03ng/mL，半抑制濃度(IC50)值為16.57ng/mL，與14種結(jié)構(gòu)類似物及功能類似物交叉反應(yīng)均遠(yuǎn)低于0.5%，通過對白酒樣品添加回收率的測定，證明了該方法的準(zhǔn)確性，適用于白酒中DEP的快速檢測。

鄰苯二甲酸二乙酯；化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫；間接競爭

鄰苯二甲酸二乙酯(diethylphthalate，DEP)屬于鄰苯二甲酸酯類化合物中(phthalicacidesters，PAEs)的一種，主要用于塑料增塑劑、潤滑劑、樹脂溶劑、印刷油墨、膠黏劑、化妝品、農(nóng)藥載體等領(lǐng)域[1]，在生產(chǎn)和加工過程中，作為增塑劑的DEP并未與PVC塑料基質(zhì)或其他產(chǎn)品牢固結(jié)合，隨著這些產(chǎn)品的使用或廢棄，DEP就會不斷的釋放進(jìn)入環(huán)境，成為普遍的環(huán)境污染物[2]，并可通過食物鏈進(jìn)入人體[3-4]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，DEP對生殖系統(tǒng)有損害作用[6-13]。為了減少DEP對人類健康的潛在危害，美國環(huán)?？偩?EPA)將包括DEP在內(nèi)的6種PAEs列為環(huán)境中重點(diǎn)控制的污染物[14]，我國將包括DEP在內(nèi)的3種PAEs類化合物列入優(yōu)先污染物黑名單，世界自然基金會(WWF)公布的68種環(huán)境類激素污染物中也包括了DEP等8種PAEs類化合物[15]，2011年臺灣地區(qū)多種飲料和果汁中先后檢測出高劑量的DEP等PAEs類化合物，同年衛(wèi)生部發(fā)布緊急通告，將包括DEP在內(nèi)的17種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)列入“食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單”[16]。

目前，檢測鄰苯二甲酸二乙酯的方法主要是儀器分析法，包括氣相色譜法[17-18]、氣相色譜-質(zhì)譜法[19-21]和高效液相色譜法[22-25]高效液相色譜-質(zhì)譜法[26]，但這類分析方法儀器昂貴、樣品處理復(fù)雜、分析時(shí)間長，很難滿足現(xiàn)場大規(guī)模及快速檢測。而免疫分析法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、能適應(yīng)大量樣品的快速檢測等特點(diǎn)。此前，已有對鄰苯二甲酸二乙酯酶聯(lián)免疫吸附方法的報(bào)道，ZHANG等[27]報(bào)道了純牛奶、酸奶中DEP含量的間接競爭ELISA方法，檢測限為0.004 9ng/mL。

化學(xué)發(fā)光酶免疫分析法是一種新型的免疫分析方法，該方法在進(jìn)行檢測時(shí)不需要外界光源，減少了背景干擾，可以進(jìn)一步提高檢測的靈敏度，具有簡便、靈敏、無污染等特點(diǎn)[28]。目前尚無化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測DEP的報(bào)道。而白酒在生產(chǎn)過程中由于沒有完全杜絕塑料制品作為輸送管道或以塑料制品來進(jìn)行酒的存儲，致使添加到塑料中的DEP有可能遷移到白酒中對白酒造成污染。因此，有必要加強(qiáng)對白酒中的DEP進(jìn)行監(jiān)測。本研究在合成DEP半抗原及多克隆抗體的基礎(chǔ)上，建立了DEP化學(xué)發(fā)光酶免疫分析方法。該方法對于大規(guī)?？焖俸Y查白酒類食品中的DEP具有實(shí)用價(jià)值。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

MS1漩渦振蕩儀，廣州儀科實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司；星海旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，無錫市星海王生化設(shè)備有限公司；WellwashMK2洗板機(jī)，美國Thermo公司；MultiskanMK3酶標(biāo)儀，美國Thermo公司；96孔可拆卸發(fā)光板，深圳金燦華實(shí)業(yè)有限公司；TGL-16G高速臺式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠生產(chǎn)；移液槍，德國Eppendorf公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠；其他玻璃器皿均為國產(chǎn)。

