回藥復(fù)方筍卜黎合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉　軍　宮凱敏　王銀潔　柳 茜　趙錦濤　李文靜

寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬銀川市中醫(yī)醫(yī)院，寧夏　銀川　750001

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回藥復(fù)方筍卜黎合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

劉軍宮凱敏王銀潔柳 茜趙錦濤李文靜

寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬銀川市中醫(yī)醫(yī)院，寧夏銀川750001

目的：建立回藥復(fù)方筍卜黎合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜(TLC)法對(duì)制劑中的主要藥味甘松、黃連、干姜進(jìn)行定性鑒別；采用高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定陳皮中的橙皮苷含量。結(jié)果：回藥復(fù)方筍卜黎合劑中的甘松、干姜、黃連的薄層色譜具有鑒別特征，斑點(diǎn)清晰，分離度較好，陰性對(duì)照無(wú)干擾。橙皮苷在0.02～0.50μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r=0.9999。結(jié)論：該方法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好，可作為回藥復(fù)方筍卜黎合劑的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

回藥復(fù)方筍卜黎；薄層色譜法(TLC)；高效液相色譜法(HPLC)；橙皮苷；質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

回藥復(fù)方筍卜黎合劑是寧夏醫(yī)科大學(xué)附屬銀川市中醫(yī)醫(yī)院使用了十多年的醫(yī)院協(xié)定處方劑，目前為在研醫(yī)院制劑品種，該方由甘松(筍卜黎)、柴胡(突魯必的)、延胡索(折荅剌丸)、黃芩、陳皮、黃連、半夏、干姜等13味藥組成?；蒯t(yī)理論認(rèn)為胃病病因病機(jī)與“四種原質(zhì)”中的“熱”和“冷”以及“四體液”中的“白痰根源密切”相關(guān)[1]，該方根據(jù)回醫(yī)藥典籍《回回藥方》中“舍剌必筍卜黎”和《瑞竹堂經(jīng)驗(yàn)方》中的“半夏湯”進(jìn)行組方，主要以“調(diào)冷熱”、“去痰”、“消痰”為主，全方溫寒并用，具有辛開苦降，行氣止痛，化痰消痞的功效，主要用于急慢性胃炎，胃及十二指腸潰瘍，糖尿病胃輕癱引起的胃脘部痞滿脹痛、泛酸嘈雜、食欲不振等。為控制制劑的質(zhì)量，確保為患者提供安全有效的回醫(yī)藥醫(yī)院制劑，筆者研究并建立了甘松、干姜、黃連的薄層色譜方法，并采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)制劑中陳皮的有效成分橙皮苷進(jìn)行了含量測(cè)定。

1　儀器與材料

1.1儀器XA105型電子分析天平(梅特勒-托利多公司)；1260系列高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫公司，配有G1315D型檢測(cè)器；Waters C18柱4.6mm×250mm,5μm)；KQ-500DA型數(shù)控超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵。

1.2材料硅膠GF254、硅膠G薄層板(青島海洋化工有限公司)；橙皮苷對(duì)照品(批號(hào)：10721-201316，含量以95.3%計(jì))、甘松對(duì)照藥材(批號(hào)：121402-201403)、干姜對(duì)照藥材(批號(hào)：120942-201309)、黃連對(duì)照藥材(批號(hào)：120913-201310)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院?；厮帍?fù)方筍卜黎合劑由銀川市中醫(yī)醫(yī)院制劑中心制備(批號(hào)：20160201、20160202、20160203)，陰性對(duì)照樣品(按處方比例與制法制成缺被測(cè)藥材的陰性對(duì)照樣品溶液)。乙腈、甲酸為色譜純，水為蒸餾水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1薄層色譜鑒別[2]

2.1.1甘松鑒別[3-4]取回藥復(fù)方筍卜黎合劑30mL，用石油醚(60℃～90℃)提取2次，每次30mL，合并石油醚液，蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。另取甘松對(duì)照藥材1g，加50mL水回流提取30min，濾過(guò)，濾液濃縮至20mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例與制法制成缺甘松的陰性對(duì)照樣品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部0502薄層色譜法)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以石油醚(60℃～90℃)-乙酸乙酯(1∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(254nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾。見圖1。

2.1.2干姜鑒別[5]取回藥復(fù)方筍卜黎合劑30mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。另取干姜對(duì)照藥材1g，加50mL水回流提取30min，濾過(guò)，濾液濃縮至20mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例與制法制成缺干姜的陰性對(duì)照樣品溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部0502薄層色譜法)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60℃～90℃)-乙酸乙酯(3∶2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾。見圖2。

