一種預(yù)測rProROL酶促大豆油水解過程水解率的新模型

覃小麗, 李道明, 王永華,鐘金鋒*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶,400715)　2(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州,510640)

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一種預(yù)測rProROL酶促大豆油水解過程水解率的新模型

覃小麗1, 李道明2, 王永華2,鐘金鋒1*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶,400715)2(華南理工大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州,510640)

基于重組脂肪酶(recombinantRhizopusoryzaelipase with prosequence，rProROL)催化大豆油(甘油三酯，triglyceride，以TAG表示)水解反應(yīng)過程中反應(yīng)因素(反應(yīng)溫度、緩沖液pH、緩沖液添加量、反應(yīng)時間和酶添加量)對TAG水解率的影響，分析了緩沖液pH、緩沖液添加量、反應(yīng)時間和酶添加量與TAG水解率變化均呈良好的數(shù)學(xué)關(guān)系，據(jù)此提出可預(yù)測TAG水解率經(jīng)驗?zāi)Ｐ偷谋磉_式。通過對比TAG水解率的實驗值與由該數(shù)學(xué)模型計算的預(yù)測值，兩者的相關(guān)系數(shù)為0.914 6，說明了該模型能較好地反映rProROL酶促大豆油水解過程TAG水解率的變化規(guī)律。這將為rProROL酶促大豆油水解制備脂肪酸的過程優(yōu)化控制提供參考。

rProROL脂肪酶(rProROL)；水解反應(yīng)；預(yù)測模型；水解率

酶法催化油脂水解制備脂肪酸是油脂工業(yè)的重要研究方向之一。近期研究顯示當(dāng)兩種商業(yè)化脂肪酶的復(fù)配比例為4∶1(Lipozyme RM-IM∶Novozym 435)時，其催化豆油水解反應(yīng)的水解率在24 h時達到80%以上，但是當(dāng)這些商業(yè)化脂肪酶單獨作為催化劑時，其催化大豆油水解的水解率不足50%，且通常需要更長時間(70 h)[1]。針對酶催化效率及其生產(chǎn)成本仍是酶法改性油脂工業(yè)的技術(shù)障礙這一瓶頸，開發(fā)新型脂肪酶或?qū)ΜF(xiàn)有脂肪酶的基因序列改造以獲得優(yōu)異的催化性質(zhì)(高活性、高穩(wěn)定性等)的新型或重組脂肪酶對于生物酶法改性油脂工業(yè)具有重要意義。ARTHY等[2]研究了來源于Cryptococcussp.的新型脂肪酶催化沙丁魚油水解制取多不飽和脂肪酸的可行性，在反應(yīng)至72 h時水解率約為84%。在現(xiàn)有脂肪酶的基因改造方面，主要是針對天然脂肪酶的表達量少、酶活低等缺陷進行基因改造，如對米根霉(Rhizopusoryzae)脂肪酶基因克隆及在不同微生物中表達等方面進行研究[3-5]。研究顯示，相比于具有良好活性的Palatase 20000L脂肪酶，重組脂肪酶(recombinantRhizopusoryzaelipase with prosequence，rProROL)對大豆油水解顯示出更高的活性，并進一步考察了反應(yīng)參數(shù)對rProROL肪肪酶催化大豆油水解的影響，顯示出該酶催化大豆油水解反應(yīng)的潛在應(yīng)用[6]。TAG水解率是酶促油脂水解過程的關(guān)鍵參數(shù)，與反應(yīng)底物的轉(zhuǎn)化效率以及產(chǎn)品的最終得率直接相關(guān)，因此，研究水解率變化規(guī)律，對酶催化反應(yīng)過程進行動態(tài)預(yù)測，了解酶催化的反應(yīng)機制，為提高酶催化效率將具有十分重要的指導(dǎo)意義。然而，對rProROL脂肪酶催化過程中底物的變化規(guī)律預(yù)測模型尚未見文獻報道。本課題組前期探索了酶法催化合成乳酸正丁酯過程中酯化率經(jīng)驗預(yù)測模型的建立[7]，該模型可有效預(yù)測反應(yīng)過程中乳酸酯化率的變化。該工作可為本研究的rProROL脂肪酶催化過程底物的變化規(guī)律預(yù)測模型的建立提供了較好借鑒，可根據(jù)本研究反應(yīng)過程因素和實驗結(jié)果對模型進行調(diào)整，以期更好反映rProROL酶促反應(yīng)過程的變化規(guī)律。

在rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應(yīng)的前期研究[8]中，我們從反應(yīng)機理上推導(dǎo)rProROL酶催化大豆油水解反應(yīng)的半經(jīng)驗動力學(xué)模型，該反應(yīng)近似等同于一級反應(yīng)動力學(xué)。本文將從純經(jīng)驗處理方式出發(fā)，建立rProROL脂肪酶催化大豆油水解過程中預(yù)測TAG水解率的新模型，皆在于從多角度闡釋rProROL催化大豆油水解過程中的反應(yīng)物的變化規(guī)律。因此，本文以rProROL脂肪酶催化大豆油甘油三酯(triglyceride，TAG)水解反應(yīng)為研究對象，以TAG水解率為指標，考察不同反應(yīng)因素對rProROL脂肪酶促大豆油水解反應(yīng)過程中TAG水解率的影響。基于相關(guān)實驗數(shù)據(jù)，建立一種能預(yù)測TAG水解率的新模型，為rProROL脂肪酶應(yīng)用于油脂水解生產(chǎn)脂肪酸的工藝優(yōu)化控制提供理論依據(jù)和參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

rProROL脂肪酶[Rhizopusoryzae脂肪酶前肽基因序列與成熟肽基因序列(ProROL)在重組Pichiapastoris中表達，酶粉，酶活力為5 480 U/g]：實驗室自制[6]；大豆油：嘉里糧油(深圳)有限公司；甘油酯標準品(甘油一酯、甘油二酯、甘油三酯)：Sigma-Aldrich公司；正己烷和異丙醇：色譜純，天津科密歐藥品公司。

1.2實驗方法

1.2.1酶促大豆油水解反應(yīng)

固定底物(大豆油)質(zhì)量為10 g并置于50 mL具塞錐形瓶中，添加一定質(zhì)量的緩沖液(0.1 mol/L NaH2PO4/Na2HPO4)并充分混勻，在反應(yīng)溫度下預(yù)熱后加入適量rProROL脂肪酶，置于一定溫度的水浴振蕩器(轉(zhuǎn)速為200 r/min)中反應(yīng)?？疾旆磻?yīng)溫度(30～50 ℃)、緩沖液pH(5～7)、緩沖液添加量(5%～30%，占大豆油質(zhì)量)和酶添加量(10～50 U/g)對大豆油水解率的影響。在反應(yīng)過程中定時取樣，樣品經(jīng)離心(10 000×g，5 min)后，上層(油層)將用于高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)分析。

1.2.2水解產(chǎn)物的HPLC分析

樣品處理：取20 μL油相(見1.2.1)于1.5 mL色譜瓶中，用1 mL流動相溶解并充分混勻，待HPLC分析。

HPLC分析的主要條件：高效液相色譜儀，Waters 1525型；示差檢測器，Waters 2414型；色譜柱，Phenomenex Luna Silica(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm particle size)；柱溫，35 ℃；流動相，正己烷∶異丙醇∶甲酸(15∶1∶0.003，體積比)；流速，1.0 mL/min；進樣量，10 μL。通過對比標準樣品的保留時間來確定酶促大豆油水解反應(yīng)中各組分的出峰位置；大豆油(TAG)相對含量(質(zhì)量分數(shù)，占總脂質(zhì)的面積百分比)通過面積歸一化法計算，結(jié)果采用平均值±標準差表示。大豆油TAG的水解率(hydrolysis rate, 簡記為Hr)由公式(1)計算：

(1)

式中：TAGi，反應(yīng)初始時大豆油TAG相對含量，%；TAGt，反應(yīng)一段時間后混合物中TAG相對含量，%。

1.2.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Excel 2010對TAG水解率進行處理；以TAG水解率指標進行反應(yīng)過程分析，采用偏最小二乘法(Solver, Microsoft Excel 2010)擬合得到數(shù)學(xué)預(yù)測模型的參數(shù)。

2　結(jié)果與討論

2.1反應(yīng)溫度對TAG水解率的影響

圖1反映了反應(yīng)溫度對rProROL脂肪酶催化大豆油水解過程中TAG水解率的影響。從圖1中可知，在相同反應(yīng)時間，合適反應(yīng)溫度(30～45 ℃)對TAG水解率的影響不大；反應(yīng)在較高溫度(T=50 ℃)時TAG水解率略有下降。因此，在合理反應(yīng)溫度范圍(30～50 ℃)內(nèi)的TAG水解率數(shù)學(xué)預(yù)測模型方程中可以不考慮溫度因素對其的影響。

