香菇菌富硒液體發(fā)酵及三種胞外酶活性變化

王艷梅，吳 艷，王雅珍，李彩霞

(1.黑龍江工業(yè)學(xué)院環(huán)境工程系，黑龍江雞西158100;2.江蘇宿遷經(jīng)貿(mào)高等職業(yè)技術(shù)學(xué)院社會服務(wù)系，江蘇沭陽223600)

硒是人體必需微量元素，是GSHPx(谷胱甘肽過氧化物酶)和TrxR(硫氧還蛋白還原酶)等含硒酶重要組成部分［1］，具有提高人體機體免疫能力、抗腫瘤、緩解體內(nèi)重金屬蓄積、抗衰老和防止心腦血管疾病等活性［2］。人體只能從食物中獲取硒，從谷物和蔬菜攝入硒占總量的85%左右。我國72%地區(qū)為不同程度缺硒區(qū)，低硒地帶造成農(nóng)產(chǎn)品硒含量低，使當?shù)鼐用裆攀澄鴶z入量遠低于中國營養(yǎng)學(xué)會推薦硒攝入量最低值50μg·d－1，因此提高日常食品硒含量尤為重要。有機硒比無機硒具有較高生物活性和較低毒性，成為當今研究熱點［3］。香菇菌絲體對無機硒有較強富集和轉(zhuǎn)化作用［4］，香菇又具有增強免疫力、抗腫瘤、降血脂、抗血栓、健胃保肝、預(yù)防佝僂病和防治貧血等功能［5］，因此，生產(chǎn)研發(fā)富硒香菇對健康飲食有重要意義。

本文研究香菇菌在添加不同濃度Na2SeO3的發(fā)酵液中，對硒的富集及轉(zhuǎn)化能力，同時檢測發(fā)酵6天后淀粉酶、羧甲基纖維素酶(CMC)、漆酶活性，為藥食同源富硒香菇的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料

香菇菌購于黑龍江五常市東北食用菌研究所。

1.2 培養(yǎng)基

(1)斜面種子培養(yǎng)基(PDA) 馬鈴薯浸出液200g·L－1，葡萄糖20g·L－1，瓊脂15 g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，pH自然。

(2)液體種子培養(yǎng)基 馬鈴薯浸出液 200g·L－1，葡萄糖 20g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，KH2PO41g·L－1，MgSO4·7H2O，0.5 g·L－1，pH=6.5;(3)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基:糊精［6］20g·L－1，酵母粉 5 g·L－1，KH2PO41g·L－1，F(xiàn)eSO4［6］0.5 g·L－1，CaCl20.5g·L－1，pH=6.5。

2 實驗方法

2.1 香菇菌富硒培養(yǎng)

2.1.1 種子斜面培養(yǎng)

PDA瓊脂培養(yǎng)基做好后分裝進試管，120℃、0.12Mpa滅菌30min，趁熱擺斜面;待培養(yǎng)基冷卻至室溫，原種試管中取出約1cm2菌絲塊接種于斜面培養(yǎng)基，置25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12d，4℃低溫保藏。

2.1.2 菌種活化

取4℃保藏的菌種斜面，25℃培養(yǎng)箱活化12h。

2.1.3 液體種子培養(yǎng)

從以活化好的香菇試管菌中1cm2接入80mL(500mL三角瓶)分別含有Na2SeO3的10、20、30、40、50 μg·mL－1的液體培養(yǎng)基中，25℃、150r·min－1搖床培養(yǎng)6d制備成種子培養(yǎng)液，以不添加Na2SeO3液體培養(yǎng)基為對照。

2.1.4 液體發(fā)酵培養(yǎng)

以8%接種量將種子培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接入 100mL(500mL三角瓶)分別含 Na2SeO3的60、70、80、90、100 μg·mL－1液體培養(yǎng)基中，25℃、150 r·min－1搖床6d發(fā)酵培養(yǎng)，以不添加Na2SeO3液體培養(yǎng)基為空白對照。

2.2 香菇菌絲體干生物量及菌球直徑測定

收集100mL發(fā)酵液菌絲體，5000r·min－1離心10min，蒸餾水洗三次得菌絲體。用移液管取1mL發(fā)酵液，顯微觀察測定，以隨機抽取10個菌球直徑算術(shù)平均值作為菌球直徑［7］。將菌絲體置60℃恒溫真空干燥箱，烘干至恒重，電子天平稱重，即為菌絲體干生物量［8］。

2.3 樣品有機硒含量測定

2.3.1 繪制硒標準曲線

準確稱量2.194g干燥的Na2SeO3，蒸餾水溶解并定容至1L，制備成含硒1g·L－1的標準溶液儲備液。取此儲備液 1mL，加蒸餾水定容至 200 mL，此硒標準應(yīng)用液含硒 5μg·mL－1。分別取0、2、4、6、8、10 mL 硒標準應(yīng)用液，置于125mL分液漏斗中，用水稀釋成40mL，用1:1的HCl調(diào)節(jié)pH2～3，加入EDTA－2Na溶液2mL，再加入3，3，–二氨基聯(lián)苯胺溶液2mL，搖勻。置暗處50min，取出，用10%NaOH 調(diào)節(jié) pH7.0～7.5，準確加10mL甲苯，搖蕩3min，靜置分層，甲苯層置于分光光度計波長420nm處測定其吸光度［9］，繪制標準曲線。

