蒜素與大豆蛋白源巰基肽的二硫鍵結(jié)合物的制備及其表征

陳海橋，張彩猛，華欲飛，孔祥珍

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

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蒜素與大豆蛋白源巰基肽的二硫鍵結(jié)合物的制備及其表征

陳海橋，張彩猛，華欲飛，孔祥珍*

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

蒜素與谷胱甘肽等多肽中的半胱氨酸殘基以二硫鍵形式結(jié)合被認(rèn)為是蔥屬植物發(fā)揮其體內(nèi)生理活性的第一步。蒜素和巰基肽體外均不穩(wěn)定，制備蒜素與巰基的結(jié)合物有利于穩(wěn)定發(fā)揮二者的生理活性。在制備還原或未還原大豆球蛋白、酶解物及其富集的巰基肽基礎(chǔ)上，研究了蒜素與大豆蛋白源巰基肽的二硫鍵結(jié)合物的制備條件。結(jié)果表明：反應(yīng)溫度在24 ℃，反應(yīng)pH 7.0，蒜素∶巰基摩爾濃度比=5∶4，反應(yīng)時(shí)間1h條件下最佳，巰基反應(yīng)完成度均達(dá)到95%以上。相同條件，還原后的蛋白比未還原的蛋白反應(yīng)完成度更大。在最佳條件下，制得相應(yīng)的產(chǎn)物，并對(duì)反應(yīng)前后結(jié)合HPLC、MS-MS進(jìn)行了一定表征，證明了結(jié)合物的結(jié)構(gòu)。

蒜素；巰基肽；制備；表征

流行病學(xué)研究證明長(zhǎng)期食用蔥屬植物(AlliumsativumL.)能降低許多人類疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1]，這主要?dú)w功于其體內(nèi)的有機(jī)硫化物，即大蒜素(二烯丙基硫代亞磺酸酯)及其他硫代亞磺酸酯類[2]。大蒜素是由大蒜破碎后，由體內(nèi)蒜氨酸裂解酶(Alliinase, EC 4.4.1.4)催化蒜氨酸裂解形成[3]。蒜素具有諸多生理功效，如抑菌、抗真菌；抑制胃癌、腸癌、前列腺癌[4]。然而，蒜素在體外極不穩(wěn)定，在20 ℃經(jīng)20 h后幾乎完全分解為各種硫化物[5],這極大地限制了其利用價(jià)值。

生物活性實(shí)驗(yàn)表明，蒜素的生理功效源于其巰基修飾反應(yīng)，在體內(nèi)易和谷胱甘肽、蛋白質(zhì)在內(nèi)的半胱氨酸殘基反應(yīng)生成二硫鍵結(jié)合物。蒜素這些可能的代謝產(chǎn)物與蔥屬植物的生理活性相關(guān)[7]。ZHANG等證明蒜素的巰基二硫鍵結(jié)合物GSSA、CySSA 具有誘導(dǎo)細(xì)胞QR酶表達(dá)，抑制NO釋放的功效[8]。JOSPEDRAZA-CHAVERR發(fā)現(xiàn)，CySSA能改善小鼠體內(nèi)因慶大霉素所致的腎中毒及氧化和亞硝基化應(yīng)激[9]。

巰基肽主要有谷胱甘肽、植物螯合肽、金屬硫蛋白、抗菌肽，以及從蛋白酶解物中分離得到的肽。大豆球蛋白經(jīng)水解制備的大豆多肽營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，易消化，富含半胱氨酸殘基，具有顯著的抗氧化性、自由基清除、解毒作用[6]。富集的巰基肽段半胱氨酸殘基不穩(wěn)定、需保存在酸性低溫環(huán)境，不利于生產(chǎn)與長(zhǎng)期保存。

