產細菌素的飼用乳酸菌的分離與鑒定

王娟，蔡國林，方華，陸健

1(江南大學， 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 　2(江南大學， 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)　3(江南大學， 糧食發(fā)酵工藝及技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)　4(上海源耀生物股份有限公司，上海，201316)

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產細菌素的飼用乳酸菌的分離與鑒定

王娟1,2,3，蔡國林1,2,3，方華4，陸健1,2,3

1(江南大學， 工業(yè)生物技術教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學， 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)3(江南大學， 糧食發(fā)酵工藝及技術國家工程實驗室，江蘇 無錫，214122)4(上海源耀生物股份有限公司，上海，201316)

禽畜產品中的抗生素殘留嚴重威脅人類的健康，推行無抗養(yǎng)殖的重要途徑就是發(fā)展發(fā)酵飼料。從飼料原料中分離得到能夠抑制大腸桿菌生長的乳酸菌，通過排除發(fā)酵液中有機酸和H2O2的干擾，初步確定4株具有較強抑菌功能的乳酸菌。分別采用胰蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶處理發(fā)酵上清液后，其抑菌活性減小，初步確定抑菌活性物質為細菌素。進一步通過耐酸、耐膽鹽和耐熱實驗確定1株適合動物腸道定植的乳酸菌R16，生理生化實驗和16S rDNA基因序列分析鑒定該菌株為乳酸片球菌R16。篩選獲得具有抑菌功能的、適合動物腸道定植和耐飼料加工的飼用乳酸菌對開發(fā)無抗發(fā)酵飼料具有重要的實用價值。

乳酸片球菌；細菌素；分離；鑒定

飼料在運輸、儲存過程中容易攜帶大腸桿菌、沙門氏菌等病原微生物，這些病原微生物隨著飼料進入動物體內，會引起動物腸道傳染病，對動物的健康構成嚴重威脅[1]。目前，在解決這一問題上使用最廣泛的仍然是抗生素。隨著抗生素的應用，細菌耐藥性日益普遍，同時，抗生素的藥物殘留問題也逐漸引起了人們的注意[2]。世界許多畜牧發(fā)達國家和地區(qū)對抗生素的使用提出限制，研究和開發(fā)綠色飼料添加劑產品，已經成為世界性的研究課題[3]。

發(fā)酵飼料作為一種生態(tài)健康型飼料，不僅可以改善飼料營養(yǎng)的吸收水平、降解飼料原料中可能存在的抗營養(yǎng)因子和有毒有害物質，還可以促進動物生長、維持動物體腸道內微生態(tài)平衡、增強機體免疫力[4]，是中國目前發(fā)展較快的綠色飼料，可以減少飼喂過程中抗生素的使用。細菌素也是一種重要的抗生素替代品，具有無副作用、無殘留、無抗藥性，不污染環(huán)境等優(yōu)點，除此之外，還具有熱穩(wěn)定性，耐酸，耐低溫貯藏等特性[5]。因此，如果在發(fā)酵飼料的同時，積累具有抑菌功能的活性物質，全面減少抗生素的使用，不僅可以提高飼料的品質，從而較好的保持飼料的營養(yǎng)價值和風味，而且可以抑制病原微生物的生長，增加飼料安全性[6]。然而，在現有細菌素產生菌的研究中缺乏適合腸道定植、耐飼料加工方面的研究[7]，而現有發(fā)酵飼料用乳酸菌也主要是針對原料抗營養(yǎng)因子降解方面進行研究，對其代謝積累細菌素和腸道定植方面的研究尚屬空白[4]。因此，綜合研究細菌素的代謝積累和乳酸菌的腸道定植與耐飼料加工，不僅可以使乳酸菌發(fā)酵飼料發(fā)揮抑制病原菌的作用，而且可以對原料中的抗營養(yǎng)因子進行降解，改善飼料品質。

本研究從飼料原料中分離產細菌素的乳酸菌，并通過耐酸、耐膽鹽和耐熱性試驗篩選動物腸道定植能力強和能夠耐受飼料加工過程中的高溫處理的乳酸菌，為飼料行業(yè)開發(fā)綠色飼料產品提供一個有效途徑。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1樣品

玉米秸稈，麩皮和豆粕等樣品由上海源耀生物股份有限公司提供。

1.1.2指示菌

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)，為上海源耀生物股份有限公司提供。

1.1.3培養(yǎng)基及試劑

MRS液體培養(yǎng)基(g/L)：牛肉膏10.0，蛋白胨10.0，酵母膏5.0，葡萄糖20.0，吐溫80 1.0，磷酸氫二鉀2.0，乙酸鈉5.0，檸檬酸三銨2.0，MgSO40.2，MnSO4·H2O 0.05，pH 6.8。121 ℃滅菌20 min。