鄰苯二甲酸二乙酯(Sigma公司)；HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；包被緩沖液(CB液，0.1mol/LpH9.6)：稱取NaHCO31.475g，Na2CO30.845g, 再用去離子水定容至500mL；磷酸緩沖液PBS(pH7.4,0.01mol/L)：稱取8.5gNaCl，2.9gNa2HPO4·12H2O，0.2gKCl，0.2gKH2PO4，再用去離子水定容至1L；PBST：上述PBS基礎(chǔ)上，每1L添加500μL吐溫20(Tween-20)；洗滌液：稱取40gNaCl，15gNa2HPO4·12H2O，3mL吐溫-20，再用去離子水定容至5L；檸檬酸緩沖液(pH5.0, 0.05mol/L)：稱取18.4gNa2HPO4·12H2O，5.11g檸檬酸，溶于1L去離子水；醋酸緩沖液(pH4.0)：稱取29.25gNaCl，2.45gNaAC·3H2O，4.74mLHAC溶于1L去離子水；Tris-HCl緩沖液(0.01mol/LpH7.4)：即T液，Tris1.21g，用800mL去離子水溶解；用1mol/L鹽酸溶液調(diào)節(jié)溶液到所需pH值；用去離子水定容至1L；CLEIA底物液A：Luminol-Na4mg溶于20mL0.1moL/L的T液中；CLEIA底物液B：2mg對碘酚溶于100μL二甲基亞砜(DMSO)，加入4μL3%的雙氧水(H2O2)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1半抗原及抗原合成

取543.5mg4-氨基鄰苯二甲酸(4-APA)溶于14mL無水乙醇，室溫下逐滴加入4mL氯化亞砜，于70 ℃反應(yīng)過夜。反應(yīng)結(jié)束后旋蒸除去反應(yīng)液，得到的粗產(chǎn)物用10mL飽和Na2CO3調(diào)堿，再加入飽和NaCl/乙酸乙酯體系萃取3次，收集有機(jī)相，加無水硫酸鈉粉末于有機(jī)相中除水，使用過濾的方法除去硫酸鈉，得到的有機(jī)相經(jīng)旋蒸濃縮后過硅膠柱(石油醚∶乙酸乙酯=40∶17)，得到黃色固體(半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二乙酯即4-ADEP)，產(chǎn)物經(jīng)薄層層析鑒定純度后，進(jìn)一步用質(zhì)譜(MS)及核磁共振(NMR)進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。通過重氮化法[29]偶聯(lián)載體蛋白BSA和OVA，獲得免疫原4-ADEP-BSA和包被原4-ADEP-OVA，用紫外掃描法對偶聯(lián)物進(jìn)行鑒定[30]。

圖1　鄰苯二甲酸二乙酯半抗原合成設(shè)計(jì)Fig.1　The synthesis of 4-ADEP

1.2.2抗體的制備

合成的4-ADEP-BSA作免疫原免疫。將免疫原用生理鹽水稀釋至1mg/mL(以蛋白濃度計(jì))，分別免疫兩只SPF級1.8～2.2kg雌性新西蘭大白兔，實(shí)驗(yàn)前取陰性血清作為對照。首次免疫用1mg免疫原與等體積的弗氏完全佐劑混合，乳化成油包水結(jié)構(gòu)后使用皮下多點(diǎn)注射。4周后用同樣劑量的免疫原與弗氏不完全佐劑進(jìn)行免疫，隨后每隔3周注射1次直至抗血清效價(jià)穩(wěn)定。最后1次免疫后7天心臟動(dòng)脈取血，采用室溫自然凝固分離抗血清，在4 ℃下放置過夜，12 000r/min離心15min，取上清液即得抗血清，加入等量甘油混勻分裝，于-20 ℃凍存。用間接ELISA法測定上述兔抗血清效價(jià)和抑制。

1.2.3icCLEIA檢測模式的建立

實(shí)驗(yàn)步驟：用包被緩沖液將包被抗原稀釋到最佳使用濃度，加到酶標(biāo)板孔中，100μL/孔，37 ℃(或4 ℃)包被過夜；傾去孔內(nèi)液體，自動(dòng)洗板機(jī)上洗滌2次，每孔加洗滌液300μL，甩干；分別加入封閉緩沖液120μL/孔，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3h；將封閉好的板取出，甩去各孔中的封閉液，再置37 ℃烘箱中0.5h，備用；平衡30min后加入梯度稀釋標(biāo)準(zhǔn)溶液(或樣品提取液)50μL/孔，同時(shí)加入抗體50μL/孔，輕搖混合，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育40min；洗滌5次，甩干；加入100μL/孔羊抗兔IgG-HRP(1/5 000倍稀釋)，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育40min；洗滌5次，甩干；每孔加入化學(xué)發(fā)光顯色液100μL(A、B液等量混勻)，立即用酶標(biāo)儀讀取425nm處的相對發(fā)光值(Relativelightunit,RLU)。