蒜素與小分子游離巰基如GSH反應(yīng)迅速，受pH影響較大，RABINKOV報(bào)道[10]反應(yīng)米氏常數(shù)K= 3.0 M-1s-1。目前尚無(wú)對(duì)蒜素和蛋白及多肽反應(yīng)條件的報(bào)道，而這對(duì)于相應(yīng)二硫鍵結(jié)合物的制備，以及后續(xù)通過(guò)產(chǎn)物活性證明蒜素可能發(fā)揮活性的機(jī)制有重要作用。本研究制備了大豆蛋白源的球蛋白，并通過(guò)還原、酶解、富集等方法制備了一系列巰基肽。其中以11S蛋白、以11S源富集的巰基肽為代表研究了蒜素和蛋白質(zhì)及多肽的反應(yīng)條件，并以巰基轉(zhuǎn)化率對(duì)反應(yīng)完成率進(jìn)行了表征。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1原料與試劑

低脫脂豆粕，山東禹王集團(tuán)；半胱氨酸(Cys)，谷胱甘肽(GSH)，4,4-二硫二吡啶(DPS)，烯丙基溴，胃蛋白酶(4 000 U/mg)，均購(gòu)自Sigma公司；乙腈為色譜純，購(gòu)自J&K；C18填料購(gòu)自Merck;巰丙基-瓊脂糖 6B填料，購(gòu)自GE Healthcare；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.2儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀1260系列帶紫外檢測(cè)器(variable wavelength detector，VWD)、ZORBAX SB C18色譜柱，美國(guó)Agilent科技有限公司；高速冷凍離心機(jī)，日本 Hitachi 公司；UV-Vis-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)；DELTA320 pH計(jì)，METTLER TOLEDO(上海)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1蒜素的制備

蒜氨酸參照CORBI[11]氧化脫氧蒜氨酸制得，脫氧蒜氨酸參照YU[12]通過(guò)半胱氨酸與烯丙基溴反應(yīng)制得。蒜素通過(guò)蒜酶催化分離而得。

1.2.2大豆球蛋白(11S)的提取

采用堿溶酸沉法制備大豆球蛋白。將脫脂豆粕分散在含10 mmol/L 2-巰基乙醇的30 mmol/L pH 8.0的Tris-HCl緩沖液中，豆粕和緩沖液比例1∶10(g∶mL)。攪拌1.5 h后3層紗布過(guò)濾，取上清液，于9 500 r/min，4 ℃離心30 min。將上清液pH值調(diào)至6.2，在9 500 r/min，4 ℃離心30 min。得到的沉淀分散在水中，調(diào)節(jié)pH 6.2，5 000 r/min，4 ℃離心20 min，重復(fù)2～3次。將得到的沉淀分散于水中，調(diào)節(jié)pH 8.0，冷凍干燥即為11S。

1.2.3巰基肽的制備

用8 mol/L尿素溶液溶解5% 11S，加入30 mmol/L DTT，40 ℃還原1～2 h，還原完后調(diào)節(jié)pH 2.0，用pH 2.0的水進(jìn)行透析2～3 d，期間換水8～10次，即得還原11S。

以還原/未還原的11S為原料，經(jīng)循環(huán)水浴調(diào)節(jié)溫度至37 ℃后預(yù)熱攪拌15 min，調(diào)pH至2.0。分別加入胃蛋白酶(E/S=2%)進(jìn)行恒溫酶解，酶解過(guò)程中不斷攪拌，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸維持pH值恒定。酶解6 h，然后95 ℃水浴滅酶5 min，離心取上清，凍干即得水解物RHP/HP。

參考DING[13]取還原后的水解物RHP，經(jīng)巰丙基-瓊脂糖 6B富集巰基肽，經(jīng)C18柱純化分離出含巰基的肽段EP。

1.2.4蒜素和巰基肽結(jié)合物的制備

配制一定濃度的含大豆蛋白源巰基肽的水溶液，調(diào)節(jié)pH為2.0、3.0、4.0、7.0、8.0，固定反應(yīng)溫度4、15、24、40 ℃，控制巰基肽的巰基含量恒定，添加不同量的蒜素水溶液，使最終反應(yīng)蒜素和巰基濃度摩爾比為0、0.125、0.5、0.75、1、1.25、1.5，控制反應(yīng)時(shí)間0、5、15、30、60、120 min，測(cè)定反應(yīng)過(guò)程巰基含量的變化。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，即不加蒜素溶液，以扣除巰基氧化對(duì)巰基含量的損失。制備過(guò)程如圖1。反應(yīng)完成率按式(1)計(jì)算。

