TTA1—Tat—PEG—GS NPs結(jié)合siRNA—EGFR轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞抑制EGFR基因表達(dá)的研究

胡洋 張龍 李旺 魏峰 豐偉 田新華

[摘要] 目的 探討TTA1、Tat、聚乙二醇（PEG）修飾的明膠硅氧烷納米粒子（GS NPs）結(jié)合siRNA-EGFR轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞，抑制其表皮生長因子受體（EGFR）表達(dá)的影響。 方法 根據(jù)鼠EGFR的mRNA序列設(shè)計(jì)合成siRNA-EGFR以及陰性對(duì)照siRNA-Scr（無意義序列）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs通過靜電作用結(jié)合siRNA。實(shí)驗(yàn)分4組：Control組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組及X-tremeGene/siRNA-EGFR組。除Control組外，其余三組均在體外對(duì)C6細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。Real-time PCR、Western blot分別檢測細(xì)胞EGFR mRNA及蛋白表達(dá)情況；CCK-8法、流式細(xì)胞儀分別檢測細(xì)胞增殖和凋亡情況。 結(jié)果 與Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組比較，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組在體外細(xì)胞水平上能有效抑制C6細(xì)胞EGFR mRNA及蛋白的表達(dá)（P < 0.01），同時(shí)抑制C6細(xì)胞的增殖（P < 0.05或P < 0.01）并促進(jìn)其凋亡（P < 0.01）。此外，X-tremeGene/siRNA-EGFR組和TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組在下調(diào)C6細(xì)胞EGFR水平、抑制細(xì)胞增殖及促進(jìn)細(xì)胞凋亡方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 TTA1-Tat-PEG-GS NPs可能成為一種新型的基因治療載體，為膠質(zhì)瘤基因治療的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 膠質(zhì)瘤；納米粒子；基因載體；RNA干擾

[中圖分類號(hào)] R739.41 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2016）02（c）-0004-05

Research of TTA1-Tat-PEG-GS NPs combined with siRNA-EGFR in transfection of C6 cells and inhibiting its EGFR gene expression

HU Yang1 ZHANG Long1 LI Wang1 WEI Feng2 FENG Wei2 TIAN Xinhua2

1.Medical College， Xiamen University， Fujian Province， Xiamen 361004， China； 2.Department of Neurosurgery， Zhongshan Hospital Affiliated to Xiamen University， Fujian Province， Xiamen 361004， China

[Abstract] Objective To investigate the property of TTA1-Tat-PEG modified gelatin-siloxane nanoparticles （GS NPs） combined with siRNA-EGFR in transfection of C6 cells and inhibiting its EGFR gene expression. Methods The siRNA-EGFR and negative control sequences （siRNA-Scr） were designed and synthesized according to the EGFR mRNA sequence of rats. TTA1-Tat-PEG-GS NPs bound to siRNA via electrostatic interaction. The composites of experiment included control group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group and X-tremeGene/siRNA-EGFR group. C6 cells were transfected in all groups except for those in the control group. Real-time PCR and Western blot were used to detect EGFR mRNA and protein levels， respectively. The proliferation and apoptosis were detected with CCK-8 and flowcytometry， respectively. Results Compared with control group and TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr group， TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group could inhibit the expression of EGFR mRNA and protein of C6 cells （P < 0.01）， restrain the proliferation of C6 cells （P < 0.05 or P < 0.01） and promote its apoptosis （P < 0.01）. In addition， there were no statistically significant differences between X-tremeGene/siRNA-EGFR group and TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR group in decreasing the EGFR levels of C6 cells， inhibiting the cell proliferation and promoting the cell apoptosis （P > 0.05）. Conclusion TTA1-Tat-PEG-GS NPs may be a novel gene carrier and provide theoretical foundation for the further research of glioma gene therapy.