實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化：為使CLEIA方法獲得最好的靈敏度和穩(wěn)定性，本研究用方陣試驗(yàn)法(棋盤滴定)確定包被抗原濃度和抗體稀釋倍數(shù)，以單因素實(shí)驗(yàn)，考察藥物緩沖液、pH、二抗?jié)舛?、競爭反?yīng)時(shí)間等對icCLEIA的影響，并采用RLU0/IC50來對比不同CLEIA反應(yīng)條件下方法靈敏度的差異，RLU0/IC50的值越高，說明方法的靈敏度也越高。在最優(yōu)條件下，以鄰苯二甲酸二乙酯濃度的對數(shù)值IgC為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的發(fā)光值RLU為縱坐標(biāo)，使用Origin8.0軟件，按照RLU-IC50四參數(shù)對數(shù)擬合繪制鄰苯二甲酸二乙酯icCLEIA方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該方法的IC50和線性(IC20～I(xiàn)C80)。

1.2.4icCLEIA特異性分析

采用所建立的方法測定抗鄰苯二甲酸二乙酯多克隆抗體與鄰苯二甲酸二乙酯結(jié)構(gòu)類似物的競爭反應(yīng)，分別計(jì)算鄰苯二甲酸二乙酯結(jié)構(gòu)類似物的IC50，則交叉反應(yīng)率為鄰苯二甲酸二乙酯與其結(jié)構(gòu)類似物的IC50之百分比。交叉反應(yīng)率越高，特異性越差。

1.2.5樣品前處理

稱取一定量白酒于玻璃試管中，40 ℃下氮吹至近干，加入2mL超純水洗1次，后加入6mL正己烷萃取，渦旋1min，靜置2min，收集正己烷層，正己烷重復(fù)萃取1次，合并正己烷層，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，1mL甲醇復(fù)溶，稀釋后用于icCLISA方法進(jìn)行測定。

1.2.6實(shí)際樣品檢測

在白酒樣品中添加不同含量水平的標(biāo)準(zhǔn)品，另設(shè)1個(gè)空白樣本，按照樣品前處理方法對樣品進(jìn)行處理，計(jì)算樣品添加回收率(Recovery，%)和變異系數(shù)(CV，%)。

2　結(jié)果與分析

2.1半抗原合成與鑒定

合成的半抗原4-氨基鄰苯二甲酸二乙酯(4-ADEP)(相對分子質(zhì)量為237)經(jīng)電噴霧質(zhì)譜和核磁共振掃描鑒定圖譜分析結(jié)果(見圖2和圖3)：合成產(chǎn)物的(+)ESI-MS質(zhì)譜圖，出現(xiàn)m/z 238.0的分子離子峰，與鄰苯二甲酸二乙酯半抗原分子質(zhì)量對應(yīng)。1H-NMR(600MHz,CDCl3):7.72 (d, J = 8.44Hz, 1H,CH), 6.72 (d, J = 2.28Hz, 1H,CH), 6.68 (dd, J = 8.45, 2.30Hz, 1H,CH), 4.35 (q, J = 7.16Hz, 2H,CH2), 4.29 (q, J = 7.13Hz, 2H,CH2), 4.20 (s,br, 2H,NH2), 1.32～1.37 (m, 6H, 2CH3)。證明4-氨基鄰苯二甲酸二乙酯合成成功。

圖2　半抗原4-ADEP的ESI-MS圖譜( [M-H]+)Fig.2　The ESI-MS spectrum of 4-ADEP

圖3　半抗原4-ADEP的1H-NHR圖譜Fig.3　The 1H-NHR spectrum of 4-ADEP

2.2人工抗原鑒定

采用重氮化法合成人工抗原，紫外可見光譜掃描鑒定人工抗原。從圖4可以看出，相比半抗原(最大吸收275nm)和載體蛋白(最大吸收280nm)，人工抗原的特征吸收(最大吸收339nm)已經(jīng)發(fā)生明顯的偏移。這是因?yàn)樵谳d體蛋白上成功偶聯(lián)半抗原后，半抗原最大吸收相互疊加，所以紫外光譜中峰形發(fā)生了改變，同時(shí)具備載體蛋白和半抗原的吸收特征。這說明在載體蛋白BSA和OVA上分別連接了半抗原，人工免疫抗原和包被抗原偶聯(lián)成功。

