促血管生成素-1在心肌梗死大鼠臍血干細胞移植促進血管新生中作用

趙瑞平，韓煒，李洪宇，孫凱，胡江

· 論著 ·

促血管生成素-1在心肌梗死大鼠臍血干細胞移植促進血管新生中作用

趙瑞平1，韓煒1，李洪宇1，孫凱2，胡江3

目的 探討人臍血干細胞移植于心肌梗死大鼠后是否通過促血管生成素-1（Ang-1）介導血管再生。方法 雄性Sprague-Dawley大鼠40只，隨機分為3組，經(jīng)手術干預后死亡10只，假手術組（9只）、對照組（11只）及移植組（10只）。假手術組僅開胸，冠狀動脈前降支（LAD）掛線不結(jié)扎；對照組結(jié)扎LAD造成心肌梗死后，經(jīng)靜脈注射生理鹽水；移植組結(jié)扎LAD造成心肌梗死后，經(jīng)靜脈注射等量干細胞懸液，術后4周處死大鼠，留取心臟左室組織。免疫組化染色人特異性心肌肌鈣蛋白T（cTnT）、人主要組織相容性復合體（hMHC）、VIII因子、Ang-1蛋白，RT-PCR檢測心肌組織Ang-1的mRNA表達水平。結(jié)果 在移植組可見胞漿呈褐色的cTnT和hMHC陽性細胞。與假手術組比較，對照組和移植組Ang-1免疫組化染色積分光密度（IOD）值明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組相比，移植組Ang-1免疫組化染色IOD值明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。與假手術組比較，對照組和移植組Ang-1 mRNA的相對表達明顯增加，同時與對照組相比，移植組Ang-1 mRNA相對表達也明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）。Ⅷ因子為心肌毛細血管密度測定指標，移植組梗死周邊區(qū)毛細血管密度較對照組明顯增加，而假手術組無明顯變化。結(jié)論 經(jīng)靜脈移植人臍血干細胞能在心肌梗死大鼠梗死心肌存活并表達心肌特異性收縮蛋白，同時心肌毛細血管密度增加，其機制可能為Ang-1表達增加進而促進血管新生。

干細胞；Ang-1；Ang-2；心肌梗塞；臍血干細胞；促進血管新生

目前，心肌梗死的主要治療方法包括常規(guī)藥物治療、經(jīng)皮冠狀動脈介入治療和冠狀動脈旁路移植術等。這些治療方法能及時挽救缺血頓抑心肌，改善預后。但無法使已梗死的心肌細胞再生，不能有效阻止心室重塑。此外，對于冠狀動脈彌漫性狹窄的患者，上述治療也不能起到心肌再血管化的作用。近年來，干細胞移植治療在這一方面顯示出廣闊的前景。自Orlic等［1］2001年在NATURE上報道骨髓干細胞能分化為心肌細胞后，大量的基礎與臨床研究［2-4］均證實了干細胞的安全性和有效性。用于治療的干細胞種類包括胚胎干細胞、臍血干細胞、骨骼肌成纖維細胞、骨髓間充質(zhì)細胞和內(nèi)皮祖細胞等［5，6］。臍血干細胞的主要優(yōu)勢包括：①具有多種分化潛能，既可分化為心肌細胞，也可分化為新生血管內(nèi)皮細胞等；②較骨髓或骨骼肌起源的干細胞，具有更強的增殖分化潛能；③受環(huán)境影響小，攜帶異?；蚋?；④取材方便，不會對供體產(chǎn)生傷害［7］?；谏鲜鲈颍氀獊碓吹母杉毎麑⒊蔀榧毎浦仓委熜募」Ｋ赖闹匾毎?。

