lncRNA-AK058003誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

何曉琴　徐細(xì)明　余佳駿　甘園園　韓娜娜　張美霞

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢430060

lncRNA-AK058003誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

何曉琴徐細(xì)明余佳駿甘園園韓娜娜張美霞

武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北武漢430060

目的探討lncRNA-AK058003在肝癌細(xì)胞凋亡中的作用機(jī)制。方法采用lip2000轉(zhuǎn)染法分別將過表達(dá)質(zhì)粒（lncRNA-AK058003組）和空質(zhì)粒（Vector組）轉(zhuǎn)入HepG2和SMMC-7721細(xì)胞株，應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和蛋白質(zhì)免疫印跡法來檢測(cè)凋亡細(xì)胞及凋亡相關(guān)蛋白。結(jié)果構(gòu)建上調(diào)lncRNA-AK058003的表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞株后，凋亡細(xì)胞數(shù)和凋亡率明顯高于Vector組（P<0.05）；過表達(dá)lncRNA-AK058003能抑制MAPK信號(hào)通路關(guān)鍵磷酸化蛋白的表達(dá)。結(jié)論lncRNA-AK058003能夠調(diào)控MAPK信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

lncRNA-AK058003；肝癌；MAPK通路；凋亡

［Abstract］Objective To explore the mechanism of lncRNA-AK058003 in liver cancer cells apoptosis.Methods Flow cytometry and protein immunoblot methods were applied to detecting cell apoptosis and related proteins，after transfected lncRNA-AK058003 or vector in HepG2 and SMMC-7721 cells with lip2000.Results Transfected HepG2 and SMMC-7721 with construction of over-expression lncRNA-AK058003 plasmid，the number of apoptotic cells and apoptotic rate are significantly higher than the empty plasmid group（P<0.05）.The key phosphorylated proteins of MAPK signal pathway were suppressed by lncRNA-AK058003.Conclusion LncRNA-AK058003 can promote liver cancer cells apoptosis by adjusting MAPK signaling pathways.

［Key words］lncRNA-AK058003；Liver cancer；MAPK signal pathway；Apoptosis

原發(fā)性肝癌是全球常見的惡性腫瘤之一，其中男性肝癌死亡率在腫瘤相關(guān)性死亡中位居第二［1］，而肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制仍不明確。前期研究表明肝癌的發(fā)生與細(xì)胞凋亡分子和信號(hào)通路異常相關(guān)［2-4］。因此從分子水平研究肝癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制，并將特異性分子作為臨床治療新靶點(diǎn)。

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是近年來備受矚目的一類長(zhǎng)度大于200 nt的非編碼RNA，其位于細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物［5-7］。由于lncRNA無開放閱讀框，所以沒有或很少具有編碼蛋白質(zhì)的能力，主要是以RNA形式，在表觀遺傳學(xué)（包括DNA甲基化、組蛋白修飾、染色質(zhì)重構(gòu)）、轉(zhuǎn)錄調(diào)控（通過募集或者干擾一些轉(zhuǎn)錄因子在蛋白編碼基因上游啟動(dòng)子區(qū)定位，而影響下游基因的表達(dá)）及轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)［8-9］。目前，已有文獻(xiàn)證實(shí)部分lncRNA在腫瘤凋亡中發(fā)揮重要作用［10-11］，而lncRNA與肝癌凋亡相關(guān)的文獻(xiàn)相對(duì)較少。因此，深入探討lncRNAs在肝癌凋亡的作用及其分子機(jī)制，將有助于全面地了解肝癌發(fā)生的過程。

1　對(duì)象與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞系HepG2和SMMC-7721購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)，按照50%培養(yǎng)基，40%血清和10% DMSO進(jìn)行梯度凍存，保存于液氮中。HepG2采用含有10%Gibico胎牛血清和1%青-鏈霉素的Hyclone DMEM培養(yǎng)基，而SMMC-7721在含10%Gibico胎牛血清和1%青-鏈霉素的Hyclone RPMI培養(yǎng)基置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