圖4　4-ADEP、蛋白及偶聯(lián)物紫外掃描圖譜Fig.4　The UV-scanning of 4-ADEP，protein and conjugates

2.3抗體的鑒定

采用間接競爭ELISA法測定抗血清效價(jià)為1∶32 000，抗DEP兔多抗具有很高的效價(jià)，對抗血清作效價(jià)抑制曲線，結(jié)果見圖5。從圖5可以看出，抗血清的效價(jià)為32K，抑制率為82.93%，對鄰苯二甲酸二乙酯的特異性較好，因此，說明人工抗原成功誘導(dǎo)兔子體內(nèi)產(chǎn)生免疫應(yīng)答，其體內(nèi)產(chǎn)生了相應(yīng)的抗體，進(jìn)一步證明全抗原合成非常成功，而且純度較高。

圖5　兔抗血清效價(jià)抑制曲線Fig.5　The titer and inhibition curve of rabbit antiserum

2.4鄰苯二甲酸二乙酯icCLEIA方法建立

對影響icCLEIA的實(shí)驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化，通過比較RLU0/IC50值大小(值越大方法的檢測效果越好)[31]，得到最佳反應(yīng)條件，即包被抗原濃度為50ng/mL，4 ℃環(huán)境下包被12h；抗體用T液稀釋；藥物緩沖液選用pH5.4、0.005mol/L的PBS緩沖液；酶標(biāo)二抗用P液稀釋，稀釋度為1/3 000；反應(yīng)時(shí)間是：一抗∶二抗=30min∶40min?；诖藰?gòu)建了鄰苯二甲酸二乙酯的icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如圖6，擬合得到icCLEIA的檢測限為3.09ng/mL，檢測范圍為5.93～42.03ng/mL，半抑制濃度為16.57ng/mL。

圖6　鄰苯二甲酸二乙酯icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6　Sdandard curve of DEP

2.5抗體的特異性研究

對方法的特異性進(jìn)行評價(jià)，其靈敏度(IC50)、交叉反應(yīng)率(CR)，如表1所示?？梢钥闯觯?4種類似物中，除了與鄰苯二甲酸二異丁酯和鄰苯二甲酸二丁酯有一點(diǎn)交叉外，但交叉反應(yīng)率均小于0.5%，與其他藥物均沒有交叉反應(yīng)，表明以鄰苯二甲酸二乙酯抗體建立的icCLEIA方法特異性良好，靈敏度高。

2.6實(shí)際樣品檢測

向陰性樣品中添加0.3、1.0和2.0μg/g的DEP，采用所建立的icCLEIA方法對樣品進(jìn)行檢測，同時(shí)上述樣品同樣采用HPLC進(jìn)行檢測比較， 結(jié)果表明(表2)，icCLEIA方法的樣品回收率在77.3%～94.2%之間，變異系數(shù)均小于12%，HPLC方法的樣品回收率在83.33%～93.12%之間，變異系數(shù)均小于10%，說明所建立的icCLEIA方法的準(zhǔn)確度和精密度好。

表1　鄰苯二甲酸二乙酯結(jié)構(gòu)類似物及功能類似物交叉反應(yīng)率結(jié)果

3　結(jié)論

本文通過優(yōu)化學(xué)發(fā)光酶免疫的各種條件，建立了鄰苯二甲酸二乙酯間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法，該方法的IC50值為16.57ng/mL；樣品回收率在78.9%～93.5%之間，與其他結(jié)構(gòu)類似物未見明顯交叉，檢測范圍為5.93～42.03ng/mL，最低檢測限(LOD)為3.09ng/mL。采用icCLEIA和HPLC兩種方法測定相同添加濃度的樣品，結(jié)果與HPLC法的結(jié)果相符。該方法具有靈敏度高，操作時(shí)間短、操作簡便等特點(diǎn)，適用于白酒樣品中的DEP的大規(guī)模篩查。

表2　實(shí)際樣品添加回收率(n=3)

[1]SCHETTLERTED.Humanexposuretophthalatesviaconsumerproducts[J].InternationalJournalofAndrology，2006,29(1):134-139.

[2]BLISSTV,GARDNER-MEDWINAR.Long-lastingpotentiationofsynaptictransmissioninthedentateareaoftheanaesthetizedrabbitfollowingstimulationoftheperforantpath[J].TheJournalofPhysiology，1973,232:331-356.

[3]劉冊家,向蘭,楊美華.我國環(huán)境中鄰苯二甲酸酯分布狀況研究進(jìn)展[J].中國現(xiàn)代中藥，2008(3):37-40.

