反相高效液相色譜法測定婦炎舒膠囊中丹酚酸B的含量

陳英紅 周婷婷 王穎

[摘要] 目的 本實驗建立婦炎舒膠囊中丹酚酸B的含量測定方法。 方法 采用反相高效液相色譜法，選擇迪馬C18 色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），以乙腈（A）-0.02%甲酸（B）為流動相進行梯度洗脫：0～15 min，39%～39%A；15～20 min，39%～100%A；20～35 min，100%～39%A；檢測波長為286 nm。 結(jié)果 丹酚酸B進樣量在0.2～1.2 μg范圍內(nèi)，進樣量與峰面積呈良好的線性關系，r = 0.9999，平均回收率96.21%，RSD為2.13%（n = 6）。平均含量應為（1.559±0.249）mg/g。 結(jié)論 該測定方法靈敏度高、分離效果好，可以作為婦炎舒膠囊的質(zhì)量控制方法。

[關鍵詞] 婦炎舒膠囊；反相高效液相色譜法；丹酚酸B

[中圖分類號] R927.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0150-03

Determination of Fuyanshu Capsules by RP-HPLC method

CHEN Yinghong ZHOU Tingting WANG Ying

Institute of Chinese Material Medical， Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine and Material Medical Sciences， Jilin Province， Changchun 130012， China

[Abstract] Objective To establish a method of the determination of Salvianolic acid B in Fuyanshu Capsules. Methods The HPLC-wavelength detection was employed using a column of Dikma Diamonsil C18 analytical column （5 μm，4.6 mm×250 mm） with a mobile phase of acetonitrile （A）-0.02% formic acid （B）. The gradient elution program was as follows： 0-15 min， 39%-39%A； 15-20 min， 39%-100%A； 20-35 min， 100% -39%A. The detection wavelength was set at 286 nm. Results The linear relationship was good within the concentration range of 0.2-1.2 μg （r = 0.9999）. The average recovery was 96.21% （RSD = 2.13%）. The average content was （1.559±0.249）mg/g. Conclusion The method was of high efficiency and sensitivity， which can be used effectively for the quality control of Fuyanshu Capsules.

[Key words] Fuyanshu Capsules； Reversed phase high-performance liquidchromatography； Salvianolic acid B

婦炎舒膠囊（批準文號：z20130272）為吉林省中醫(yī)藥科學院的院內(nèi)制劑，具有清熱利膽、化瘀止痛的功效。臨床用于治療盆腔炎、附件炎效果顯著，深受廣大患者歡迎。處方由黃芪、當歸、丹參、黨參、延胡索、三棱、莪術、沒藥、野菊花、土鱉蟲、連翹、大貝12味藥組成，丹參為方中主藥，具有活血祛瘀、通經(jīng)止痛的功效[1]，丹參的化學成分分為水溶性和脂溶性兩大類，水溶性成分主要為酚酸類成分[2-9]。在已發(fā)表文獻中未見有關婦炎舒膠囊的含量測定報道。本實驗選取丹參中主要有效成分丹酚酸B為婦炎舒膠囊的指標成分，建立了丹酚酸B含量測定方法，用于控制該制劑的質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

LC-2010C液相色譜儀（日本島津分析儀器有限公司）；CLASS-VP工作站（日本島津分析儀器有限公司）；AB204-N分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-50B 超聲波清洗機（功率50 W，頻率40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與試藥

丹酚酸B對照品（批號：111562-200605）購于中國藥品生物制品檢定所。婦炎舒膠囊由吉林省中醫(yī)藥科學院制劑室制備（批號：20131204、20131205、20131206）。D101型大孔吸附樹脂（天津浩聚樹脂科技有限公司），水為超純水，甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

取丹酚酸B對照品10 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得（每毫升含丹酚酸B 0.1 mg）。

2.2 供試品溶液的制備

取樣品1 g，加入50 mL 70%乙醇溶解，超聲30 min，濾過，濾液濃縮至5 mL加至已經(jīng)處理好的D101型大孔吸附樹脂柱（1.5 cm×12 cm），先以100 mL水洗，棄去水洗液，繼以70%乙醇50 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并定容至10 mL[10-13]。

