兗州卷柏乙醇提取物對人食管癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的抑制作用

謝永華　王冠明　溫?fù)P敏　楊維群

1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建泉州362000；2.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？蒲刑帲＝ㄈ?62000

兗州卷柏乙醇提取物對人食管癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的抑制作用

謝永華1王冠明1溫?fù)P敏1楊維群2▲

1.泉州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，福建泉州362000；2.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?？蒲刑?，福建泉州362000

目的探討兗州卷柏乙醇提取物對人食管癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的抑制作用。方法構(gòu)建人食管癌裸鼠移植瘤模型，隨機(jī)分成5組，每組各10只，分別灌胃給藥等體積的兗州卷柏乙醇提取物高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg），并設(shè)置陽性對照（環(huán)磷酰胺，5 mg/kg）組和陰性對照（生理鹽水，0.2 mL/只）組。每天給藥1次。給藥4 d后，開始測量并計(jì)算腫瘤體積。給藥20 d后，處死裸鼠，稱瘤重，并計(jì)算抑瘤率，肝臟、脾臟指數(shù)。結(jié)果實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，兗州卷柏乙醇提取物高、中劑量組的腫瘤體積均比陰性對照組小且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但均比陽性對照組大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低劑量組比陰性對照組?。≒＜0.05）。高劑量組食管癌腫瘤的重量比陰性對照組?。≒＜0.01），其抑瘤率為30.51%，但比陽性對照組大（P＜0.05）；中、低劑量均比陰性對照組?。≒＜0.05），抑瘤率分別為18.12%和9.25%。高劑量組肝臟指數(shù)比陰性對照組?。≒＜0.01）；中劑量組肝臟指數(shù)也比陰性對照組小（P＜0.05）。高劑量組脾臟指數(shù)比陰性對照組小（P＜0.05）。結(jié)論兗州卷柏乙醇提取可以抑制人食管癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的生長。

兗州卷柏乙醇提取物；食管癌；裸鼠；抑制作用

［Abstract］Objective To investigate the inhibitory effect of ethanol extract from Selaginella Involven（ESI）on human carcinoma of esophagus cells transplanted in nude mice.Methods The models of nude mice were transplanted with human carcinoma of esophagus，and divided randomly into 5 groups with ten mice in each group.The groups of mice were treated by oral gavage daily as follow：high dosage group with ESI（400 mg/kg），moderate dosage group with ESI（200 mg/kg），low dosage group with ESI（100 mg/kg），positive control group with cyclophosphamide（5 mg/kg）；negative control group with normal saline（0.2 mL/mice）.The volumes of the tumor in the mice were measured and calculated after 4 days.After 20 days，all the mice were sacrificed for the measurements of the tumor weights and the tumor inhibition rates.The liver and spleen indexes were measured.Results After the experiment，the tumor volumes in high dosage group and moderate dosage group were decreased compared with negative control group（P<0.01），which increased compared with positive control group（P<0.05）；the tumor volumes in low dosage group were decreased compared with negative control group（P<0.05）.The tumors in high dosage group were lighter than negative control group（P<0.01）with the tumor inhibition rate of 30.51%，which was heavier than positive control group（P<0.05）.The tumors in moderate and low dosage groups were lighter than negative control group（P<0.05）with the tumor inhibition rates of 18.12%and 9.25%respectively.The liver indexes in high dosage group were lower than negative control group（P<0.01）.The liver indexes in moderate dosage group were lower than negative control group（P<0.05）.The spleen indexes in high dosage group were lower than negative control group（P<0.05）.Conclusion The growth of transplanted tumor of human esophagus carcinoma in nude mice can be inhibited by ESI.

［Key words］Ethanol extract from Selaginella Involven；Human esophagus carcinoma；Nude mice；Inhibition

兗州卷柏（selaginellae involventis，Sping）為卷柏科植物兗州卷柏的全草，也被民間稱為地柏枝、金不換、金扁柏、石卷柏等，是多年生草本植物。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為其性味辛、甘、平、澀。中醫(yī)運(yùn)用兗州卷柏治療疾病已有悠久的歷史，其主治濕熱黃疸、肺炎、咳喘、痔瘡、痢疾、燙傷、小兒驚風(fēng)等［1］。在民間關(guān)于肝病的治療方面，兗州卷柏取得非常良好的效果［2］。研究人員運(yùn)用現(xiàn)代藥學(xué)研究方法證明了卷柏屬植物中含有多種有效化學(xué)成分，如：生物堿類、黃酮類、炔酚類等?，F(xiàn)代藥理研究表明卷柏屬植物具有多方面的藥理活性，如抗氧化、抗衰老、抗菌、抗病毒、抗腫瘤等［3］。謝永華等［4］研究表明兗州卷柏乙醇提物對人食管鱗癌細(xì)胞有一定的抑制作用。在此基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步觀察充州卷柏乙醇提物對人食管癌細(xì)胞株（EC-9706）裸鼠移植瘤生長情況的影響，為其作為天然抗腫瘤藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　一般材料