[Key words] Glioma； Nanoparticles； Genetic vector； RNA interference

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腦腫瘤之一，整體的預(yù)后及治療效果不理想[1-2]，尋找有效的治療方法成為當(dāng)務(wù)之急。近年來，基因治療膠質(zhì)瘤研究成為一大熱點(diǎn)[3]，RNA干擾（RNAi）就是基因治療中極具前景的手段之一[4]。表皮生長因子受體（EGFR）在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及抑制凋亡等方面均發(fā)揮重要作用[5]。Wang等[6]認(rèn)為，EGFR在惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞中常出現(xiàn)擴(kuò)增、突變以及過表達(dá)。應(yīng)用RNAi降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞EGFR的表達(dá)，有望成為一個(gè)重要的治療途徑[7]?；蛑委煹年P(guān)鍵因素之一是基因載體，目前主要使用的載體為病毒載體[8]，但由于其安全性差、靶向能力差等原因限制了其應(yīng)用[9]，因此非病毒基因載體成為一條新的研究途徑[10]，然而能具備跨血腦屏障及高效基因轉(zhuǎn)染能力的非病毒基因載體仍不多見[11-12]。GSNPs是一種新穎的納米復(fù)合物，以GSNPs為載體骨架，修飾上可延長循環(huán)時(shí)間的聚乙二醇（PEG），并通過ERP效應(yīng)（選擇性高通透性和滯留性）在腫瘤組織中蓄積[13-14]；在修飾上具有高特異性靶向膠質(zhì)瘤細(xì)胞的適配體TTA1[15]和具有強(qiáng)效穿膜能力的Tat[16]，設(shè)計(jì)成新型的TTA1-Tat-PEG-GS NPs基因載體。本研究以高表達(dá)EGFR的C6細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以TTA1-Tat-PEG-GS NPs為載體結(jié)合siRNA，在體外轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞干擾EGFR基因表達(dá)，從而證明TTA1-Tat-PEG-GS NPs可作為一種新型的基因載體，為膠質(zhì)瘤基因治療的進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

C6細(xì)胞購于上海美軒公司；明膠購于美國BBI公司；PEG購于美國DOW公司；適配體TTA1（CCTGCACTTGGCTTGGATTTCAGAAGGGAGACCC）、Tat（KYGRRRQRRKKRGC）多肽購于上海生工公司。X-tremeGene轉(zhuǎn)染試劑購于北京索萊寶公司；Trizol購于美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及Real-time PCR試劑盒購于日本Takara公司；抗體購于美國Abcam公司；CCK-8試劑盒購于天津百螢生物公司；ANNEXINV/PI試劑盒購于北京拜爾迪生物公司。

1.2 方法

1.2.1 siRNA的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Genbank提供的鼠EGFR mRNA序列（NM_031507.1），設(shè)計(jì)靶向EGFR mRNA的序列為5'-GGAATTATGACCTTTCCTT-3'，陰性對(duì)照序列（Scramble）為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'，委托上海吉瑪公司合成相應(yīng)siRNA。

1.2.2 TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA的結(jié)合及結(jié)合比例選擇 參考Wang等[17]及張龍等[18]方法合成GS NPs，依次修飾上PEG、TTA1、Tat，得到TTA1-Tat-PEG-GS NPs，再結(jié)合siRNA。瓊脂糖凝膠電泳檢測TTA1-Tat-PEG-GS NPs與siRNA的結(jié)合能力：兩者分別以20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1的質(zhì)量比制備懸液，均勻混合后上樣至瓊脂糖凝膠開始電泳，電壓80 V，時(shí)間20 min。分別取上述TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA復(fù)合物懸液置于表面電位儀上，測定表面粒徑、分散系數(shù)和電位。

1.2.3 C6細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 實(shí)驗(yàn)分四組：Control組（正常培養(yǎng)的C6細(xì)胞），TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組（TTA1-TAT-PEG-GS NPs轉(zhuǎn)染Scramble序列），TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組（TTA1-Tat-PEG-GS NPs轉(zhuǎn)染EGFR干擾序列）及X-tremeGene/siRNA-EGFR組（X-tremeGene Reagent轉(zhuǎn)染EGFR干擾序列）。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞1.0×105/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁達(dá)0.50融合度后，TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組細(xì)胞更換無血清培養(yǎng)基，分別加入TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scramble及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR復(fù)合物（根據(jù)方法“1.2.2”結(jié)果確定結(jié)合比例），共培養(yǎng)10 h更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。X-tremeGene/siRNA-EGFR組轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照X-tremeGene說明書中操作指南進(jìn)行。

1.2.4 Real-time PCR檢測C6細(xì)胞EGFR mRNA水平 轉(zhuǎn)染48 h后，分別消化收集各組細(xì)胞，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，并按照TaKaRa試劑盒說明進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次（擴(kuò)增EGFR的引物為：上游5'-GCCACAGGTTCCGAGATGAA-3'，下游5'-CCACGTAGTTTCTGGGGCAT-3'。用β-actin作內(nèi)參，其引物序列為：上游5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'，下游5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'）。