(1)

圖1　蒜素與巰基的制備Fig.1　Preparation of conjugates between allicin and thiols

1.2.5巰基含量的測(cè)定

參照RIENER等[14]的方法采用DPS法測(cè)定酶解物巰基含量，配制一定濃度的樣品，取0.2 mL，加入2.8 mL含有6 mol/L GuHCl，1 mmol/L EDTA的100 mmol/L pH 4.5 醋酸-醋酸鈉緩沖液，加入125 μL的4 mmol/L DPS，室溫反應(yīng)30 min，測(cè)定A324。

1.2.6液相色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；柱溫：35 ℃；紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：214 nm；流動(dòng)相A：超純水(含TFA體積分?jǐn)?shù)為0.1%)，流動(dòng)相B：純乙腈(含TFA體積分?jǐn)?shù)為0.1%)。流速設(shè)為1 mL/min，采用梯度洗脫：初始95% A；0～60 min，線性變換為40% A；60～65 min，線性變換為0%A；65～70 min，線性變換為95% A；70～75 min，維持95% A。流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

1.2.7質(zhì)譜分析

電噴霧離子化源，離子方式 ES+，毛細(xì)管電壓 3.50 kV，錐孔電壓20 V，離子源溫度 110 ℃，脫溶劑氣溫度 400 ℃，碰撞能量 20 eV，質(zhì)量范圍 50～1 000 m/z，脫溶劑氣流速 500 L/h。

1.2.8核磁共振(NMR)分析

取蒜素純樣品溶于氘代三氯甲烷，30 ℃ 下進(jìn)行1H-NMR、13C-NMR 結(jié)構(gòu)鑒定。實(shí)驗(yàn)儀器采用 Varian INOVA-600(600 MHz and 150 MHz，美國(guó) Varian 公司)和AV-300(300 MHz和 75 MHz，瑞士 Bruker 公司)核磁儀。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

研究中，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用Excel 2007 作圖。

2　結(jié)果與討論

2.1TS(蒜素)的表征

分別采取HPLC、ESI-MS-MS、1H-NMR、13C-NMR驗(yàn)證了所制得蒜素的結(jié)構(gòu)與純度。其中，電噴霧離子化質(zhì)譜離子碎片結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2　蒜素的離子碎片F(xiàn)ig.2　Ion fragments of allicin

蒜素的分子式為C6H10OS2，分子質(zhì)量為162，它在質(zhì)譜圖中它的基準(zhǔn)峰是m/z 163.05 [M+H]+，與此同時(shí)還有一系列的特征離子碎片產(chǎn)生。主要特征離子碎片有m/z 120.99 [M-C3H5]+，102.98 [M-C3H7O]+，87.00 [M-C2H3OS]-，73 [M-C3H5OS]+。

HPLC結(jié)果如圖3，峰面積結(jié)果表明蒜素純度大于97%。

圖3　蒜素的HPLC譜圖Fig.3　The HPLC spectrum of allicin

此外，對(duì)TS進(jìn)行了1H-NMR、13C-NMR表征，結(jié)果如下：

1H-NMR (400MHz, CDCl3, δ/ppm):δ3.7～3.9(4H, m，H4a、H4b、H3a、H3b)；δ5.2～5.5(4H, m, H1a、H1b、H6a、H6b); δ5.85～6.65(2H, m，H2&H5)。

13C-NMR (100 MHz, CDCl3, δ/ppm):35.02 (C3, SCH2CH), 59.84 (C4, CHCH2SO), 119.05 (C1, CHCH2), 124.02 (C6, CH2CH), 125.82 (C2, CH2CHCH2), 132.90 (C5, CH2CHCH2)。

2.2反應(yīng)溫度對(duì)巰基與TS反應(yīng)的影響

配制一定濃度11S、RP、EP水溶液，固定反應(yīng)pH 7.0，分別控制溫度在4、15、24、40 ℃下反應(yīng)，反應(yīng)比例為TS和巰基濃度比為理論摩爾比1∶2，反應(yīng)一定時(shí)間，測(cè)定反應(yīng)體系中剩余的巰基含量，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，即不加TS，以扣除巰基氧化對(duì)巰基含量的損失。測(cè)定反應(yīng)前后巰基含量變化。