[4]張?zhí)N暉,林玲,闞海東,等.鄰苯二甲酸二丁酯的人群綜合暴露評估[J].中國環(huán)境科學(xué)，2007(5):651-656.

[5]EMAM,HARAZONOA,MIYAWAKIE,etal.Embryolethalityfollowingmaternalexposuretodibutylphthalateduringearlypregnancyinrats[J].BulletinofEnvironmentalContaminationandToxicology，1997,58(4):636-643.

[6]LEHMANNKP,PHILLIPSS,SARM,etal.Dose-Dependentalterationsingeneexpressionandtestosteronesynthesisinthefetaltestesofmaleratsexposedtodi(n-butyl)phthalate[J].ToxicologicalSciences，2004,81(1):60-68.

[7]SINGHAR,LAWRENCEWH,AUTIANJ.Teratogenicityofphthalateestersinrats[J].JournalofPharmaceuticalSciences，1972,61(1):51-55.

[8]常兵,劉德瑜,梁玉香,等.鄰苯二甲酸二丁酯對青春期雄性大鼠的生殖毒性研究[J].中國自然醫(yī)學(xué)雜志，2007, 9(3):164-168.

[9]李玲,田曉梅,宋琦如,等.鄰苯二甲酸二丁酯和鄰苯二甲酸二 (2-乙基己基) 酯聯(lián)合染毒對雌性大鼠的生殖毒性[J].環(huán)境與健康雜志，2010,27(10):857-860.

[10] 林玲,王玉柱,丁訓(xùn)誠,等.鄰苯二甲酸二丁酯對斑馬魚胚胎發(fā)育毒性的研究[J].衛(wèi)生研究，2008,37(3):278-280.

[11]張?zhí)N暉,陳秉衡,丁訓(xùn)誠,等.鄰苯二甲酸二丁酯宮內(nèi)和哺乳期染毒對F1 代雄性大鼠的生殖發(fā)育毒性[J].衛(wèi)生研究，2004,33(1):9-14.

[12]WHO/IPCS.Globalassessmentofthestate-of-the-scienceofendocrinedisruptors[M].Geneva:WorldHealthOrganization,2002.

[13]王連生.環(huán)境污染化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,1995:316-318.

[14]EPA.Supplementaryguidanceforconductinghealthriskassessmentofchemicalmixtures(EPA/630/R-00/002)[M].OfficeofResearch&Development,NationalCenterforEnvironmentalAssessment,EnvironmentalProtectionAgency,2000.

[15]林興桃,王小逸,呂文濤,沈婷.鄰苯二甲酸酯代謝研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志,2009(2):182-184.

[16]中華人民共和國衛(wèi)生部.關(guān)于公布食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)和易濫用的食品添加劑名單(第六批)的公告(衛(wèi)生部公告2011年第16號)[EB/OL].2011-06-01.

[17]CINELLIG,AVINOP,NOTARDONATOI,etal.StudyofXAD-2adsorbentfortheenrichmentoftracelevelsofphthalateestersinhydroalcoholicfoodbeveragesandanalysisbygaschromatographycoupledwithflameionizationandion-trapmassspectrometrydetectors[J].FoodChemistry，2014,146(3):181-187.

[18]SUNMeng,DAIJin-na,WANGXiao-fang,etal.DeterminationofphthalateestersinpolyvinylchlorideinfusionbagbystirbarsorptiveextractioncombinedwithGC[J].JournalofSeparationScience，2012,35(24):3 486-3 491.

[19]國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心北京市海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所.GB/T21911—2008食品中鄰苯二甲酸酯的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社,2008.

[20]施雅梅,徐敦明,周昱,等.QuEChERS/高效液相色譜測定食品中17種鄰苯二甲酸酯[J]. 分析測試學(xué)報(bào)，2011(12):1 372-1 376.

[21]YEQing,LIULin-hai,CHENZhong-bao,etal.Analysisofphthalateacidestersinenvironmentalwaterbymagneticgraphenesolidphaseextractioncoupledwithgaschromatography-massspectrometry[J].JournalofChromatographyA，2014,1 329(3):24-29.

[22]佟曉波,李瑩,矯筱曼,等.HPLC法測定化妝品中十六種鄰苯二甲酸酯類化合物[J].香料香精化妝品，2012(3):33-35.

[23]徐振東,金尉,顧娟紅,等.快速液相分析法測定化妝品中鄰苯二甲酸酯類化合物[J].香料香精化妝品，2012(2):33-36.