2.1.3黃連鑒別取回藥復(fù)方筍卜黎合劑30mL，用乙酸乙酯振搖提取2次，每次30mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘?jiān)右掖?mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃連對(duì)照藥材1g，加50mL水回流提取30min，濾過(guò)，濾液濃縮至20mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。按處方比例與制法制成缺黃連的陰性對(duì)照樣品溶液。取缺黃連的陰性樣品30mL，制成陰性對(duì)照溶液。照薄層色譜法(《中國(guó)藥典》2015年版四部0502薄層色譜法)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60℃～90℃)-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(1∶10∶2∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性樣品無(wú)干擾。見圖3。

2.2含量測(cè)定[6]

2.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)色譜柱：Waters C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：乙腈-0.1%甲酸(20∶80)；檢測(cè)波長(zhǎng)：283nm；柱溫：30℃；流速：1mL/min。理論板數(shù)按橙皮苷峰計(jì)算不低于5000。

2.2.2溶液的制備2.2.2.1對(duì)照品溶液取橙皮苷對(duì)照品10.00mg，精密稱定，置100mL容量瓶中，加甲醇溶解，定容，制成濃度為100μg/mL-1的橙皮苷對(duì)照品溶液。

2.2.2.2供試品溶液取本品藥液5mL，精密量取，置50mL容量瓶中，加水稀釋，定容，再取以上藥液5mL，精密量取，置25mL容量瓶中，加甲醇定容，精密稱重，超聲30min，補(bǔ)足重量，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2.3陰性對(duì)照溶液 按處方比例稱取缺陳皮的其余藥味，按回藥復(fù)方筍卜黎合劑制備工藝制備陰性樣品，然后按“2.2.2.2”項(xiàng)下方法操作，制備陰性對(duì)照溶液。

2.2.3專屬性實(shí)驗(yàn)取“2.2.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，結(jié)果在與對(duì)照品保留時(shí)間相同的位置上無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明回藥復(fù)方筍卜黎合劑中其他成分對(duì)橙皮苷的測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見圖4。

2.2.4線性關(guān)系考察分別吸取“2.2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.8、1、2、5mL，用甲醇稀釋為2、4、8、10、20、50μg/mL的系列橙皮苷對(duì)照品溶液，取上述對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，記錄色譜峰。以峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得橙皮苷回歸方程為Y=12.413X-0.3150，r=0.9999(n=6)。結(jié)果表明，橙皮苷在0.02～0.50μg范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

2.2.5精密度試驗(yàn)吸取上述對(duì)照品溶液(8μg/mL)10μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定其峰面積，結(jié)果RSD為0.85%，表明儀器精密度良好。

2.2.6重復(fù)性試驗(yàn)精密量取6份回藥復(fù)方筍卜黎合劑(批號(hào)20160201)藥液各5mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法，分別制備供試品溶液，進(jìn)樣10μl，測(cè)定峰面積，結(jié)果RSD為1.23%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn)精密量取同一對(duì)照品溶液(2μg/mL)，分別于0、2、4、8、12、24h各進(jìn)樣1次，每次10μl，測(cè)定其峰面積，結(jié)果RSD為1.02%。表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定。2.2.8加樣回收率試驗(yàn)精密量取2.5mL橙皮苷含量為44μg/mL的回藥復(fù)方筍卜黎合劑(批號(hào)20160201)藥液6份，分別精密加入橙皮苷對(duì)照品溶液(40μg/mL)2.5mL。按照“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備供試品6份，依法進(jìn)行含量測(cè)定，計(jì)算加樣回收率和RSD。結(jié)果見表1。

表1　橙皮苷加樣回收率　(n=6)

2.2.9含量測(cè)定分別取3批回藥復(fù)方筍卜黎合劑各5mL，每批次平行取樣3份，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算樣品中橙皮苷的含量。結(jié)果見表2。

表2　三批回藥復(fù)方筍卜黎合劑中橙皮苷的含量(n=3)

結(jié)果分析：回藥復(fù)方筍卜黎合劑中橙皮苷平均含量為44μg/mL，考慮到不同批次中藥飲片陳皮中橙皮苷的含量差異以及生產(chǎn)、貯存等因素，故將指標(biāo)成分含量下浮30%，故暫定制劑成品含橙皮苷不低于31μg/mL。