1.1藥材

兗州卷柏全草購于福建省三明市寧化縣草藥市場，并經(jīng)泉州市醫(yī)藥研究所蘇齊主任醫(yī)師鑒定為卷柏科，卷柏屬，兗州卷柏植物。

1.2試劑

人食管鱗癌細(xì)胞株（EC-9706）購自天呈科技生物公司。胎牛血清、PBS、DMSO、RPMI1640培養(yǎng)基（賽默飛世爾科技公司）。生理鹽水（NS，福州海王福藥有限公司），環(huán)磷酰胺（CTX，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）。二氧化碳培養(yǎng)箱（HF90，上海力申科學(xué)儀器有限公司），生物安全柜（BSC-1500IIA2-X，濟(jì)南鑫貝西生物技術(shù)有限公司），倒置顯微鏡（XG-202，南京江南永新光學(xué)有限公司），高壓滅菌鍋（HAV-50，日本平山制作所株式會社），電熱恒溫水槽（DK-600，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），天子天平（BSA1245，德國賽多利斯有限公司），臺式低速離心機(jī)（L500，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司）。

1.3實(shí)驗(yàn)動物

SPF級BALE/c裸鼠購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動物有限公司［動物合格證號SCXK（滬）2012-0002］，4～5周齡，雌雄不限，體重16～19 g，SPF級環(huán)境飼養(yǎng)5 d后用于實(shí)驗(yàn)。

2　方法

2.1兗州卷柏乙醇提取物的制備

兗州卷柏全草用粉碎機(jī)粉碎2～4 min，過100目篩備用。稱取20 g兗州卷柏干粉末，放入圓底燒瓶中，然后加入80%乙醇溶液200 mL。60℃回流提取3次，每次處理60 min。提取液過濾，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)，得到1.6 g乙醇提取物浸膏。

2.2人食管癌小鼠移植瘤動物模型的構(gòu)建

人食管鱗癌細(xì)胞（EC-9706）用含10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培養(yǎng)液（含青霉素和鏈霉素各100 U/mL）中，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件恒溫常規(guī)培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶消化對數(shù)生長期的EC-9706細(xì)胞，用RPMI培養(yǎng)液將細(xì)胞密度稀釋為1×108個/mL。BALB/c裸鼠右前肢腋部皮下接種0.2 mL腫瘤細(xì)胞，觀察7 d，選擇腫瘤直徑1 cm左右的裸鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3分組、給藥與處理

將50只裸鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為兗州卷柏乙醇提取物高、中、低3個劑量實(shí)驗(yàn)組，并設(shè)置陽性對照（環(huán)磷酰胺，CTX）組和陰性對照（生理鹽水，NS）組。分別灌胃給藥等體積的兗州卷柏乙醇提取物高、中、低劑量組（400、200、100 mg/kg），陽性對照（CTX，5 mg/kg）組和陰性對照（NS，0.2 mL/只）組。每天給藥1次，連續(xù)給藥20 d。給藥過程中觀察裸鼠生長狀況和體重變化。治療后第4天開始測量瘤長（L）和瘤寬（W），根據(jù)公式：腫瘤體積（V）=0.5×L×W2mm3計(jì)算腫瘤體積。20 d后，用吸入二氧化碳的方法處死裸鼠，并稱量腫瘤、裸鼠肝臟和脾臟的重量。根據(jù)以下公式計(jì)算抑瘤率和臟器指數(shù)。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3　結(jié)果

3.1兗州卷柏乙醇提取物對裸鼠移植瘤體積的影響

給藥16 d后，兗州卷柏乙醇提取物高、中劑量組的腫瘤體積均比陰性對照組小且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，低劑量組的腫瘤體積比陰性對照組小且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而高、中劑量組的腫瘤體積均小于陰性對照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。

給藥12 d后，兗州卷柏乙醇提取物低劑量組和陰性對照組的腫瘤體積均比陽性對照組大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。給藥16 d后，中、低劑量組的腫瘤體積均比陽性對照組大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，高、中劑量組的腫瘤體積均比陽性對照組大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而低劑量組的腫瘤體積大于陽性對照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表1。