2.3.2 樣品無機硒的去除

準確稱取烘干菌絲體0.2g，加入pH=8.6三羥甲基氨基甲烷－鹽酸－甘油緩沖溶液，加入適量SiO2充分研磨，顯微鏡檢，待細胞完全破碎后裝入MD34－3500［10］透析袋內(nèi)，于去離子水中透析。取透析外液，加入15%(質(zhì)量比)半胱氨酸溶液搖勻靜置，加1～2滴亞甲基藍溶液，30～60s不褪色［11］證明無機硒已除凈。

2.3.3 樣品有機硒含量測定

完全轉(zhuǎn)移透析內(nèi)液于錐形瓶中，加入(VHNO3:VHClO4)混合酸5 mL，于可控溫電熱板上加熱，及時補加混酸，當消化至樣液呈無色通明為止。冷卻，消化液轉(zhuǎn)入燒杯，調(diào)pH為7.0，最后將溶液定容到50mL容量瓶中，按2.3.1的方法測樣品有機硒含量。

2.3.4 樣品總硒含量測定

準確稱取烘干菌絲體0.2g，按2.3.4方法測總硒含量。

2.4 三種酶活性測定

香菇是木腐菌，對多糖物質(zhì)的降解主要依賴纖維素酶和木質(zhì)素酶［12］，這些酶活性強弱一定程度上決定菌絲體對培養(yǎng)基物料的生物轉(zhuǎn)化［13］，取培養(yǎng)6天發(fā)酵液5mL，于4℃以下以4000 r·min－1離心10min，上清液即為粗酶液［14］，漆酶活性測定采用ABTS法［15］，淀粉酶、羧甲基纖維素酶活性測定參照回晶的方法進行［16］。

3 結(jié)果與分析

3.1 標準曲線繪制

以硒標準液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制硒標曲線如圖1，回歸曲線線性方程為:

y=0.089x －0.005，回歸系數(shù) R2=0.9966。

圖1 硒標準曲線

3.2 不同Na2SeO3濃度對香菇液體種子培養(yǎng)生物量的影響

表1 不同Na2SeO3濃度對香菇液體種子培養(yǎng)生物量的影響

從表1可以看出，發(fā)酵液中添加Na2SeO3，無論濃度多大，對液體種子生長都抑制;其中Na2SeO3為30μg·mL－1菌絲體生物量最大，為 0.86 g·50mL－1，Na2SeO3為 10μg·mL－1菌絲球直徑最大，為 0.98mm。

鏡檢觀察，當Na2SeO3為30μg·mL－1，菌球邊緣菌絲分支細密，菌絲粗壯。綜合菌絲直徑與菌絲干生物量，選

Na2SeO3為30μg·mL－1液體種子為繼續(xù)發(fā)酵用。

3.3 發(fā)酵液中添加不同濃度Na2SeO3對香菇菌富硒效果的影響

表2 不同Na2SeO3濃度對香菇菌液體發(fā)酵富硒效果的影響(X ±SD，n=3)

從表2中可以看出，添加Na2SeO3對菌絲干生物量、總硒含量、有機硒含量、有機化率都有促進作用，比不添加Na2SeO3相應(yīng)的各量都大?？偽恳恢彪SNa2SeO3添加量增大而增大，但在Na2SeO3濃度大于100μg·mL－1時，菌絲干生物量明顯減小，發(fā)酵液稍顯渾濁，菌絲生長受到抑制，有機硒化率也開始降低。所以 90μg·mL－1為最佳添加量。

3.4 發(fā)酵液添加不同濃度Na2SeO3對香菇菌3種胞外酶活性影響

從圖2可以看出，發(fā)酵液中添加濃度為60～90μg·mL－1的Na2SeO3，對淀粉酶、羧甲基纖維素酶、漆酶的活性起都起促進作用;當Na2SeO3濃度超過100μg·mL－1時三種酶活性被抑制，小于對照組;在Na2SeO3濃度60～90μg·mL－1三種酶活性先是隨濃度增高而增大，但當在Na2SeO3濃度超過一定范圍時，對三種酶的活性隨濃度增大而降低。其中，Na2SeO3為 90μg·mL－1時，淀粉酶活性最大為 14.7U;Na2SeO3為 80μg·mL－1時，羧甲基纖維素酶活性為18.7U;Na2SeO3為90μg·mL－1時，漆酶活性最大為0.44U。

4 結(jié)論

圖2 香菇菌液體發(fā)酵液中添加不同濃度Na2SeO3對3種胞外酶活性影響

通過實驗可以確定90μg·mL－1的Na2SeO3為最佳添加量，此時總硒含量、有機硒含量分別為183 μg·g－1、108.3 μg·g－1，有機化率為59.2%;此時淀粉酶、漆酶活性活性也達到最大，分別為14.7U、0.44U。綜上可以看出硒元素能促進香菇菌生長發(fā)育，這可能與含硒元素酶的活性有關(guān)。硒在微生物中以含硒酶和硒蛋白的功能形式存在［17］，含硒的GPx(谷胱甘肽過氧化物酶)家族催化超氧化物還原，防止細胞膜的氧化損傷;含硒的硫氧還蛋白還原酶(TDR)為細胞生長和分化所必需;硒還以硒代半胱氨酸(Sec)形式存在于甲酸脫氫酶、甘氨酸還原酶、氫化酶等含硒酶的活性中心，并為酶催化活性所必需。香菇菌內(nèi)硒元素含量增加，這些含硒酶活性都可能提高，由此促進了香菇菌的生長發(fā)育。

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