另有研究證實，血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、促血管生成素-1（Ang-1），促血管生成素-2（Ang-2）和基質(zhì)細胞衍生因子在血管新生中都起到重要作用。VEGF與其受體結(jié)合能促進形成不成熟的滲漏的血管，血管生長素（Ang）可增加缺血性心臟病的側(cè)支循環(huán)，Ang-1與其受體結(jié)合后可促進血管成熟、穩(wěn)定。Ang-2是Ang-1的拮抗劑，在VEGF存在的情況下能進一步促進毛細血管新生。人臍血干細胞是否通過這些因子的作用而促進血管新生尚不清楚。

本研究從臍帶血中分離干細胞，將其移植于心肌梗死大鼠模型中，觀察移植臍血干細胞對心肌梗死后大鼠心臟血管新生的影響，并探討Ang-1在血管新生中的作用。

1　材料與方法

1.1試劑和實驗動物分組 雄性Sprague-Dawley大鼠40只，體重200～250 g，北京友誼醫(yī)院動物實驗室提供，無特殊病原體；兔抗大鼠Ⅷ因子抗體，購自北京中杉有限公司；鼠抗人cTnT單抗，購自北京邁新有限公司；鼠抗人MHC單抗，購自北京中杉有限公司；兔抗大鼠Ang-1單抗，購自武漢博士德有限公司。隨機分為3組，假手術組（13只）、對照組（13只）以及移植組（14只）。

1.2臍血干細胞分離和提取 臍帶血來自北京市臍血干細胞庫，均采自無妊娠合并癥、身體健康者，捐獻者自愿捐獻且同意用于科學研究和臨床治療。共用臍血5份，一次性血袋取血80～120 ml，6 h內(nèi)分離，測CD34+含量在0.35%～0.42%之間，4 h內(nèi)進行尾靜脈注射。

1.3心肌梗死動物模型制作和細胞移植 對照組和移植組動物均用10%水合氯醛0.3 ml/100 g進行腹腔麻醉。麻醉成功后，將動物放置在實驗臺上，固定，連接呼吸機、心電監(jiān)護儀。大鼠左側(cè)胸部備皮、消毒、鋪巾，逐層分離，暴露肋間肌，切開第4、5肋間肌，暴露心臟。辨別左心耳和動脈圓錐，在動脈圓錐和左心耳間，在距左心耳下1 mm處（相當于左前降支近端）用Prolene線結(jié)扎。其中假手術組只掛線不結(jié)扎。左室前壁顏色變白、活動減弱和心電圖ST段明顯抬高作為模型成功標志。對照組和移植組在術后24 h內(nèi)經(jīng)尾靜脈分別注射0.5 ml生理鹽水和0.5 ml人臍血基質(zhì)細胞（hUCBSC）懸液（含干細胞2×107/ml）。普通飼料喂養(yǎng)，4周后處死。

1.4取材過程 細胞移植后4周，處死動物，取心臟標本。PBS液洗滌后，沿左室長軸斷橫切心臟，一部分用4%甲醛固定24 h，石蠟包埋，5μm切片，每塊標本橫斷常規(guī)切片10張，用于免疫組化染色；其余部分放入凍存管立即置入液氮罐轉(zhuǎn)移入-80℃冰箱凍存。

1.5逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應（RT-PCR） 取心臟組織100 mg使用Trizol一步法提取細胞總RNA，繼而將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，將目的基因Ang-1與內(nèi)參β-actin按照預先設計好的引物進行擴增。Ang-1上游引物：5′-GGAGCATGTGATGGAAA ATTA-3′，Ang-1下游引物：5′-TGTGTTTTC CCTCCATTTCTA-3′，擴增產(chǎn)物長度：360bp。β-actin上游引物：5′- CTCTGGTC GTACCACT GGCATTG-3′；β-actin下游引物 5′- CCTG CTTGCTGATCCACATCTGC-3′。PCR擴增產(chǎn)物進行電泳，在Eagle Eye II凝膠成像分析儀上掃描定量，讀取各PCR擴增帶的積分光密度值（IOD），根據(jù)Ang-1條帶和β-actin條帶的IOD值比值分析其mRNA表達水平。

