低強(qiáng)度壓力感受器刺激治療心房顫動的實(shí)驗(yàn)研究

屈園園 江洪

[摘要] 目的 探討低強(qiáng)度頸動脈竇壓力感受器電刺激（LL-CBS）對9小時快速心房起搏（9hRAP）所致的心房顫動（AF）的影響。 方法 14只比格犬（7～9 kg）麻醉后分為對照組（6只）和LL-CBS組（8只）。將多電極導(dǎo)管縫合于心房和肺靜脈。所有動物均接受9hRAP，LL-CBS組的動物在行9hRAP同時給予持續(xù)的LL-CBS，將80%閾電壓的電刺激定義為LL-CBS。9hRAP后測所有位點(diǎn)的有效不應(yīng)期（ERP）、ERP離散度及AF誘發(fā)窗口（WOV）。實(shí)驗(yàn)?zāi)┝羧⌒姆拷M織采用RT-PCR分析縫隙連接蛋白43（Cx43）的表達(dá)情況。 結(jié)果 與對照組比較，LL-CBS組所有位點(diǎn)的ERP延長，Cx43的DNA含量增加，ERP離散度和AF誘導(dǎo)性降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 LL-CBS可抑制AF發(fā)生，這種保護(hù)機(jī)制與調(diào)控心房Cx43的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 低強(qiáng)度壓力感受器刺激；心房顫動；縫隙連接蛋白43

[中圖分類號] R541.7+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）02（c）-0026-04

Experiment study of treatment on atrial fibrillation with low-level carotid baroreceptor stimulation

QU Yuanyuan JIANG Hong▲

Department of Cardiology， Renmin Hospital of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To test the hypotheses that low-level carotid baroreceptor stimulation （LL-CBS） protects against atrial fibrillation （AF） induced by 9 hours rapid atrial pacing （9hRAP）. Methods Fourteen anesthetized beagles （7-9 kg） were divided into two groups： control group（6 cases） and LL-CBS group （8 cases）. Multi-electrode catheters were attached to the atria and pulmonary vein. All animals received 9hRAP， and animals in LL-CBS group received continuous LL-CBS at the same time， a voltage of stimulation setting at 80% below the threshold was defined as LL-CBS. The atrial effective refractory period （ERP）， ERP dispersion and the window of vulnerability （WOV） for AF were measured at all recording sites after 9hRAP. DNA of Atrial tissue was reserved at the end of the protocol and expression of Cx43 was determined by real time polymerase chain reaction （RT-PCR）. Results Compared with control group， in LL-CBS group， ERP in all sites lengthened， DNA of Cx43 increased， ERP dispersion and AF inducibility decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion LL-CBS can suppress AF， the protective effects of LL-CBS may be due to its regulation of atrial Cx43 expression.

[Key words] Low-level carotid baroreceptor stimulation； Atrial fibrillation； Connexin 43

心房顫動（AF）是最常見的快速性心律失常[1]。AF的發(fā)病率和死亡率日漸升高，成為當(dāng)今社會一項嚴(yán)重危害健康的疾病[2]。自主神經(jīng)在AF的發(fā)生和維持中發(fā)揮重要作用[3]。調(diào)節(jié)自主神經(jīng)功能可能有助于控制AF的發(fā)生[4]。目前普遍認(rèn)為降低交感活性，增加迷走張力，有抗房性心律失常作用[5]。

低強(qiáng)度電刺激頸動脈竇壓力感受器（LL-CBS）可以提高AF的誘發(fā)閾值[6]。心房細(xì)胞膜上的縫隙連接主要由連接蛋白（Cx）構(gòu)成，其中以Cx43為主。該蛋白表達(dá)或分布異常在AF發(fā)生中發(fā)揮重要作用。多項研究發(fā)現(xiàn)，AF動物和AF患者心房Cx43表達(dá)下降[7]。本研究將采用經(jīng)典的AF模型來探索LL-CBS對AF的調(diào)控是否與Cx43相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 動物準(zhǔn)備

