多抗菌素發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究

吳剛 胡永紅 楊洋 顧鵬飛 楊文革 王春曉 丁志雯 曹崢

摘要： 通過測(cè)定菌絲體干重、多抗菌素含量和底物濃度，研究鏈霉菌NJYHWG66382發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程。結(jié)果表明，這3個(gè)動(dòng)力學(xué)模型能較好的解釋發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，選擇Logistic模型來描述鏈霉菌生長(zhǎng)曲線，利用Leudeking-Piret方程描述多抗菌素合成的動(dòng)力學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)該鏈霉菌生產(chǎn)多抗菌素的發(fā)酵類型屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型；最后使用Leudeking-Piret-Like方程描述底物消耗的動(dòng)力學(xué)規(guī)律。

關(guān)鍵詞： 多抗菌素； 發(fā)酵； 動(dòng)力學(xué)模型

中圖分類號(hào)：S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）05-1179-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.05.023

Study on Fermentation Kinetics of Polyoxins

WU Gang，HU Yong-hong，YANG Yang，GU Peng-fei，YANG Wen-ge，WANG Chun-xiao，DING Zhi-wen，CAO Zheng

（State Key Laboratory of Materials-Oriented Chemical Engineering，Nanjing Tech University，Nanjing 211816，China）

Abstract： Substrate concentration， dry cell weight and content of polyoxins were measured to establish fermentation kinetics equation of Streptomyces NJYHWG66382. It was proved that the three kinetics equations can explain the result well. Logistic model was used to describe the growth curve of streptomycete， Leudeking-Piret model was used to describe the produce of polyoxins， which showed that the process was partial coupling type growth. Then Leudeking-Piret-Like model was employed to describe the consumption of substrate. The parameters were calculated and the factors are obtained that affecting the yield of polyoxins， which could lay a theoretical foundation for expanded production of polyoxins.

Key words： polyoxins； fermentation； kinetic model

多抗菌素（Polyoxins）又被稱為多效霉素、多氧霉素、多抗霉素，為一系列結(jié)構(gòu)相似的肽嘧啶核苷類抗生素[1，2]。最早由日本科研制藥株式會(huì)社在1965年從可可鏈霉菌阿蘇變種發(fā)酵液中提取得到[3]。自1965年發(fā)現(xiàn)至今，多抗菌素廣泛應(yīng)用于防治番茄灰霉病、水稻紋枯病和梨黑斑病等植物真菌病害，對(duì)病原真菌表現(xiàn)出極強(qiáng)的抑制作用[4-8]。

發(fā)酵動(dòng)力學(xué)研究是為了解在發(fā)酵進(jìn)程中菌絲體的生長(zhǎng)、代謝產(chǎn)物生成和底物消耗的動(dòng)態(tài)平衡及內(nèi)在規(guī)律，為后續(xù)放大化提供理論基礎(chǔ)[9，10]。迄今為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)多抗菌素發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究尚未見報(bào)道，因此研究多抗菌素的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，將為多抗菌素后續(xù)規(guī)?；a(chǎn)及發(fā)酵過程的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)菌種是多抗菌素產(chǎn)生菌Streptomyces aureochromogenes NJYHWG66382，為課題組保存菌種。

培養(yǎng)基：①斜面培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200、蔗糖20、瓊脂15～20、pH 7。②平板培養(yǎng)基（g/L）：同斜面培養(yǎng)基。③種子培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖10、酵母膏10、KH2PO4 0.2、FeSO4 0.2、CaCO3 0.3、pH 6.0。④發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蔗糖20、酵母膏20、KH2PO4 0.2、FeSO4 0.2、CaCO3 0.3、pH 6.0。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng)方法[11，12] 250 mL錐形瓶中裝種子培養(yǎng)基50 mL，在搖瓶中接種菌株，培養(yǎng)溫度為28 ℃，搖床轉(zhuǎn)速180 r/min，培養(yǎng)48 h后接種至3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。

1.2.2 發(fā)酵罐培養(yǎng) 在3 L發(fā)酵罐中裝入1 L優(yōu)化后的培養(yǎng)基，經(jīng)121 ℃滅菌21 min，冷卻至室溫，接入5%種子液，溫度28 ℃，攪拌轉(zhuǎn)速180 r/min，通氣量3 L/min。

1.2.3 分析檢測(cè)方法

1）蒽酮-硫酸法測(cè)定發(fā)酵液中蔗糖含量[13，14]。

A.標(biāo)準(zhǔn)曲線。配制0.1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)液，蒽酮試劑。取6支比色管，加入標(biāo)準(zhǔn)蔗糖、去離子水和蒽酮試劑，搖勻，沸水浴10 min，取出，冷卻至室溫，在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A。以標(biāo)準(zhǔn)蔗糖用量為橫坐標(biāo)，吸光度（A）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

B.樣品測(cè)定。取1 mL發(fā)酵液，稀釋250倍，分別加入溶劑和樣品，搖勻，沸水浴10 min，取出，冷卻至室溫，在620 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度A（以去離子水作空白對(duì)照），從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出蔗糖含量。