1.6免疫組化染色步驟 ① 石蠟切片脫蠟、水化，PBS洗2次，各5 min；② 蒸餾水或PBS配置新鮮的3% H2O2，室溫封閉5～10 min，蒸餾水洗3次；③ 高溫抗原修復，PBS洗5 min，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min。甩去多余液體；④滴加一抗（VIII因子抗體1：50，Ang-1 1：100，cTnT 1：50，MHC 1：50），室溫1h或者4℃過夜（后在37°C復溫45 min）；⑤ PBS洗3次每次2 min，滴加生物素化二抗（1：20），20～37℃ 20 min；⑥ PBS洗3次每次2 min，滴加試劑SABC，20～37℃ 20 min；⑦ PBS洗4次，每次5 min；⑧DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）；⑨蒸餾水洗、蘇木素復染2 min、鹽酸酒精分化；⑩脫水、透明、封片、鏡檢。

1.8統(tǒng)計學處理 所有數(shù)據(jù)分析均用SPSS 18.0軟件包進行，組間比較采用方差分析和t檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2　結(jié)果

2.1人特異性心肌肌鈣蛋白T（cTnT）和人主要組織相容性復合體（hMHC）免疫組化檢測結(jié)果在移植組可見胞漿呈褐色的cTnT和hMHC陽性細胞，表明hUCBSC可在梗死區(qū)心肌內(nèi)存活并分化為心肌細胞，而在對照組和假手術組標本內(nèi)未見陽性移植細胞（圖1、圖2）。

圖1　hMHC免疫組化染色（×400；A：移植組；B：對照組；C：假手術組）

圖2　人特異性cTnT免疫組化染色（×400；A：移植組；B：對照組；C：假手術組）

2.2Ang-1 免疫組化檢測結(jié)果 與假手術組比較，對照組和移植組Ang-1免疫組化染色積分光密度（IOD）值明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與對照組相比，移植組Ang-1免疫組化染色IOD值明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）（圖3、表1）。

圖3　Ang-1免疫組化染色（×400，A移植組，B對照組，C假手術組）

表1　三組Ang-1免疫組化結(jié)果比較

2.3Ang-1 RT-PCR檢測結(jié)果 與假手術組比較，對照組和移植組Ang-1 mRNA的相對表達明顯增加，同時與對照組相比，移植組Ang-1 mRNA相對表達也明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.01）（圖4、表2）。

2.4Ⅷ因子免疫組化染色結(jié)果 Ⅷ因子為心肌毛細血管密度測定指標，移植組梗死周邊區(qū)毛細血管密度較對照組明顯增加，而假手術組無明顯變化（圖5）。

圖4　RT-PCR電泳結(jié)果

表2　三組移植4周后 Ang-1mRNA的相對表達水平

圖5　Ⅷ因子免疫組化染色結(jié)果（×200；A：移植組；B：對照組；C：假手術組）

3　討論

心臟干細胞移植治療已成為目前心肌梗死治療新的希望，但其相關機制尚不完全清楚。目前的研究結(jié)果認為可能有如下機制，①壞死心肌的修復和再生，2001年Orlic等［1］首次在Nature上報道了骨髓干細胞可以再生為心肌細胞；②再生血管改善灌注［8］；③血管活性物質(zhì)的效應［9］。本研究證實了臍血干細胞移植能促進血管新生，但是血管新生過程中干細胞移植起到何種作用尚不明確。