MRS固體培養(yǎng)基(g/L)：MRS液體培養(yǎng)基加瓊脂2%，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。

MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基(g/L):MRS液體培養(yǎng)基加瓊脂2%，CaCO30.2%，pH 6.8，121 ℃滅菌20 min。

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母膏5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

LB固體培養(yǎng)基(g/L)：LB液體培養(yǎng)基加瓊脂2%，pH 7.0，121 ℃滅菌20 min。

PYG培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母膏10，葡萄糖 10，無機鹽溶液40。

鹽溶液成分(g/L)：NaHCO310.0，K2HPO41.0，KH2PO41.0，NaCl 2.0，MgSO420.0，無水CaCl20.2。

培養(yǎng)基中使用的藥品，胃蛋白酶和牛膽鹽購自國藥集團化學試劑有限公司；細菌基因組DNA提取盒，蛋白酶K和胰蛋白酶購自生工生物工程股份有限公司。

1.1.4PCR引物

27F：AGAGTTTGATCM TGGCTCAG，1492R：TACGGY TACCTTGTTACGACTT[8]。由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2實驗方法

1.2.1飼料原料中乳酸菌的篩選

將飼料原料與MRS液體培養(yǎng)基以1∶3的比例混合，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，吸取培養(yǎng)液1 mL，用無菌生理鹽水依次稀釋至10-6倍，每個稀釋度取100 μL涂布于MRS-CaCO3固體培養(yǎng)基，37 ℃厭氧培養(yǎng)24～48 h，挑選有溶鈣圈的菌落在相應的培養(yǎng)基上劃線直至純菌落，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2指示菌的培養(yǎng)

將大腸桿菌接種于LB液體培養(yǎng)基中，于搖床上30 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，4 ℃保藏備用。

1.2.3產細菌素乳酸菌的篩選

將乳酸菌活化培養(yǎng)后，以1%接種量接種于MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)48 h，12 000 r/min，4 ℃離心15 min，收集上清液，過0.45 μm的膜，4 ℃保藏備用。

運用牛津杯法做抑菌實驗：將LB固體及半固體培養(yǎng)基加熱融化，置于50 ℃水浴中保溫。先傾注10 mL LB固體培養(yǎng)基于平皿中，待其凝固后，傾注8 mL含107CFU/mL指示菌的LB半固體培養(yǎng)基，待其凝固后，輕輕放上牛津杯，5 min后取200 μL上清液加入牛津杯，4 ℃冰箱擴散1 h，置于30 ℃恒溫箱中培養(yǎng)16 h，觀察并測量抑菌圈。

1.2.4產細菌素乳酸菌的復篩

(1)排除有機酸的干擾

利用HPLC分析發(fā)酵液中主要有機酸的組分，配置相同濃度的有機酸混合液，調其pH與發(fā)酵上清液相同，以發(fā)酵上清液為對照，設3組平行，做抑菌實驗[9]。

(2)排除過氧化氫的干擾

將發(fā)酵上清液置于80 ℃水浴10 min，以發(fā)酵上清液為對照，設3組平行，做抑菌實驗[10]。

(3)酶處理對抑菌活性的影響

分別用胰蛋白酶、胃蛋白酶和蛋白酶K(濃度200 μg/mL)處理發(fā)酵上清液，在37 ℃水浴處理2 h，以未經酶處理的發(fā)酵上清液為空白對照，設3組平行，做抑菌實驗[11]。

1.2.5產細菌素且能夠耐酸耐膽鹽乳酸菌的篩選

將活化的乳酸菌接種到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃過夜培養(yǎng)，取1 mL過夜培養(yǎng)的菌液，10 000 r/min離心2 min，收集菌體，用PBS緩沖液(pH7.0)沖洗2次，分別用pH2.0、3.0、4.0、7.0的PBS緩沖液和含有0.1%、0.2%、0.3%豬膽鹽的MRS重懸。以原菌液為對照，將不同pH(除pH7.0)和膽鹽濃度的菌液在37 ℃處理3 h。將pH7.0含菌體的PBS緩沖液置于80 ℃處理30、60、90、120 s，處理的菌液進行梯度稀釋，每個稀釋度設3個重復，并涂板[12]。根據高鵬飛的方法對菌株的存活率進行計算[13]。