表1　兗州卷柏乙醇提取物對裸鼠移植瘤體積的影響（）

表1　兗州卷柏乙醇提取物對裸鼠移植瘤體積的影響（）

注：與陰性對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與陽性對照組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；CTX：環(huán)磷酰胺；NS：生理鹽水

組別4 d8 d12 d16 d20 d CTX組高劑量組中劑量組低劑量組NS組46±3 45±4 48±3 51±4 50±4 100±7 102±8 105±7 115±6 120±10 148±10*155±11 160±12 165±14#170±12#176±11*184±11*198±13*#207±13#210±14#218±11**235±13**#251±13**#263±14*##280±15##

3.2兗州卷柏乙醇提取物對裸鼠食管癌腫瘤重量及抑瘤率的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，兗州卷柏乙醇提取物高劑量組食管癌腫瘤的重量小于陰性對照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其抑瘤率為30.51%；中、低劑量組食管癌腫瘤的重量均比陰性對照組小且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其抑瘤率分別為18.12%和9.25%。

高、中劑量組食管癌腫瘤的重量均比陽性對照組大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而低劑量組食管癌腫瘤的重量大于陽性對照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

兗州卷柏乙醇提取物各劑量組實(shí)體瘤的重量呈劑量與效應(yīng)關(guān)系，提示兗州卷柏乙醇提取物對裸鼠食管癌移植瘤的生長有明顯的抑制效果。見表2。

表2　兗州卷柏乙醇提取物對裸鼠食管癌抑瘤率的影響

3.3兗州卷柏乙醇提取物對人食管癌移植瘤裸鼠肝、脾的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，兗州卷柏乙醇提取物高劑量組肝臟指數(shù)小于陰性對照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而中劑量組肝臟指數(shù)比陰性對照組小且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。中、低劑量組肝臟指數(shù)均比陽性對照組大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

高劑量組脾臟指數(shù)比陰性對照組小且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而中、低劑量組脾臟指數(shù)與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。中劑量組脾臟指數(shù)比陽性對照組大且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而低劑量組脾臟指數(shù)大于陽性對照組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。見表3。

表3　兗州卷柏乙醇提取物對人食管癌移植瘤裸鼠肝、脾的影響

4　討論

食管癌是一種常見的消化道惡性腫瘤，發(fā)病年齡多發(fā)生在40歲以上，且男性發(fā)病率高于女性。其早期診斷率低，就診時的食管癌患者有70%～80%屬于晚期癥狀。食管癌病死率高達(dá)90%，成為近來年日益威脅人類身體健康的高危疾病。中國是世界上食管癌高發(fā)地區(qū)之一。在我國，食管癌發(fā)病率和死亡率分別占全部惡性腫瘤的第5位和第4位，每年平均約有15萬人死于此病。與大部分腫瘤類似，食管癌的早期癥狀不明顯，因此大多數(shù)患者確認(rèn)時已失去治療的最佳時期。目前治療食管癌的主要方法有手術(shù)治療、化學(xué)治療、放射療法等。由于腫瘤容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，食管癌患者的5年生存率為20%左右［5］。中晚期食管癌患者一般易發(fā)生腫瘤外侵或大面積腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移等癥狀，不適宜用手術(shù)治療，故一般采取保守治療，即用化學(xué)治療與放射治療相結(jié)合，并輔助內(nèi)科等綜合學(xué)科療法。但化學(xué)治療和放射療法容易對患者的自身免疫系統(tǒng)和正常的組織細(xì)胞產(chǎn)生某種程度的傷害，進(jìn)而影響其治療效果，也可能刺激腫瘤細(xì)胞的增殖，或者導(dǎo)致其他并發(fā)癥的發(fā)生［6-7］。隨著近年來對分子靶向藥物治療腫瘤效果研究的發(fā)展，由于分子靶向藥物具有特異性強(qiáng)、療效大、毒副作用小等特點(diǎn)，因而分子靶向療法在食管癌的治療方面也得到廣泛的關(guān)注［8］。然而，其臨床應(yīng)用效果目前還在探索之中，還需要有更多的大樣本研究試驗(yàn)對分子靶向藥物治療食管癌效果進(jìn)行評估。因此，分子靶向藥物在治療食管癌的應(yīng)用方面還有很大的局限性［9］。