3　討論

3.1甘松為回藥復(fù)方筍卜黎合劑處方中主要藥味，性溫，味辛；具有理氣止痛，開郁醒脾之功效，回醫(yī)藥擅長(zhǎng)于使用芳香藥治療疾病，在《回回藥方》中，治療胃病主要“嘔吐門”、“痞證門”及部分“雜證門”的方藥，方中大部分使用“筍卜黎”即甘松，其中以甘松為主藥的代表方主要有“舍剌必筍卜黎”、“古阿里失虎即方”，回藥復(fù)方筍卜黎合劑在組方中繼承回醫(yī)藥經(jīng)典，結(jié)合現(xiàn)代中醫(yī)藥理論，開發(fā)回醫(yī)藥制劑。在其鑒別中，參考《中國(guó)藥典》2015年版一部甘松項(xiàng)下[7]鑒別方法，提取溶劑不變，將超聲處理方法改為回流提取，充分提取合劑中的甘松化學(xué)成分，建立的薄層鑒別方法專屬性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)單。3.2回藥復(fù)方筍卜黎合劑中藥味較多(13味)，建立其含量測(cè)定方法時(shí)陰性干擾較大，且合劑的前處理方法都較為復(fù)雜，最初選擇黃芩中的黃芩苷進(jìn)行含量測(cè)定，但陳皮中的某個(gè)成分干擾；最終選用陳皮的橙皮苷作為含量測(cè)定成分，建立的含量測(cè)定方法簡(jiǎn)單易行。在選擇三種色譜柱進(jìn)行專屬性試驗(yàn)時(shí)，色譜條件相同，phenomenex Luna C18柱(4.6mm×250mm，5μm)和Agilent TC-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)保留時(shí)間分別是21min和19min左右，峰形對(duì)稱性均較好，而Waters C18柱(4.6mm×250mm，5μm)保留時(shí)間為17min，最終選擇Waters C18柱(4.6mm×250mm，5μm)。

綜上所述，研究制定了回藥復(fù)方筍卜黎合劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、可行，能夠控制本制劑的質(zhì)量，為該制劑開發(fā)為醫(yī)院制劑打下基礎(chǔ)。

[1] 牛陽(yáng).《回回藥方》研究[M].銀川:陽(yáng)光出版社,2010:147-218.

[2] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(四部)[S].中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:57-58.

[3] 潘曉麗，李瑩，董小萍，等.甘松藥材的薄層色譜研究[J]. 黑龍江醫(yī)藥,2009,22(3):275-276.

[4] 劉英慧.甘松質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及揮發(fā)油提取包合工藝的研究[D].長(zhǎng)沙：中南大學(xué),2012.

[5] 黃可婧，王麗娟.附子理中片的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].天津藥學(xué),2014,26(5):16-22.

[6] 仇雅靜，朱梓文.HPLC法測(cè)定通腸理氣合劑中芍藥苷和橙皮苷的含量[J].中國(guó)藥事，2012，26(12):1366-1368.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典(一部)[S].中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015:86.

(編輯：穆麗華)

Study on Quality Standard for Compound Sunboli Mixture of Hui Medicine

LIU JunGONG KaiminWANG YinjieLIU QianZHAO JintaoLI Wenjing

Traditional Chinese Medicine Hospital of Yinchuan Affiliated Ningxia Medical University,Yinchuan 750001, China

Objective To establish the quality standard of Compound Sunboli Mixture of Hui Medicine.Methods TLC was applied to the qualitative identification of Radix et Rhizoma Nardostachyos，Rhizoma Zingiberis，Rhizoma Coptidis，and HPLC was applied to the quantitative determination of hesperidin in the prescription.Results Radix et Rhizoma Nardostachyos，Dried Ginger，Rhizoma Coptidis could be detected by TLC，the spots were clear and there was no interference for the negative samle. A good linearity of hesperidin was showed in the range of 0.2～5.0μg(r=0.9999). Conclusions The methods are highly specific, sensitive and with good reproducibility. It can be used for the quality control of Compound Sunboli Mixture of Hui Medicine.

Compound Sunboli Mixture of Hui Medicine; TLC; HPLC; Hesperidin; Quality Standard

2016-06-15

寧夏自然科學(xué)基金項(xiàng)目(NZ14245)。

劉軍(1971-)，男，本科，主任藥師，研究方向?yàn)橹?回)藥制劑及臨床中藥學(xué)。E-mail：nxljj@163.com。

R284.1

A

1007-8517(2016)16-0005-04