1.2.6產細菌素乳酸菌的鑒定

(1)生理生化特性鑒定

按照API 50 CHL試劑盒(購自生物梅里埃中國有限公司)說明書對所選菌株進行生理生化特性鑒定。

(2) 16S rDNA基因測序分析

細菌DNA按照細菌DNA小量抽提試劑盒(購自上海生工生物工程技術服務有限公司)的說明提取。提取的細菌DNA進行PCR，PCR引物和反應條件均參考RAHMAN等人的方法[14]。得到PCR擴增序列后，由上海生工生物工程技術服務有限公司測序，最后將基因序列在NCBI上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行Blast比對，對其進行分析鑒定。

(3)系統(tǒng)發(fā)育樹構建

根據LPSN(http://www.bacterio.cict.fr/)公布的片球菌屬(Pediococcus)標準菌株，通過MEGA 5.0 軟件的鄰位相連法，利用16S rDNA 序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹[15]。

2　結果與分析

2.1產細菌素乳酸菌的篩選

從玉米秸稈、麩皮和豆粕中共篩得52株具有溶鈣圈的菌株，表明這些菌株可能產生乳酸，對這些菌株做抑菌試驗，獲得具有抑菌效果的菌株34株，這些菌株的抑菌效果頻數分布如圖1所示。由圖1可知，具有抑菌效果的34株菌中抑菌圈直徑大于5 mm的有32株，其中抑菌圈直徑大于15 mm的有16株?？紤]到發(fā)酵液中有機酸具有一定的抑菌效果，因此選取抑菌圈直徑大于15 mm的菌株進行下一步實驗。

圖1　有抑菌效果菌株的頻率分布直方圖Fig.1　The frequency distribution histogram of bacteriostatic strains

2.2產細菌素乳酸菌的復篩

通過排除過氧化氫、有機酸實驗以及不同酶對抑菌活性的影響實驗，選取有機酸、 過氧化氫對抑菌圈

影響小且不同酶對抑菌活性影響明顯的菌株4株。以菌株R16為例，菌株R16排除過氧化氫實驗如圖2所示，對照的抑菌圈直徑為(20.46 ±0.18) mm(圖2.A)，發(fā)酵上清液經80 ℃水浴處理過后的抑菌圈直徑為(18.70 ±0.13) mm(圖2.B)，80 ℃水浴可以去除溶液中的過氧化氫，發(fā)酵上清液處理前后抑菌圈大小基本一致，說明菌株R16的抑菌效果不是由過氧化氫引起。菌株R16排除有機酸實驗如圖2.A/C所示，有機酸的抑菌圈明顯小于菌株R16發(fā)酵上清液的抑菌圈，分別為(15.68±0.12) mm(圖2.C)和(20.46 ±0.18) mm(圖2.A)，R11，R13和R17的結果與R16基本一致，由此可以判斷菌株R11、R13，R16和R17的發(fā)酵液中除了有機酸對大腸桿菌有抑制作用外，還有另外一種物質在起作用。

不同酶對抑菌活性的影響實驗如圖3所示。從圖3可以看出，胰蛋白酶，蛋白酶K和胃蛋白酶對4株菌株的抑菌活性均有不同的影響。其中菌株R11和R13對蛋白酶K最為敏感，抑菌直徑只有7.98 mm和7.05 mm；菌株R16和R17對胰蛋白酶最為敏感，抑菌直徑只有7.34 mm和7.26 mm，菌株R16除了對胰蛋白酶敏感外，對蛋白酶K也具有一定的敏感性。說明具有抑菌活性的物質是一種蛋白質。綜合以上實驗及相關文獻可以初步確定菌株R11、R13，R16和R17為細菌素產生菌。

圖3　不同酶處理對不同菌種抑菌活性的影響Fig.3　Effect of different enzymes on the antibacterial activity of different strains

2.3產細菌素且能夠耐酸耐膽鹽乳酸菌的篩選

乳酸菌能夠調節(jié)動物腸道功能，因此作為直接飼喂微生物，所篩選的乳酸菌必須具有較強的胃酸及膽鹽耐受性，以便能夠長時間在腸胃中存活，除此之外，乳酸菌在添加到飼料中時要能夠耐受飼料在加工過程中高溫處理時的溫度，因此對菌株的耐高溫能力有一定的要求。菌株R11、R13、R16、R17在低酸、高膽鹽和高溫下的菌種存活情況如表1所示。由表1可知，經過37 ℃溫育3 h之后，菌株R13和R16對酸和膽鹽均具有一定的耐受性，在低pH和高膽鹽條件下存活率都很高且都滿足活菌數為106CFU/mL的要求[16]，適合腸道定植；在80 ℃處理30、60、90、120 s后，菌株R13的生長明顯減弱，說明高溫對其存活率有較大的影響，而菌株R16表現出良好的耐受性，在溫度為75～85 ℃，持續(xù)時間為1～2 min的制粒過程中[17]，能夠保證活菌數滿足106CFU/mL。因此，將R16確定為目標菌。