[24]FANYing-ying,LIUShu-hui,XIEQi-long.Rapiddeterminationofphthalateestersinalcoholicbeveragesbyconventionalionicliquiddispersiveliquid-liquidmicroextractioncoupledwithhighperformanceliquidchromatography[J].Talanta，2014,119(119):291-298.

[25]LIANYuan-pei,QIUXiao-yan,YANGYa-ling.Vortex-assistedliquid-liquidmicroextractioncombinedwithHPLCforthesimultaneousdeterminationoffivephthalateestersinliquorsamples[J].FoodAnalyticalMethods，2014,7(3):636-644.

[26]國家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心北京市海淀區(qū)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)所.GB/T21928—2008食品塑料包裝材料中鄰苯二甲酸酯的測定[S].北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[27]ZHANGMing-cui,YUXiao-na,WANGYue,etal.Ahighlysensitiveindirectcompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassay(ic-ELISA)byantigencoatingfordiethylphthalateanalysisinfoods[J].FoodAnalyticalMethods，2013,6(4):1 223-1 228

[28]金茂俊,邵華,金芬,王靜.化學(xué)發(fā)光免疫分析方法的研究及應(yīng)用[J].農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量與安全,2012(2):42-46.

[29]ZHANGMing-cui,LIUBo-lin,CONGYing,etal.Developmentofhighlyspecificfluorescenceimmunoassayandenzyme-linkedimmunosorbentassayfordetectionofdimethylphthalateinwatersamples[J].FoodandAgriculturalImmunology，2011,22( 4):297-309

[30]LUOLin,SHENYu-dong,WANGHong,etal.Productionofpolyclonalantibodyanddevelopmentofacompetitiveenzyme-linkedimmunosorbentassayforbenzoicacidinfoods[J].FoodAnalyticalMethods，2015,8( 5):1 101-1 111

[31]孫文佳,沈玉棟,孫遠(yuǎn)明,等.化學(xué)發(fā)光酶免疫法檢測豬肉中氯丙嗪殘留[J].分析化學(xué),2012(9):1 397-1 402.

Developmentofanindirectcompetitivechmiluminescenceenzymeimmunoassayfordiethylphthalateinliquor

HUANGShao-wen1,YILihua1,SUNYuan-ming1,2,3,LEIHong-tao1,2,3,LIUChun-hong1,2,3*,SHENYu-dong1,2,3*

1(FoodCollege,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510624,China)2(GuangdongProvincialKeyLaboratoryofFoodQualityandSafety,Guangzhou510642,China)3(LaboratoryofQualityandSafetyRiskAssessmentforAgro-productsonStorageandPreservation(Guangzhou),MinistryofAgriculture,Guangzhou510642,China)

4-Aminodiethylphthalate(4-ADEP)asthehaptenwascoupledtobovineserumalbumin(BSA)orovalbumin(OVA)andthenusedtoimmunizeNewZealandwhiterabbits.Polyclonalantibodywhichshowedspecificbindingtodiethylphthalate(DEP)wasthusobtained,andonthebasisofthis，anindirectcompetitivechemiluminescentenzyme-linkedimmunoassay(icCLEIA)wasdevelopedasfollows.Theoptimalconcentrationofcoatingantigenwas50ng/mLat4 ℃.TsolutionwasusingastheantibodybufferandPBSasthestandardbufferwiththepH5.4.TheIgG-HRPdilutionwas1∶3 000.Theincubationtimefortheprimaryantibodywas30minsandtheIgG-HRPreactiontimewas40mins.Underthebestconditions,theicCLEIAexhibitedalinearworkingrangefrom5.93to42.03ng/mL(IC20-IC80)withthelimitofdetectionof3.09ng/mLandthesensitivityIC50of16.57ng/mL.Thecrossreactivityrateswerelessthan0.5%.Theaveragedrecoveriesofliquorwere77.3%～94.2%.Thecoefficientofvariationofintra-assayandinter-assaywaslessthan12%.Inaddition,theaccuracyoftheassaywasvalidatedbydeterminationoftherecoveryinliquor.ThismethodhasagoodcorrelationwiththeHPLCmethod,whichindicateditshighsensitivityandspecificity.

DEP;chmiluminescence;icCLEIA

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608031

碩士研究生(柳春紅，沈玉棟為通訊作者，E-mail：liuch@scau.edu.cn,syd_tyx@163.com)。

農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估專項(xiàng)

(GJFP201501202)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2013B020204001)

2016-01-29，改回日期：2016-04-03