如圖4-A、圖4-C、圖4-D分別為不同溫度下11S、RP、EP與蒜素反應(yīng)的完成率，可以看出，1h內(nèi)，24 ℃和40 ℃下反應(yīng)基本完成，而4 ℃和15 ℃仍在進(jìn)行，反應(yīng)隨著溫度的上升，進(jìn)行的速度和程度均增大。相比40 ℃，24 ℃反應(yīng)比其慢，但是反應(yīng)60min，二者反應(yīng)程度相當(dāng)?？紤]到40 ℃溫度過(guò)高，對(duì)巰基和TS 的穩(wěn)定性均不利，因此，最佳反應(yīng)溫度為常溫24 ℃。

圖4　溫度對(duì)巰基與蒜素反應(yīng)的影響Fig.4　Effect of different temperatures on reaction between 11S and allicin

其次，經(jīng)過(guò)還原處理的RP和EP在相同條件下，反應(yīng)完成率比11S大得多。如圖圖4-B為不同溫度下11S與蒜素反應(yīng)的空白對(duì)照，即不添加TS反應(yīng)時(shí)11S自身氧化產(chǎn)生的巰基損失。圖4中可以看出，在反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)，各溫度條件下巰基損失很小。

2.3pH值和反應(yīng)時(shí)間對(duì)巰基與TS反應(yīng)的影響

大豆球蛋白(11S)富含半胱氨酸殘基，來(lái)源廣泛，后續(xù)巰基肽均由其還原/水解制備得到，因此選用11S作為巰基來(lái)源代表，與TS進(jìn)行反應(yīng)以研究不同因素的影響。11S等電點(diǎn)在5～6之間，因此選取pH范圍為2.0、3.0、4.0、7.0、8.0，固定反應(yīng)溫度24 ℃，反應(yīng)TS和巰基濃度比為理論摩爾比1∶2，分別反應(yīng)0、5、15、30、60、120 min，測(cè)定反應(yīng)體系中剩余的巰基含量，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照，即不加TS，以扣除巰基氧化對(duì)巰基含量的損失。

圖5　pH值對(duì)不同巰基與蒜素反應(yīng)的影響Fig.5　Effect of different pH on reaction between thiols and allicin

圖5-A、圖5-B、圖5-C分別為不同pH值對(duì)大豆球蛋白11S、巰基肽EP、還原球蛋白R(shí)P與蒜素反應(yīng)的影響。圖5-D為11S與蒜素反應(yīng)的空白對(duì)照，即不加蒜素時(shí)巰基損失。以11S為例，從圖5-A中可以看出，相同條件下，酸性條件反應(yīng)進(jìn)行的速度和程度均小于堿性條件，反應(yīng)完成度由小到大分別為pH 4.0<2.0<3.0<7.0<8.0。可能是因?yàn)楦咏入婞c(diǎn)，蛋白質(zhì)聚集程度大，不利于反應(yīng)的進(jìn)行。

而堿性條件下巰基-二硫鍵交換反應(yīng)更易進(jìn)行，因此反應(yīng)速度和完成率均大于酸性條件。這是因?yàn)樗馑嘏c巰基化合物反應(yīng)的過(guò)程中，巰基鍵能較弱，容易失去 H，同時(shí)大蒜素中的亞砜基又極易捕捉 H，因此大蒜素中的-S(O)S-鍵極易與巰基中的 H 結(jié)合，生成新物質(zhì)。而堿性條件下，-S(O)S-鍵更易發(fā)生斷裂，同時(shí)巰基中S2-的pka值更大，濃度更高，更易攻擊硫代亞磺酸基團(tuán)。

其次，理論上pH 8.0條件下巰基更容易氧化和交換，7.0下反應(yīng)速度和完成率已經(jīng)接近pH 8.0，且7.0更符合水解物的貯藏pH。因此，選取pH 7.0作為反應(yīng)pH。