將構(gòu)建的過表達(dá)質(zhì)粒及空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2和SMMC-7721細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，用Trizol提取總RNA［12］，并用Nano-Drop2000C紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度及純度。然后按TOYOBO試劑盒（QPK-201，日本）說明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后按照Takara qRT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行操作，設(shè)立3個(gè)復(fù)孔，GAPDH為內(nèi)參基因，7500 Fast System SDS軟件分析Ct值，采用2－ΔΔCt法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。引物序列由武漢巴菲爾生物有限公司設(shè)計(jì)合成：GAPDH-F：5'-AGAAGGCTGGGGCTCATTG-3'；GAPDH-R：5'-AGGG GCCATCCACAGTCTTC-3'；AK058003-F：5'-GGGAAC AAAGATGGTTTCTACGT-3'；AK058003-R：5'-ACTGGT TCATAGTTAGGCTGGAT-3'。

1.3過表達(dá)lncRNA-AK05800質(zhì)粒的構(gòu)建

用PCR儀擴(kuò)增并獲取目的基因，瓊脂糖電泳進(jìn)行驗(yàn)證。然后將10 μL的PCR產(chǎn)物與載體GV144（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）交換反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到100 μL感受態(tài)細(xì)胞E.coli中，取適量菌液均勻涂布在含有卡那霉素抗性的瓊脂糖平板，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h。最后對(duì)菌液和質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定和測(cè)序。

1.4脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系

細(xì)胞融合度達(dá)50%～80%時(shí)，更換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2 h。分別用Optimem稀釋lip2000（Thermo，Invitrogen）和質(zhì)粒，靜置5 min后將兩者輕輕混合，室溫孵育20 min加入培養(yǎng)皿內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)［10］。

1.5細(xì)胞凋亡檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染48 h的腫瘤細(xì)胞上清，用胰酶消化細(xì)胞，PBS洗滌兩次，用凋亡試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司）240 μL 1xBinding buffer重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/mL，加入5 μL Annexin V-APC和10 μL 7-氨基放線菌素D（7-AAD）輕輕混勻，室溫避光反應(yīng)30 min，再加入260 μL 1×Binding buffer稀釋。用流式細(xì)胞儀分析（Becton-Dickinson，USA），采用FACS express version 3軟件分析結(jié)果。

1.6蛋白質(zhì)免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）

提取肝癌細(xì)胞系總蛋白，4℃，12 000 r/min離心5 min，將上清分裝到1.5 mL的離心管中放于-20℃保存。制備SDS-PAGE凝膠，根據(jù)蛋白濃度計(jì)算出上樣體積，與上樣緩沖液1∶1混勻，沸水浴30 min，加樣。60 mA恒流電泳約1 h，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗過夜孵育（表1），二抗（生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG 1∶10 000）孵育，漂洗，經(jīng)ECL試劑盒（BestBio，上海）顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描處理。通過Pathway分析預(yù)測(cè)lncRNA-AK058003與MAPK信號(hào)通路相關(guān)，采用Western blot檢測(cè)MAPK信號(hào)通路中的3個(gè)主要蛋白：ERK、P38、JNK及磷酸化的蛋白。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1　抗體詳細(xì)信息

2　結(jié)果

2.1lncRNA-AK058003質(zhì)粒構(gòu)建和克隆篩選

構(gòu)建lncRNA-AK058003過表達(dá)的質(zhì)粒（圖1A），以瓊脂糖凝膠電泳初步表明lncRNA-AK058003目的序列成功與載體結(jié)合（圖1B）。經(jīng)測(cè)序分析，進(jìn)一步證明重組體中含過表達(dá)的目的片段，且堿基序列完整（圖1C）。

圖1　LncRNA-AK058003質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定

2.2瞬時(shí)轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系后lncRNA-AK058003表達(dá)

RT-PCR及qRT-PCR結(jié)果顯示：HepG2和SMMC-7721轉(zhuǎn)染lncRNA-AK058003組顯著高于Vector組，差異均有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），見圖2。結(jié)果顯示，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染lncRNA-AK058003成功。

2.3lncRNA-AK058003促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示：在HepG2中過表達(dá)lncRNA-AK058003后凋亡細(xì)胞數(shù)增多（圖3A～B），凋亡率明顯高于Vector組（P<0.01）（圖3E）；同時(shí)也在SMMC-7721中進(jìn)行檢測(cè)，過表達(dá)lncRNA-AK058003后凋亡細(xì)胞數(shù)和凋亡率均顯著高于Vector組（P<0.05）（圖3C～E）。為了證明lncRNA能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，采用Western blot檢測(cè)了凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Caspase-3的蛋白變化。如圖3F所示：過表達(dá)lncRNAAK058003后，促凋亡蛋白Bax、Caspase-3表達(dá)量較空質(zhì)粒組增高，而抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)量降低。進(jìn)一步證明lncRNA-AK058003能促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