所有實(shí)驗(yàn)動物均由武漢大學(xué)人民醫(yī)院動物中心提供。14只健康成年比格犬（體重7～9 kg，合格證號：No.4200020000021），戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉。氣管插管接呼吸機(jī)（MAO01746，Harvard，美國），室內(nèi)空氣持續(xù)正壓通氣，設(shè)定潮氣量500 mL/min，呼吸頻率20次/min。分離一側(cè)股動靜脈，并建立動靜脈通道，股動脈連接壓力換能器監(jiān)測血壓。實(shí)驗(yàn)過程中，靜脈輸生理鹽水（50～100 mL/h）以補(bǔ)充手術(shù)創(chuàng)口及鞘管流失的液體。每小時股靜脈追加戊巴比妥鈉2 mg/kg。為維持正常體溫，于犬下方放置一電熱板，維持體內(nèi)溫度在（37.0±0.5）℃。皮下針刺電極持續(xù)監(jiān)測體表心電圖、心率。經(jīng)第四肋間隙行雙側(cè)開胸術(shù)，剪開心包，將多電極導(dǎo)管縫于左右心房及肺靜脈處，包括左心房（LA），左心耳（LAA），左上肺靜脈（LSPV），左下肺靜脈（LIPV），右心房（RA），右心耳（RAA），右上肺靜脈（RSPV），右下肺靜脈（RIPV）。電極另一端連接神經(jīng)活性記錄儀。所有電生理信號與血壓信號均接入多導(dǎo)聯(lián)生理記錄儀（2000B，四川錦江）。

1.2 LL-CBS和實(shí)驗(yàn)分組

頸右側(cè)作縱向切口，暴露頸總動脈和頸內(nèi)動脈的分叉處并與周圍組織分離。將一枚特制的Ag-AgCl刺激電極纏繞于頸動脈竇外壁，電極另一端連與脈沖發(fā)生裝置（SEN-7013，Nihon Kohden，東京，日本）。進(jìn)行3～4次電刺激，每次持續(xù)3～5 min，若每次電刺激均能引起血壓和心率明顯降低，證實(shí)電極纏繞在正確部位。停止電刺激15 min后，血壓和心率通?？苫謴?fù)至刺激前水平，則進(jìn)行下一次刺激。將能使血壓降低10%的電壓視為閾值。選擇80%的閾電壓進(jìn)行LL-CBS，每隔30 min進(jìn)行閾電壓校正。脈沖轉(zhuǎn)換器按以下參數(shù)設(shè)定：2.4～4.8 V，50 Hz，0.5 ms脈寬。

14只犬分為對照組（n=6）和LL-CBS組（n=8）。對照組行9小時快速心房起搏（9hRAP），LL-CBS組在快速起搏同時進(jìn)行CBS。

1.3建造AF模型

行9hRAP：按照Yu等[8]的實(shí)驗(yàn)方法，左側(cè)第四肋間隙開胸暴露心臟后，將一刺激電極縫于左心耳處，刺激電極尾線連接Grass刺激儀（Grass-S88，Astro-Med，West Warwich RI），測定起搏閾值，以2倍起搏閾值的強(qiáng)度進(jìn)行快速心房起搏，起搏的頻率為20 Hz（1200 次/min），脈寬為0.1 ms，時間為9 h。在每小時末，重新測定起搏閾值以保證始終以2倍起搏閾值的強(qiáng)度起搏。

1.4 檢測電生理指標(biāo)

對縫制的8個位點(diǎn)分別進(jìn)行測量。采用S1S2法測定有效不應(yīng)期（ERP），先給予8個周期恒定的基數(shù)刺激（S1-S1 = 330 ms）后，給予一個期前刺激S2，S1-S2間期由150 ms開始，每次縮短10 ms，若遇到不應(yīng)期，每減少1 ms。刺激電壓選用10倍刺激閾值。記錄到所有位點(diǎn)的變異系數(shù)即為ERP離散度，即標(biāo)準(zhǔn)差與均數(shù)之商。將誘發(fā)窗口（WOV）用于定量測量AF的誘發(fā)性。測量ERP時，在數(shù)次誘發(fā)出的AF中，最長和最短的S1-S2間期即為WOV。ΣWOV是所有位點(diǎn)WOV之和。ΣWOV越大，AF越容易誘發(fā)。分別在刺激前及9hRAP后測得上述各指標(biāo)。