圖1　反應(yīng)溫度對TAG水解率的影響Fig.1　Effect of reaction temperature on the TAG hydrolysis rate

2.2緩沖液pH與TAG水解率的關(guān)系

圖2所示為不同pH緩沖液對rProROL脂肪酶催化大豆油水解過程中TAG水解率的影響。

圖2　pH值對TAG水解率的影響Fig.2　Effect of buffer pH on the TAG hydrolysis rate

從圖2中可看出，在給定的酶添加量、反應(yīng)溫度和緩沖溶液添加量情況下，TAG水解率在同一反應(yīng)時間下隨著緩沖液pH的增大而呈現(xiàn)先增大后減少的趨勢，而且在不同的反應(yīng)時間均呈現(xiàn)類似的規(guī)律。當(dāng)緩沖液pH值為6.5時，在考察的反應(yīng)時間范圍內(nèi)TAG水解率較高。通過對TAG水解率隨著緩沖液pH值的實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)學(xué)擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAG水解率與緩沖液pH表現(xiàn)一種良好的數(shù)學(xué)關(guān)系，可表示為：

(2)

式中：Hr,TAG水解率，%；V,緩沖液pH值，%；a,系數(shù)；b,系數(shù)。

2.3反應(yīng)時間和緩沖液添加量與TAG水解率的關(guān)系

圖3反映了反應(yīng)時間對rProROL脂肪酶催化大豆油水解過程中TAG水解率的影響。從圖3中可知，在不同緩沖液添加量的情況下，TAG水解率隨著反應(yīng)時間逐漸增大，而且，兩者呈現(xiàn)一種對數(shù)關(guān)系。由于反應(yīng)時間為零時采用直接的對數(shù)函數(shù)[Ln(x)]在數(shù)學(xué)上沒有意義，所以選用Ln(x+1)作為自變量，對TAG水解率隨著反應(yīng)時間變化的實驗數(shù)據(jù)進行擬合求解。結(jié)果表明，當(dāng)x=d×t時，TAG水解率與Ln(x+1)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。因此，rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應(yīng)過程中TAG水解率隨緩沖液添加量的關(guān)系可表示如方程(3)所示。

Hr=c×Ln(d×t+1)

(3)

式中：Hr，TAG水解率，%；t，反應(yīng)時間，h；c，系數(shù)；d，系數(shù)。

圖3　反應(yīng)時間對TAG水解率的影響Fig.3　Effect of reaction time on the TAG hydrolysis rate

圖4反映了rProROL脂肪酶催化大豆油水解過程中TAG水解率隨著緩沖液添加量(W)的變化規(guī)律。從圖4a中可知，隨著緩沖液添加量的增加，TAG水解率逐漸增大；對TAG水解率隨著緩沖液添加量變化的實驗數(shù)據(jù)進行擬合求解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAG水解率與緩沖液添加量呈現(xiàn)一種指數(shù)關(guān)系。結(jié)果表明，TAG水解率與W0.085呈現(xiàn)很好的線性關(guān)系(見圖4b)。據(jù)此，rProROL脂肪酶催化大豆油水解過程中TAG水解率隨著緩沖液添加量的變化關(guān)系可用方程(4)表示。

Hr=e×W0.085

(4)

式中：Hr,TAG水解率，%；W,緩沖液添加量，%；e,系數(shù)。

圖4　酶促反應(yīng)過程中TAG水解率隨緩沖液添加量的變化規(guī)律Fig.4　Effect of the amount of buffer on the TAG hydrolysis rate

2.4酶添加量與TAG水解率的關(guān)系

圖5反映了rProROL脂肪酶催化大豆油水解過程中TAG水解率隨著酶添加量(D)的變化規(guī)律。從圖5a中可知，隨著酶添加量的增大，TAG水解率逐漸增加。對TAG水解率隨著酶添加量變化的實驗數(shù)據(jù)進行擬合求解，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在不同的反應(yīng)時間下兩者呈現(xiàn)一種指數(shù)關(guān)系，以D0.095為橫坐標與TAG水解率為縱坐標作圖，可以發(fā)現(xiàn)兩者之間也呈現(xiàn)出較好的線性關(guān)系(如圖5b所示)，因此，TAG水解率與酶添加量之間的關(guān)系可用方程(5)表示：

Hr=f×D0.095

(5)