器官和組織的血管生成包括兩個過程：血管形成和血管新生。血管形成是成熟機體形成新生血管的唯一方式。研究表明血管生成素參與了血管生成過程，關于Ang-1的研究較多。Ang-1通過差異性剪接，可形成4種異構體，分子量分別為1.5 kD、1.3 kD、0.19 kD、017 kD。研究證明［10］1.3 kD和0.19 kD是Ang-1作用的負性調(diào)節(jié)因子，有下調(diào)Ang-1的作用。Ang-1含3個結(jié)構域［11］，其中第三結(jié)構域參與Ang-1和Tie2受體的結(jié)合［12］。Ang-1能與血管內(nèi)皮細胞上的Tie2受體結(jié)合，具有維護血管結(jié)構的穩(wěn)定和完整作用［13］。實驗表明Ang-1基因敲除鼠血管結(jié)構簡單、分支減少，由于心血管發(fā)育障礙，小鼠多死于胚胎發(fā)育早期。而轉(zhuǎn)基因過表達Ang-1的新生小鼠皮膚血管比正常粗大，毛細血管、小靜脈數(shù)量和分支增多，血管腔變大，內(nèi)皮細胞與鄰近的管周細胞、成纖維細胞間聯(lián)系完整［14］。

本研究中Ang-1在移植組明顯增加，可能與血管新生相關，提示hUCBSC移植能夠通過分泌Ang-1的增加促進心肌梗死后血管新生，從而改善心臟功能。經(jīng)靜脈移植人臍血干細胞能在心肌梗死大鼠梗死心肌部位存活，并表達心肌特異性收縮蛋白，像心肌細胞樣生存。

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本文編輯：姚雪莉

Effects of angiopoietin-1 on angiogenesis in umbilical cord blood stem cell transplantation in rats with myocardial infarction

ZHAO Rui-ping*， HAN Wei， LI Hong-yu， SUN Kai， HU Jiang.*Department of Cardiology， Central Hospital of Baotou City， Baotou 014040， China.

ZHAO Rui-ping， E-mail： 378839547@qq.com

Objective To discuss whether human umbilical cord blood stem cells （UCBSC） inducing angiogenesis through angiopoietin-1 （Ang-1） in rats with myocardial infarction after the transplantation of human UCBSC. Methods Male SD rats （n=40） were randomly divided into sham-operation group （n=9）， control group （n=11）and transplantation group （n=10）. The sham-operation group was only give treatment of chest-open without ligation of anterior descending coronary artery， control group was given intravenous injection of normal saline solution after the ligation for inducing myocardial infarction， and transplantation group was given intravenous injection of human UCBSC suspension after the ligation for inducing myocardial infarction. After 4 w， the rats were killed for collecting left ventricular tissues. The human-specific cardiac troponin T （cTnT）， human major histocompatibility complex （hMHC），VIII factor and Ang-1 were stained by using immunohistochemistry technique， and expression of Ang-1 mRNA was detected by using reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results There were positive cells of cTnT and hMHC with brown cytoplasma observed in transplantation group. Compared with sham-operation group，integral optical density （IOD） of Ang-1 increased significantly in control group and transplantation group （P＜0.05）. Compared with control group， IOD of Ang-1 increased significantly in transplantation group （P＜0.01）. Compared with sham-operation group， the expression of Ang-1 mRNA increased significantly in control group and transplantation group， and compared with control group， the expression of Ang-1 mRNA increased significantly in transplantation group （all P＜0.05）. VIII factor， as the index for detecting myocardial capillary density， increased significantly in transplantation group compared with control group， and had no significant changes in sham-operation group. Conclusion The intravenous transplanted human UCBSC can survive and express myocardial-specific contractile protein， and at the same time myocardial capillary density increases at cardiac infarction area in rats with myocardial infarction， and the mechanism maybe related to that the increase of Ang-1 expression can promote angiogenesis.

Stem cell； Angiopoietin-1； Angiopoietin-2； Myocardial infarction； Umbilical cord blood stem cells； Promoting angiogenesis

R541.4

A

1674-4055（2016）09-1046-04

內(nèi)蒙古自然科學基金項目（2013MS1172）

1014040 包頭，包頭市中心醫(yī)院心內(nèi)科；2014040 包頭，包頭市中心醫(yī)院影像科；3014040 包頭，包頭市中心醫(yī)院普外科

趙瑞平，E-mail：378839547@qq.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2016.09.07