1.5 Cx43定量分析

從左右心房多位點(diǎn)獲取心房組織，提取細(xì)胞RNA并用DNA酶處理，用凝膠電泳對樣品進(jìn)行定性和定量分析[9]。Cx43 RNA雙向引物由上海泛亞生物技術(shù)公司提供。Cx43上游引物：5'-AGA AAG AGG AGG AGC TCA AAG TTG-3，下游引物：5'-TTC AAT CTG CTT CAA GTG CAT GT-3'。用實(shí)時定量PCR檢測系統(tǒng)（Biosystems）檢測熒光信號。該實(shí)驗(yàn)采用優(yōu)化的PCR方案：PCR初期將混合物置于95℃溫浴2 min，使之變性，隨后進(jìn)行40次PCR循環(huán)，95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s。按2-ΔΔCT計算mRNA的相對表達(dá)量[10]，將甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 18.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 右側(cè)LL-CBS對ERP的影響

在基礎(chǔ)狀態(tài)，兩組各部位ERP差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）（表1）。實(shí)驗(yàn)9 h后，LL-CBS組動物心房8個位點(diǎn)ERP值與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）（表2）。

2.2 右側(cè)LL-CBS對ERP離散度的影響

在基礎(chǔ)狀態(tài)，兩組ERP離散度[（0.04±0.02）比（0.05±0.03）ms]，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。對LL-CBS組動物進(jìn)行起搏及電刺激后，9 h末ERP離散度為（0.06±0.03）ms，對照組在進(jìn)行9hRAP后，ERP離散度為（0.16±0.05）ms，對照組顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。見圖1。

與對照組比較，*P < 0.05；LL-CBS：低強(qiáng)度電刺激頸動脈竇壓力感受器

圖1 9小時快速心房起搏后兩組有效不應(yīng)期離散度

2.3 右側(cè)LL-CBS對ΣWOV的影響

在基礎(chǔ)狀態(tài)，兩組ΣWOV間[（25±6）比（22±8）ms]差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。對照組行9hRAP后，ΣWOV為（163±40）ms，對LL-CBS組動物進(jìn)行起搏及電刺激后，9 h末ΣWOV為（42±5）ms，LL-CBS組顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05），AF誘導(dǎo)性降低。見圖2。

與對照組比較，*P < 0.05；LL-CBS：低強(qiáng)度電刺激頸動脈竇壓力感受器；WOV：誘發(fā)窗口

圖2 9小時快速心房起搏后兩組ΣWOV

2.4 右側(cè)LL-CBS對Cx4基因表達(dá)的影響

與對照組比較，LL-CBS組Cx43相對mRNA水平顯著增高（0.13±0.05比0.25±0.04），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P < 0.05）。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)主要提出，LL-CBS阻止心房細(xì)胞Cx43丟失，從而降低AF誘導(dǎo)性。右側(cè)LL-CBS延長心房ERP，降低AF誘導(dǎo)性，同時維持Cx43在正常表達(dá)水平，穩(wěn)定了心房電生理活動。