2）管碟法檢測(cè)多抗菌素含量[15]。

A.標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品分別稀釋至200、800、 1 000、1 600、2 000、2 400 μg/mL不同濃度，使用管碟法（牛津杯法）測(cè)定不同濃度多抗菌素標(biāo)準(zhǔn)品的抑菌圈大小。以抑菌圈直徑（mm）為橫坐標(biāo)、多抗菌素濃度（μg/mL）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

B.樣品測(cè)定。使用管碟法測(cè)定樣品抑菌圈大小，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定多抗菌素含量。

3）測(cè)定菌絲體干重（DCW）。

取50 mL發(fā)酵液，4 ℃ 10 000 r/min，離心15 min，棄上清液，加入一定量去離子水洗滌2次，棄上清液，在80 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，減去離心管重量，即為菌絲體干重。

2 結(jié)果與分析

2.1 蔗糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，繪制圖形如圖1，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=7.957 14x-0.010 86。結(jié)果表明，線性相關(guān)系數(shù)R2=0.999 2，線性關(guān)系良好，用此法計(jì)算蔗糖濃度較為精準(zhǔn)。

2.2 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)模型

本試驗(yàn)采用2種常見的菌絲體生長(zhǎng)模型，即Logistic模型和Gompertz模型來模擬鏈霉菌菌絲體的生長(zhǎng)情況，尋找最合適的模型。

2.2.1 Logistic模型 在描述微生物發(fā)酵過程中菌絲體的生長(zhǎng)情況時(shí)，由比利時(shí)科學(xué)家Verhulst提出的Logistic方程[16，17]應(yīng)用較為廣泛，能夠直觀的顯示在發(fā)酵過程中菌絲體的生長(zhǎng)規(guī)律，Logistic方程為：

■=μm（1-■）X （1）

式中，X為菌絲體濃度（g/L）、Xm為最大菌絲體濃度（g/L）、t為發(fā)酵時(shí)間（d）。

發(fā)酵起始時(shí)間t=t0=0，X=X0，對(duì)（1）進(jìn)行積分：

μmt=ln（■-1）+ln（■） （2）

或X=■ （3）

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合（圖2），最終得出X0=0.688 7 g/L，Xm=2.903 0 g/L，μm=1.810 4 /d，R2=0.992 5，擬合較好。

2.2.2 Gompertz模型 Gompertz模型[18]用于描述微生物與時(shí)間變化之間的關(guān)系，其模型為：

■=r（ln■）X （4）

式中，X為菌絲體濃度（g/L）；Xm為最大菌絲體濃度（g/L）；r為比例系數(shù)。

對(duì)（4）式進(jìn)行積分得：

X=A×exp{-exp[■（？姿-t）+1]} （5）

式中，λ為延滯期時(shí)間，即切線在x軸截距；A為漸近線值，即相對(duì)最大菌濃度（g/L）；e為常數(shù)2.718 28。

根據(jù)最小二乘法原理進(jìn)行擬合，曲線見圖3，得到A=2.906 9 g/L，μm=1.731 4 /d，λ=-0.147 4 /d，相關(guān)系數(shù)R2=0.989 9，模型適用性較好。

本試驗(yàn)分別引用Logistic模型和Gompertz模型來對(duì)鏈霉菌生長(zhǎng)曲線進(jìn)行模擬和描述。擬合結(jié)果表明，Logstic模型在鏈霉菌生長(zhǎng)曲線的描述中擬合度最高。

2.3 多抗菌素合成動(dòng)力學(xué)模型

采用Luededing-Piret[19]方程來描述鏈霉菌產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)模型：

■=？茁X+？琢■ （6）

式中，P為多抗菌素含量μg/mL，β、α為動(dòng)力學(xué)相關(guān)系數(shù)。

發(fā)酵起始時(shí)間t=t0=0，P=P0，對(duì)（6）進(jìn)行積分：

P=？琢X0（■-1）+？茁■ln1-■（1-e■）（7）

將試驗(yàn)數(shù)據(jù)代入（7）式進(jìn)行擬合（圖4），得出α=78.188 1，β=174.768 1，R2=0.894 2，模型的適用性良好。

通過方程擬合，得出α≠0、β≠0，發(fā)現(xiàn)多抗菌素發(fā)酵屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型發(fā)酵，即菌體生長(zhǎng)與產(chǎn)物合成相偶聯(lián)，在發(fā)酵的對(duì)數(shù)期與穩(wěn)定期都會(huì)有產(chǎn)物合成。

α為菌絲體生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)，因此αμX為菌絲體生長(zhǎng)對(duì)產(chǎn)物的貢獻(xiàn)項(xiàng)；β為非菌絲體生長(zhǎng)相關(guān)系數(shù)，則βX為非菌絲體生長(zhǎng)相關(guān)項(xiàng)。圖5表示隨著時(shí)間的變化，菌絲體生長(zhǎng)與非菌絲體生長(zhǎng)項(xiàng)的變化規(guī)律。αμX項(xiàng)值從起始發(fā)酵到發(fā)酵終點(diǎn)均小于βX項(xiàng)。由此可知，菌絲體生長(zhǎng)對(duì)多抗菌素的合成影響遠(yuǎn)沒有非菌絲體生長(zhǎng)因素（外界因素）對(duì)產(chǎn)量的貢獻(xiàn)大。