圖2　轉(zhuǎn)染肝癌細(xì)胞系A(chǔ)K058003的相對(duì)表達(dá)量

***

**

圖3　LncRNA-AK058003誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

2.4lncRNA-AK058003與MAPK信號(hào)通路的關(guān)系

過表達(dá)lncRNA-AK058003的HepG2中P-ERK，P-P38及P-JNK蛋白變化較Vector組顯著降低，然而ERK和P38蛋白的變化不顯著，說明lncRNAAK058003可能參與抑制MAPK信號(hào)通路的激活。見圖4。

圖4　lncRNA-AK058003與MAPK信號(hào)通路的關(guān)系

3　討論

細(xì)胞凋亡是為調(diào)控機(jī)體的發(fā)育和維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的主動(dòng)程序性死亡的過程［13］。有學(xué)者認(rèn)為腫瘤的無限制增長(zhǎng)是腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)制失控所致［14］。最近的研究表明，凋亡誘導(dǎo)療法是一種安全有效的抗癌方法，從而可能成為癌癥治療方式之一［15］。因此，尋找誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的基因有助于開辟腫瘤治療的新天地。本研究首次探討了lncRNA-AK058003與肝癌細(xì)胞凋亡的關(guān)系，通過上調(diào)lncRNA-AK058003的表達(dá)，進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)和Western blot實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)lncRNA-AK058003能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，增加促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，并且可以抑制MAPK信號(hào)通路的激活。

前期的研究中，Wang等［16］在胃癌中新發(fā)現(xiàn)缺氧lncRNA-AK058003通過正向調(diào)控SNCG的CpG島甲基化來促進(jìn)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移。同時(shí)He等［17］在乳腺癌中發(fā)現(xiàn)LncRNA-AK058003通過調(diào)控γ-synuclein的表達(dá)水平促進(jìn)乳腺癌的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。這兩項(xiàng)研究均表明lncRNA-AK058003在腫瘤中發(fā)揮著重要的作用，卻沒有討論該基因與腫瘤凋亡的關(guān)系。另外，Ma等［10］發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子能夠誘導(dǎo)lncRNA-HULC調(diào)節(jié)miR-9的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡；Huang等［11］研究表明，lncRNA-TUG1在核轉(zhuǎn)錄因子（SP1）誘導(dǎo)下抑制KLF2蛋白表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖，抑制腫瘤細(xì)胞凋亡。前兩項(xiàng)研究均探討了lncRNA參與肝癌細(xì)胞的凋亡的分子機(jī)制，未對(duì)具體信號(hào)通路進(jìn)行研究。近期的研究發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路的異常與肝癌的進(jìn)展和不良預(yù)后密切相關(guān)［18-20］。這些研究均表明，lncRNA和MAPK信號(hào)通路在肝癌的發(fā)生機(jī)制中扮演著重要的角色。

當(dāng)然，本研究仍然存在不足：①?zèng)]有檢測(cè)臨床標(biāo)本lncRNA的表達(dá)量；②檢測(cè)方式單一；③lncRNAAK058003調(diào)控MAPK信號(hào)通路的機(jī)制不明確。本研究組后期的研究將對(duì)lncRNA-AK058003在肝癌組織中的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，并探討該基因在肝癌發(fā)生中的分子機(jī)制。

綜上所述，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA-AK058003能夠調(diào)控MAPK信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。這將為肝癌的發(fā)生、發(fā)展、診斷和預(yù)后判斷、新治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)，有著重要的臨床意義。

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Mechanism of lncRNA-AK058003 in liver cancer cells apoptosis

HE Xiaoqin XU Ximing YU Jiajun GAN Yuanyuan HAN Nana ZHANG Meixia
Cancer Center，Renmin Hospital of Wuhan University，Hubei Province，Wuhan430060，China

R735.7

A

1673-7210（2016）09（c）-0023-04

2016-04-14本文編輯：任念）

湖北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2012FKC14301）。

徐細(xì)明（1976-），男，博士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師；研究方向：lncRNA在肝癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制研究。