另外，圖5-A、圖5-B、圖5-C對(duì)比可以看出，在相同條件下，未經(jīng)還原的11S比經(jīng)過(guò)還原的RP及EP反應(yīng)完成率要小，這是因?yàn)樗馑馗菀捉佑|到還原后蛋白的游離巰基的結(jié)果。

2.4反應(yīng)時(shí)間對(duì)巰基與TS反應(yīng)的影響

反應(yīng)時(shí)間在60 min，反應(yīng)完成率基本恒定，巰基損失很小，有利于巰基全部與TS以二硫鍵形式結(jié)合(見(jiàn)圖5-D)。

2.5蒜素與巰基物質(zhì)摩爾濃度比對(duì)巰基與TS反應(yīng)的影響

分別選取5種不同的巰基來(lái)源：11S、還原11S(RP)、11S水解物(HP)、還原11S水解物(RHP)、富集的巰基肽(EP)，調(diào)節(jié)pH 7.0?？刂茙€基濃度相同，改變TS的添加量以控制不同的蒜素與巰基物質(zhì)摩爾濃度比([TS]/[R-SH])0、0.125、0.5、0.75、1、1.25、1.5，在24 ℃下進(jìn)行反應(yīng)60 min；測(cè)定反應(yīng)體系中剩余的巰基含量。

圖6　不同蒜素和巰基比例下對(duì)不同巰基來(lái)源與蒜素反應(yīng)的影響Fig.6　Effect of different ratios of TS/R-SH on reaction of different sourcing of peptides

圖6可以看出，隨著[TS]/[R-SH]摩爾比增加，反應(yīng)完成率逐漸增加，其中Cys和GSH作為最簡(jiǎn)單的巰基來(lái)源之一，與蒜素反應(yīng)呈直線形式，嚴(yán)格按照摩爾濃度比[TS]/[R-SH]=1∶2進(jìn)行。其余巰基來(lái)源主要區(qū)分為還原和未還原，未還原的11S及其水解物HP在[TS]/[R-SH]摩爾比=5∶4時(shí)，各種巰基均能很完全地與TS 反應(yīng)，因此[TS]/[R-SH]=5∶4是最佳比例；還原的11S即RP及其水解產(chǎn)物RHP和巰基肽EP基本在[TS]/[R-SH]摩爾比=1∶1時(shí)能達(dá)到最大完成度。顯然，增加蒜素的比例，有助于蒜素攻擊巰基，從而在相同條件達(dá)到更大的完成率。

2.6不同巰基來(lái)源對(duì)巰基與TS反應(yīng)的影響

經(jīng)過(guò)還原后的蛋白R(shí)P因?yàn)槠涫杷Y(jié)構(gòu)被打開(kāi)，巰基暴露出來(lái)，相比未還原的11S，相同比例的TS，在pH 7.0下，反應(yīng)1h，明顯RP反應(yīng)完成度更大(見(jiàn)圖6)。原因是因?yàn)檫€原后，TS更容易接觸到游離巰基。

而相比RP，被水解后的RP即RHP，因其肽段更小，理論上在相同的[TS]/[R-SH]下，巰基過(guò)量時(shí)，其反應(yīng)完成度可能會(huì)大些，從圖6可以看出，RHP與TS反應(yīng)的完成率在各個(gè)比例下比RP大，卻并不顯著。可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)本身是固定相同巰基濃度，而水解后對(duì)于巰基與TS的反應(yīng)影響不大，因?yàn)檫€原后巰基很容易與TS反應(yīng)，5 min后，在pH 7.0時(shí)反應(yīng)的完成度已經(jīng)很接近最終完成度(見(jiàn)圖5)。

其次，在低TS濃度下，大致表現(xiàn)出[TS]/[R-SH]摩爾比接近于1∶2，說(shuō)明在最佳條件下，就還原的巰基來(lái)源，包括RP、RHP、EP，其反應(yīng)完成率差異不大。

綜上，得出蒜素與巰基反應(yīng)的最佳條件為：反應(yīng)溫度24 ℃，反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)比例蒜素∶巰基(摩爾濃度比)=5∶4，反應(yīng)時(shí)間1 h。