2.4 底物消耗動(dòng)力學(xué)模型

在多抗菌素發(fā)酵的過程中，底物的消耗一般用于維持微生物菌絲體正常生命代謝、微生物細(xì)胞的生長(zhǎng)和各種代謝產(chǎn)物的合成。根據(jù)物料平衡守則，其動(dòng)力學(xué)模型可用類似Luededing-Piret-Like方程表示：

-■=■■+■■+msX （8）

式中，S為底物濃度g/d；Yx/s為菌絲體生長(zhǎng)的得率系數(shù)，g細(xì)胞/g底物；Yp/s為底物用于產(chǎn)物積累的得率系數(shù)，g產(chǎn)物/g底物；m為維持菌絲體代謝系數(shù)，g底物//g細(xì)胞·d）。

發(fā)酵初始條件下，t=0，X=X0、P=P0=0、S=S0，將式3和式7代入（8）式，積分得

S=S0-（■+■）×（■-X0）-（m+ ■）×■×ln■ （9）

將試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)帶入（9）式，進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合（圖6），得到Y(jié)x/s =1.275 7×1025，Yp/s =1.567×105，m=0.888 0，R2=0.991 23，模型的適用性良好。

2.5 模型驗(yàn)證

對(duì)試驗(yàn)參數(shù)進(jìn)行歸納見表1。在相同的發(fā)酵環(huán)境下重復(fù)進(jìn)行3次試驗(yàn)，測(cè)定菌絲體干重、多抗菌素生成量、蔗糖消耗量。對(duì)發(fā)酵的試驗(yàn)測(cè)定值，利用（3）式、（7）式、（9）式作圖（圖7）。

2.6 模型總結(jié)

1）使用蒽酮-硫酸比色法建立蔗糖濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此來對(duì)發(fā)酵過程中蔗糖濃度的變化進(jìn)行實(shí)時(shí)測(cè)定。

2）本試驗(yàn)將Logistic模型和Gompertz模型用于描述菌絲體生長(zhǎng)曲線，從中選擇Logistic模型用于菌絲體生長(zhǎng)的研究。利用Leudeking-Piret模型描述多抗菌素合成的動(dòng)力學(xué)過程，發(fā)現(xiàn)該鏈霉菌生產(chǎn)多抗菌素的發(fā)酵類型屬于部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型，最后使用Leudeking-Piret-Like方程描述底物消耗的動(dòng)力學(xué)規(guī)律，結(jié)果表明這3個(gè)動(dòng)力學(xué)模型均能較好的解釋發(fā)酵試驗(yàn)結(jié)果，并對(duì)動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)進(jìn)行了計(jì)算，為多抗菌素的放大化生產(chǎn)奠定相關(guān)理論基礎(chǔ)。模型方程為：

■-1.810 4X（1-■）■=78.188 1■+174.768 1X-■=■■=■■+0.888X

3 小結(jié)與討論

由建立的動(dòng)力學(xué)模型可知，在第3天左右菌體的生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期；由產(chǎn)物生成模型可知，菌絲體生長(zhǎng)對(duì)多抗菌素貢獻(xiàn)小，而非菌絲體生長(zhǎng)因素（外界因素）對(duì)多抗菌素貢獻(xiàn)顯著；由底物消耗模型可知，底物用于菌絲體生長(zhǎng)的系數(shù)Yx/s遠(yuǎn)大于底物用于產(chǎn)物生成的系數(shù)Yp/s，由此可知有大部分底物浪費(fèi)在菌絲體生長(zhǎng)上，而只有小部分底物參與產(chǎn)物合成。因此，為了降低流向菌絲體生長(zhǎng)的能量，通過對(duì)發(fā)酵過程進(jìn)行分階段培養(yǎng)，以提高用于產(chǎn)物生成的能量比率。

溫度對(duì)菌絲體生長(zhǎng)有較大影響，溫度過高抑制菌絲體生長(zhǎng)，溫度低，菌絲體生長(zhǎng)緩慢。此外，溫度還會(huì)對(duì)鏈霉菌發(fā)酵生產(chǎn)多抗菌素造成影響。對(duì)于同一種微生物，菌絲體生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成所需的最適溫度不一定相同，而由動(dòng)力學(xué)模型分析可知，菌絲體的生長(zhǎng)對(duì)產(chǎn)量貢獻(xiàn)小，還會(huì)消耗用于產(chǎn)物合成部分的底物，因此，可在菌絲體生長(zhǎng)達(dá)到一定濃度時(shí)，通過降低溫度來減慢菌絲體的生長(zhǎng)，從而為產(chǎn)物的生成節(jié)約能源。在多抗菌素的合成過程中，鏈霉菌絲體內(nèi)各種酶相互協(xié)同參加反應(yīng)，溫度對(duì)酶的活性產(chǎn)生影響，采用多階段控制體系的溫度，可提高多抗菌素的產(chǎn)量。

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