2.3 陰性對照樣品溶液的制備

按照處方比例制備除丹參的陰性樣品，再按照“2.2”項下的方法制備陰性對照樣品溶液。

2.4 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈（A）-0.02%甲酸（B）為流動相進行梯度洗脫：0～15 min，39%～39%A；15～20 min， 39%～100%A；20～35 min，100%～39%A，檢測波長為286 nm，柱溫35℃，流速0.9 mL/min，進樣量10 μL。理論塔板數(shù)按丹酚酸B計算應不低于4500。結(jié)果見圖1～3。

2.5 方法學考察

2.5.1 線性關系考察 精密吸取丹酚酸B對照品溶液1、2、3、4、5、6 mL，加甲醇稀釋定容至10 mL容量瓶中。分別精密吸取上述溶液各20 μL注入液相色譜儀測定，以進樣量（μg）對峰面積繪制標準曲線。丹酚酸B回歸方程為Y=1 101 220.247X-658.785（r = 0.9999）。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，丹酚酸B進樣量在0.2～1.2 μg范圍內(nèi)，峰面積與進樣量呈良好的線性關系，符合外標法定量測定的要求。

2.5.2 精密度試驗 精密吸取同一供試品溶液10 μL，照上述色譜條件連續(xù)重復進樣6次，測定平均峰面積為1 157 819，RSD值為1.33%，說明儀器整個系統(tǒng)精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液10 μL。照上述色譜條件分別于0、4、8、12、16、20 h進樣，測定平均峰面積為1 130 727，RSD值為1.48%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4 重復性試驗 精密稱取同一批號樣品內(nèi)容物6份，按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，再按“2.4”項下色譜條件進樣分析，樣品測定丹酚酸B含量為1.385 mg/g，RSD = 1.10%，表明本研究制訂的方法重復性良好。

2.5.5 回收率試驗 精密稱取同一批號的已知含量的樣品（丹酚酸B的含量為1.385 mg/g）6份，分別加入對照品溶液2 mL（濃度0.35 mg/mL），按照供試品溶液制備方法制備供試品溶液，再按“2.4”項下色譜條件進樣分析，計算回收率，結(jié)果見表1。平均回收率為96.21%，RSD = 2.13 %。表明該方法回收率較高、準確度高。

表1 回收率試驗測定結(jié)果

2.6 3批樣品含量測定

采用正文方法處理樣品，進行含量測定，3批樣品含量測定結(jié)果分別為1.801、1.524、1.351 mg/g。測定結(jié)果表明，婦炎舒膠囊中丹酚酸B含量基本穩(wěn)定。 3 討論

3.1 不同流動相考察

參考文獻[14-22]，實驗對4種流動相系統(tǒng)①甲醇-乙腈-甲酸-水（30∶10∶1∶59），②乙腈∶0.1%磷酸（21∶17），③甲醇-甲酸-水（40∶1∶59），④乙腈-0.02%甲酸（39∶61）的分離效果進行了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在流動相中加入少量酸可以改善峰形及分離度，分析結(jié)果顯示乙腈-0.02%甲酸（39∶61）分離效果較好，保留時間適中，分離度符合要求。但在實驗中發(fā)現(xiàn)連續(xù)多次進樣后， 樣品重現(xiàn)性不好，分析原因可能是供試品藥味較多，成分復雜，直接采用乙腈-0.02%甲酸（39∶61）等度洗脫，有很多成分吸附在色譜柱上洗脫不下來，為了延長色譜柱的使用壽命，同時保證樣品的重現(xiàn)性和分離效果，在指標成分丹酚酸B出峰后，采用梯度洗脫，在運行時間0-15-20-35 min，乙腈比例由39%-39%-100%-39%，對色譜柱進行清洗。

3.2 提取方法考察

根據(jù)丹酚酸B的性質(zhì)，本試驗選用不同濃度的乙醇、甲醇作溶劑對本品進行前處理，試驗結(jié)果表明采用70% 的乙醇作溶劑，超聲30 min能完全提取待測成分，但雜質(zhì)峰有干擾，分離效果達不到要求，于是將提取液通過D101型大孔吸附樹脂柱作純化處理， 分析結(jié)果顯示，該處理方法分離度高，平均回收率及重現(xiàn)性均較好。

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（收稿日期：2015-10-11 本文編輯：趙魯楓）