2.7蒜素與巰基二硫鍵結(jié)合物的表征

2.7.1半胱氨酸與蒜素反應(yīng)的表征

如上述結(jié)果，配制一定濃度的Cys水溶液和TS水溶液，在最佳條件下反應(yīng)1 h，反應(yīng)結(jié)束用二氯甲烷洗滌殘余未反應(yīng)TS兩遍，用氮?dú)獯等堄喽燃淄?，進(jìn)液相，結(jié)果見(jiàn)圖7。

圖7　CySSA的HPLC譜圖Fig.7　　The HPLC spectrum of CySSA

如圖8所示，所制得CySSA純度>97%，理論分子質(zhì)量為193，對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜結(jié)果基準(zhǔn)峰為m/z=194.06 [M+H]+，與文獻(xiàn)一致[8]。即所得產(chǎn)物為CySSA。

圖8　CySSA的離子碎片F(xiàn)ig.8　Ion fragments of CySSA

2.7.2巰基肽(EP)與蒜素反應(yīng)的表征

按最佳反應(yīng)條件使EP與TS反應(yīng)，制備EPSSA，并用二氯甲烷洗滌兩遍除去殘余TS，得到無(wú)TS的EPSSA-D，進(jìn)液相，圖9為EP反應(yīng)前后的液相色譜圖。

圖9　巰基肽與蒜素反應(yīng)前后的HPLC譜圖Fig.9　The HPLC spectrum of reaction between EP and allicin

巰基肽EP實(shí)質(zhì)上是許多含有巰基的多肽片段，所以C18分離出許多極性不同的肽段，與TS反應(yīng)后，由于烯丙基基團(tuán)與多肽以二硫鍵形式結(jié)合，疏水性增大，表現(xiàn)為峰形整體右移，如圖9所示。經(jīng)二氯甲烷處理后，殘余TS消失，而峰形整體無(wú)變化，說(shuō)明EPSSA的疏水分布并未受二氯甲烷影響。

3　結(jié)論

制備大豆11S蛋白及其還原和水解產(chǎn)物，得到了一系列含巰基的多肽，制備了蒜素，研究了反應(yīng)pH、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)溫度、反應(yīng)蒜素和巰基比例、不同巰基來(lái)源對(duì)巰基與蒜素反應(yīng)的影響。結(jié)果表明，在反應(yīng)pH 7.0，反應(yīng)溫度24 ℃，蒜素∶巰基摩爾濃度比=5∶4，反應(yīng)時(shí)間1 h條件下最佳，巰基反應(yīng)完成度均達(dá)到95%以上。此外，對(duì)反應(yīng)前后的巰基及其二硫鍵結(jié)合產(chǎn)物進(jìn)行了一定表征，結(jié)果顯示，結(jié)合后疏水性增加，液相峰形整體右移。

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Preparation and characterization of conjugates of allicin and thiol-containing peptides from soy protein

CHEN Hai-qiao, ZHANG Cai-meng, HUA Yu-fei, KONG Xiang-zhen*

(School of Food Science, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

The disulfide-bonded conjugation between allicin and cysteine residues from glutathione, peptides and proteins is considered as the first step to play allicin’s physiological activitiesinvivo. Allicin and thiol-containing peptides in vitro are unstable, thus conjugating allicin with thiols is beneficial to exert both of their physiological activities. This paper studies the influence of reaction conditions on the conjugation of allicin and thiol-containing peptides. The results showed that pH 7.0, 24 ℃, the reaction ratio of allicin∶thiols = 5∶4 and reaction time of 1h were the optimal conditions, with a completion rate being more than 95%. Besides, compared with the unreduced protein, the reduced protein or peptides gained a greater degree of completion. Under these conditions, several corresponding products were prepared, and characterized by HPLC and MS-MS, which proves the structure of the conjugates.

garlic; thiol containing peptides; preparation; characterization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608014

碩士研究生(孔祥珍副教授為通訊作者，E-mail:xzkong@jiangnan.edu.cn)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31201380)

2015-12-，10改回日期：2016-01-15