食管癌早期確診患者只有少部分適合進(jìn)行手術(shù)治療，而單純采用化學(xué)療法所取得的療效往往不盡人意。目前，每種治療食管癌的方法都各有優(yōu)劣。近年來的藥理研究試驗(yàn)提示多種中醫(yī)藥在治療胃癌、食管癌、肝癌等惡性腫瘤方面有一定的療效［10-12］。在治療食管癌方面，中醫(yī)藥療法有毒副作用較小、療效明顯等特點(diǎn)。外科手術(shù)治療、化學(xué)治療或放射治療食管癌后，中醫(yī)藥療法可以具有減緩術(shù)后不良反應(yīng)、減弱放化療毒副作用、增加患者免疫功能及其增強(qiáng)放化療耐受程度等功能［13-14］。隨著現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)及其科學(xué)深入研究，發(fā)現(xiàn)中草藥在預(yù)防癌癥的發(fā)生、發(fā)展，及其聯(lián)合醫(yī)療過程中減少毒副作用有獨(dú)特的優(yōu)勢，并取得較好的效果。我國有著深厚的中醫(yī)藥理論、實(shí)踐基礎(chǔ)和豐富的天然藥物資源［15］。積極開發(fā)可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和對腫瘤有抑制效果的中醫(yī)藥，將是今后治療食管癌新方法的一個發(fā)展方向和必然趨勢。

兗州卷柏，為卷柏科植物兗州卷柏的全草，廣泛分布于我國的福建、浙江、廣西、廣東、江西、臺灣等地。充州卷柏具有消炎、止痛、抗病毒、抗腫瘤及其提高免疫功能等功效［16-17］。林美珍等［18］用充州卷柏作為民間中草藥治療肝炎患者，具有顯著療效。韓國東洋科學(xué)研究所利用卷柏提取物研發(fā)出一種新藥用于治療骨質(zhì)疏松癥［19］。近年來，運(yùn)用現(xiàn)代中藥分離制備技術(shù)提取兗州卷柏活性成分，并對其有效成分進(jìn)行藥理、毒理研究取得了一定的成效。兗州卷柏中提取出一些有效成分，分別具有抗氧化、抗菌、降血壓、抗腫瘤、抗病毒等效果。Seong等［20］研究表明兗州卷柏提取物具有抑制一氧化氮（NO）的功能，可以下調(diào)iNOS/ IL-1β的表達(dá)，進(jìn)而對痤瘡細(xì)胞有一定的治療效果。Gayathri等［21］研究發(fā)現(xiàn)兗州卷柏能抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和羥自由基活性，并且可以提高成年小鼠的免疫活性。張昊等［22］研究發(fā)現(xiàn)兗州卷柏的四種黃酮類化合物可以抑制人肝癌細(xì)胞HepG2的生長，并提示與甲氨蝶呤陽性對照組比較，這四種黃酮類化合物具有更強(qiáng)的抑制癌細(xì)胞活性。邱丹纓等［23］研究發(fā)現(xiàn)兗州卷柏生物堿可以有效抑制小鼠H22肝癌細(xì)胞的生長。謝永華等［24］研究表明兗州卷柏水提物具有一定的抗氧化能力，并對人食管癌細(xì)胞有一定的抑制效果。對人食管癌細(xì)胞的抑制效果隨其水提物的濃度增加而提高。謝永華等［4］研究表明兗州乙醇提取物對人食管癌細(xì)胞有一定的抑制效果。對人食管癌細(xì)胞生長的抑制效果隨兗州卷柏乙醇提取物濃度增大而增強(qiáng)。同時研究表明兗州卷柏乙醇提取物具有保護(hù)小鼠肝細(xì)胞損傷的功能。

本研究表明不同濃度的兗州卷柏乙醇提取物對人食管癌移植瘤均有一定的抑制作用，且各劑量組抑瘤效果呈劑量-效應(yīng)關(guān)系。結(jié)果提示，兗州卷柏乙醇提取可以抑制人食管癌裸鼠移植瘤細(xì)胞的生長，對今后兗州卷柏的開發(fā)應(yīng)用和腫瘤防治有重要的意義。

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Effect of ethanol extract from selaginella involven on human carcinoma of esophagus cells transplanted in nude mice

XIE Yonghua1Wang Guanming1WEN Yangmin1YANG Weiqun2▲
1.Department of Basic Medicine，Quanzhou Medical College，F(xiàn)ujian Province，Quanzhou 362000，China；2.Research Department，Quanzhou Medical College，F(xiàn)ujian Province，Quanzhou 362000，China

R285

A

1673-7210（2016）09（c）-0027-05

2016-05-20本文編輯：趙魯楓）

福建省教育廳A類項(xiàng)目（JA13394）。