表1　菌株R16在不同條件下的存活情況

2.4產細菌素乳酸菌的鑒定

通過鏡檢可知，R16為革蘭氏陽性菌、球型。通過過氧化氫酶測定和運動性檢驗試驗可知菌株R16接觸酶陰性，無運動性。采用梅里埃API 50 CHL試劑盒對菌株R16的生理生化鑒定結果如表2所示，由表2可知R16不但能夠利用常規(guī)的葡萄糖和果糖，還能夠利用植物原料纖維素和半纖維素的組成糖，如L-阿拉伯糖、D-木糖，半乳糖、甘露糖和D-纖維二糖等其他糖類。

在通用引物27F和1492R的擴增下，將其16SrDNA序列在NCBI上(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進行Blast比對，與PediococcusacidilacticiLAB2(注冊號：JN039348.1)的序列一致性最高，為99%。依據菌株R16的形態(tài)、生理生化特性、16S rDNA序列分析，鑒定菌株R16為Pediococcusacidilactici，并將其命名為：PediococcusacidilacticiR16，符合農業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》2013規(guī)定的飼用微生物范疇。

表2　菌株R16的生理生化鑒定結果

注：+可發(fā)酵，-不可發(fā)酵，W弱發(fā)酵。

2.5系統(tǒng)發(fā)育樹構建

根據片球菌屬內的不同種16S rDNA序列，通過MEGA 5.0 軟件的鄰位相連法構建菌株R16的系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖4。

圖4　菌株R16的系統(tǒng)進化樹Fig.4　The phylogenetic tree of strain R16

由圖4可知，菌株R16與PediococcusloliiAB362985.1的同源性最高，PediococcusloliiAB362985.1未見產細菌素的報道。

3　結論

從玉米秸稈中篩選出1株能夠有效抑制大腸桿菌生長的乳酸菌。通過排除過氧化氫、有機酸對抑菌效果的影響，向發(fā)酵上清液中分別加入胃蛋白酶、蛋白酶K和胰蛋白酶，發(fā)現此物質對胰蛋白酶和蛋白酶K敏感，確定該物質為蛋白類物質。通過革蘭氏染色、運動性檢驗、生理生化特性測定、16S rDNA序列測定和構建系統(tǒng)進化樹對所篩選的菌株進行了菌種鑒定，發(fā)現所篩選的菌株與乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)的相似度高達99%，將其命名為乳酸片球菌R16(PediococcusacidilacticiR16)。符合農業(yè)部《飼料添加劑品種目錄》(2013)規(guī)定的飼用微生物范疇。通過耐酸、耐膽鹽實驗和溫度耐受性實驗，發(fā)現乳酸片球R16具有很好的pH、膽鹽和溫度耐受性。篩選獲得具有抑菌功能的、適合動物腸道定植和耐飼料加工的飼用乳酸菌對開發(fā)無抗發(fā)酵飼料具有重要的實用價值。

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Isolation and identification of a lactobacillus strain producing antibacterial material

WANG Juan1, 2, 3, CAI Guo-lin1, 2, 3,FANG Hua4LU Jian1, 2, 3*

1(The Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, School of Biotechnology,Jiangnan University, Wuxi 214122, China) 2(School of Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)3(National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, JiangnanUniversity, Wuxi 214122, China)4(Shanghai Yuanyao Invertment Co, Shanghai201316, China)

Residual antibiotic in livestock products is a great threaten to human health. Therefore, the most effective way for implement of aquaculture without antibiotics is to develop fermented feed. In the present study, four lactic acid bacteria strains were isolated from feedstuff and identified to be active againstEscherichiacoliby excluding the disruption of organic acid and H2O2. By treating with trypsin, proteinase K and pepsin, the active substance was preliminarily identified as a bacteriocin secreted in LAB culture. Among the four LAB strains, the R16 strain was found to be resistant to acid, bile salt and high temperature and thus was suitable for colonization in intestinal tracts. This strain was then identified asPediococcusacidilacticibased on its physiological and biochemical characteristic and 16S rDNA gene sequence. Based on these results, it was of great practical value to isolate special LAB strains with bacteriostatic efficacy, engraftment capacity in animal intestinal and resistance to feed processing, for implement of aquaculture without antibiotics.

Pediococcusacidilactici; bacteriocin; isolation; identification

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201608007

碩士(陸健教授為通訊作者,E-mail：jlu@jiangnan.edu.cn)。

工業(yè)生物過程高效轉化與系統(tǒng)集成的科學基礎研究，973項目(2013CB733602)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程資助項目。

2015-11-04，改回日期：2016-01-28