壓力感受器位于心臟和各大血管中，可以同時調(diào)節(jié)交感張力和迷走張力[11]。頸動脈壓力反射主要產(chǎn)自于頸動脈竇中的壓力感受器，該感受器可探測局部血壓[12]。頸動脈壓力反射通過調(diào)節(jié)交感張力，在調(diào)控血壓中發(fā)揮重要作用。在針對難治性高血壓患者亞組的研究中發(fā)現(xiàn)，頸動脈竇壓力感受器刺激（CBS）使交感活動受到抑制，并能增加迷走神經(jīng)活性，從而抑制全身交感神經(jīng)[13]。CBS已被用于治療難治性高血壓和慢性心衰[14-15]，其機(jī)制可能是調(diào)控自主神經(jīng)活動。而自主神經(jīng)功能失調(diào)是AF發(fā)生的潛在機(jī)制，因此筆者推測，CBS可能具有抗AF的作用。本實(shí)驗(yàn)設(shè)定使血壓降低10%的刺激為閾刺激，80%的閾刺激即為LL-CBS。而在本研究中發(fā)現(xiàn)，LL-CBS可以在RAP的AF模型中抑制心房電重構(gòu)和AF的發(fā)生，從而證實(shí)了這一推測。CBS將信號傳至背部脊髓，在腹外側(cè)脊髓發(fā)生信號的轉(zhuǎn)換和處理，并傳出至心臟[13]。高強(qiáng)度的CBS顯著增加AF誘導(dǎo)性[16]，而低強(qiáng)度的CBS可抑制AF的誘發(fā)[12]。

心房縫隙連接蛋白主要為Cx43。Cx43的表達(dá)和分布發(fā)生改變可嚴(yán)重影響電偶聯(lián)和電刺激的傳播。電傳導(dǎo)紊亂使得AF易于發(fā)生。連接蛋白表達(dá)降低，心房電傳遞速度減慢，促進(jìn)微小電折返的發(fā)生，這是持續(xù)性AF發(fā)生的關(guān)鍵因素[17]。已有學(xué)者進(jìn)行相關(guān)基因研究，連接蛋白基因突變或基因刪除，連接蛋白表達(dá)低于正常水平，心房肌傳導(dǎo)速度減慢，AF易誘發(fā)[18]。另有實(shí)驗(yàn)，在AF實(shí)驗(yàn)動物上進(jìn)行Cx43基因轉(zhuǎn)移，該措施顯著加快心房傳遞速度，有效終止了AF發(fā)作[19]。本研究中，LL-CBS可抑制急性犬實(shí)驗(yàn)中RAP誘導(dǎo)的AF，延長心房ERP并保護(hù)心房細(xì)胞Cx43。LL-CBS抑制Cx丟失可能與多種機(jī)制相關(guān)：首先，Cx43是一種短壽蛋白，在心臟中其半衰期僅數(shù)小時[20]，LL-CBS可能抑制Cx降解從而延長其半衰期。其次，已有研究報道，NO經(jīng)cGNP抑制PDE3活性，抑制Cx基因的表達(dá)[21]。LL-CBS可能通過激活NO合成酶，增加NO釋放，使得Cx表達(dá)上調(diào)。第三，只有磷酸化的Cx才具有活性[22]，LL-CBS能激活蛋白激酶引起Cx發(fā)生磷酸化。

本研究LL-CBS組中，LL-CBS能顯著抑制9hRAP引起的ERP縮短、ERP離散度延長和ΣWOV增加，證實(shí)LL-CBS能有效抑制心房急性電重構(gòu)，與Liao等[6]的研究一致。但本實(shí)驗(yàn)只研究了LL-CBS的短期效應(yīng)（9 h），其長期效應(yīng)有待建立慢性AF模型進(jìn)一步研究。已有研究表明，LL-CBS通過抑制心臟神經(jīng)節(jié)叢（GP）活性，降低AF誘導(dǎo)性[6]。本實(shí)驗(yàn)中，LL-CBS抑制心房細(xì)胞膜Cx43丟失與GP活性降低關(guān)系如何，低強(qiáng)度電刺激左側(cè)頸動脈壓力感受器是否產(chǎn)生同樣功效，還有待深入研究。

刺激自主神經(jīng)系統(tǒng)可引起心房電生理發(fā)生顯著變化，并能誘發(fā)AF，本研究認(rèn)為神經(jīng)調(diào)節(jié)是控制AF的一項有效手段，且部分神經(jīng)干預(yù)措施已用于臨床使用[3]。LL-CBS可抑制AF發(fā)生，對血壓無明顯影響。對于CBS與AF關(guān)系的深入研究，有助于CBS在臨床運(yùn)用中的推廣。

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（收稿日期：2015-10-30 本文編輯：蘇 暢）