式中：Hr,TAG水解率，%；D,酶添加量，U/g；f,系數(shù)。

2.5TAG水解率預(yù)測的數(shù)學(xué)經(jīng)驗?zāi)Ｐ徒⑴c驗證

根據(jù)上述方程(1)～(5)確立了緩沖液pH、緩沖液添加量、反應(yīng)時間與酶添加量與TAG水解率的數(shù)學(xué)關(guān)系。根據(jù)方程(1)～(5)和數(shù)學(xué)變換法則，由此可得到基于本研究考察反應(yīng)參數(shù)下大豆油在rProROL脂肪酶催化作用下TAG水解率與反應(yīng)因素的總關(guān)系式，可表示為：

圖5　酶促反應(yīng)過程中TAG水解率隨酶添加量的變化規(guī)律Fig.5　Effect of lipase dosage on the TAG hydrolysis rate

(6)

式中：Hr，TAG水解率，%；D，酶添加量，U/g；t，反應(yīng)時間，h；V，緩沖液pH；W，緩沖液添加量，%；g,h,i,j為方程系數(shù)。

在改變上述反應(yīng)參數(shù)(即緩沖液pH及其添加量、酶添加量和反應(yīng)時間)的情況下，通過不同實驗條件下測得的TAG水解率，代入該方程(6)進行數(shù)值擬合，求得方程(6)中的方程系數(shù)(g=0.943 7，h=2.803，i=2.976，j=13.94)。已知該方程系數(shù)的基礎(chǔ)上，通過方程(6)計算出TAG水解率的預(yù)測值，并與相同反應(yīng)參數(shù)下的實驗值比較，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知，兩者相近程度的曲線擬合相關(guān)系數(shù)(R2)為0.914 6，由此可知，該模型可對上述實驗范圍內(nèi)大豆油在rProROL脂肪酶催化水解反應(yīng)過程中TAG水解率變化進行很好地預(yù)測。

圖6　TAG水解率的實驗測定值與模型擬合值之間的比較Fig.6　Comparative result of conversion between experimental determined and model predicted data

3　結(jié)論

本文研究確定了rProROL脂肪酶催大豆油水解的適宜溫度為45℃后，系統(tǒng)地考察脂肪酶催化反應(yīng)過程中的緩沖液pH及其添加量、反應(yīng)時間和酶添加量對TAG水解率的影響，建立了該酶促水解反應(yīng)過程中TAG水解率變化規(guī)律經(jīng)驗?zāi)Ｐ?。通過比較TAG水解率的實驗測定值和模型預(yù)測值后發(fā)現(xiàn)，兩者的相關(guān)系數(shù)(R2)為0.914 6，說明該模型可很好地預(yù)測rProROL脂肪酶催大豆油水解反應(yīng)過程中TAG水解率的變化。

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[8]覃小麗, 李道明, 王永華，等. rProROL脂肪酶催化大豆油水解反應(yīng)的半經(jīng)驗動力學(xué)模型[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2016,42(6)：67-72.

New model for the predication of hydrolysis rate during the hydrolysis of soybean oil catalyzed by recombinantRhizopusoryzaelipase

QIN Xiao-li1,LI Dao-ming2, WANG Yong-hua2, ZHONG Jin-feng1*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China)2(School of Food Science and Engineering, South China University of Technology, Guangzhou 510640, China)

The effects of parameters (reaction temperature, buffer pH, buffer amount and lipase amount) on the triglyceride (TAG) hydrolysis rate during the hydrolysis of soybean oil catalyzed by a recombinantRhizopusoryzaelipase containing prosequence (rProROL) were analyzed, and the empirical model of TAG hydrolysis rate was built based on the integration of a series of parameters including buffer pH, buffer amount and lipase amount. The results showed that the correlation coefficient between TAG hydrolysis rates obtained from experiments and predicted by the established model was 0.9146, confirming that this model could precisely predict TAG hydrolysis rate. Therefore, the model could be applied to the practical hydrolysis process catalyzed by rProROL for optimizing and monitoring TAG hydrolysis rate.

recombinantRhizopusoryzaelipase with prosequence (rProROLT1 lipase); hydrolysis; empirical model; hydrolysis rate

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608011

博士，講師(鐘金鋒副教授為通訊作者，E-mail：jinfzhong@163.com)。

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項(XDJK2014B019)；重慶市基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究專項(cstc2015jcyjA80013)；國家自然科學(xué)基金(31501446)

2016-03-28, 改回日期：2016-04-13