1.2.5 Western blot檢測C6細(xì)胞EGFR蛋白表達(dá)水平 轉(zhuǎn)染72 h后，分別消化收集各組細(xì)胞，離心棄去上清后加入RIPA細(xì)胞裂解液以及蛋白酶抑制劑PMSF。置于冰上30 min，4℃、12 000 r/min離心15 min，取上清測定蛋白濃度。取50 μg蛋白加入到上樣緩沖液中，經(jīng)100℃金屬浴加熱5 min變性后用SDS-PAGE電泳。常規(guī)轉(zhuǎn)膜及封閉后，分別加入抗EGFR或β-actin的一抗，4℃孵育過夜。TBST洗脫10 min×3次，加入二抗室溫孵育1 h，再用TBST洗脫10 min×3次。硝酸纖維素膜加入顯色液后，ECL化學(xué)發(fā)光顯像，圖像分析儀分析結(jié)果。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.2.6 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測C6細(xì)胞增殖能力 轉(zhuǎn)染48 h后，分別消化收集各組細(xì)胞，調(diào)整密度至5×104細(xì)胞/mL，各取100 μL細(xì)胞懸液/孔加入到5個(gè)96孔板中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。24 h后，取出1個(gè)96孔板，往每孔中加入10 μL CCK8試劑，37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光值。每隔24 h采用同樣的方法取1個(gè)96孔板檢測，連續(xù)測5 d。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測C6細(xì)胞的凋亡 轉(zhuǎn)染48 h后，分別消化收集各組細(xì)胞，調(diào)整密度至1×106細(xì)胞/mL，取0.5 mL細(xì)胞懸液，室溫1200 r/min離心3 min，去上清后再用200 μL預(yù)冷的1×結(jié)合緩沖液輕輕重懸。加入10 μL AnnexinV-FITC，室溫避光反應(yīng)15 min，室溫1000 r/min離心5 min，洗滌1次，用500 μL 1×結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，加入10 μL碘化丙啶（PI），4℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測分析凋亡情況。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TTA1-Tat-PEG-GS NPs與siRNA的結(jié)合比例

當(dāng)TTA1-Tat-PEG-GS NPs與siRNA的質(zhì)量比為100時(shí)，TTA1-Tat-PEG-GS NPs可將siRNA完全結(jié)合（圖1）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA的表面電位隨著TTA1-Tat-PEG-GS NPs與siRNA質(zhì)量比的增高而增加，同時(shí)粒徑相應(yīng)減小（表1）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA以100∶1的質(zhì)量比進(jìn)行結(jié)合時(shí)，復(fù)合物粒徑較小，表面電位較高，可完全結(jié)合siRNA。

條帶1：mark；條帶2：siRNA；條帶3、4、5、6、7：TTA1-Tat-PEG-GSNPs與siRNA的質(zhì)量分別比為20∶1、40∶1、60∶1、80∶1、100∶1

圖1 瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA

結(jié)合性

表1 TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA納米粒子粒徑、分散系數(shù)

和Zeta電位（x±s）

2.2 Real-time PCR檢測C6細(xì)胞中EGFR mRNA的相對(duì)表達(dá)量

Control組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組及X-tremeGene/siRNA-EGFR組EGFR的mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為（1.005±0.057）、（1.002±0.076）、（0.287±0.022）及（0.249±0.036）（圖2）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組表達(dá)水平較Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組明顯下調(diào)（P < 0.01），而與X-tremeGene/siRNA-EGFR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

**P < 0.01

圖2 Real-time PCR檢測四組C6細(xì)胞中EGFR mRNA的表達(dá)水平

2.3 Western blot檢測C6細(xì)胞中EGFR蛋白的表達(dá)

TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組蛋白的表達(dá)水平較Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組明顯下調(diào)（P < 0.01），抑制率約為0.70，而與X-tremeGENE/siRNA-EGFR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）（圖3）。

**P < 0.01

圖3 Western blot檢測四組C6細(xì)胞中EGFR蛋白的表達(dá)水平

2.4 C6細(xì)胞增殖的檢測

TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組細(xì)胞的增殖速度比Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組顯著減慢（圖4）。從第3天開始TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組與Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），并隨時(shí)間的延長差異增加（P < 0.01）。而TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組與X-tremeGene/siRNA-EGFR組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

*P < 0.05，**P < 0.01

圖4 CCK-8法檢測四組C6細(xì)胞的增殖情況

2.5 C6細(xì)胞凋亡的檢測

Control組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組、TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組及X-tremeGene/siRNA-EGFR組細(xì)胞早期凋亡率分別為（1.61±0.25）、（1.84±0.30）、（9.81±0.47）及（10.40±0.40）（圖5）。TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR組凋亡率較Control組及TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-Scr組明顯增加（P < 0.01），而與X-tremeGene/siRNA-EGFR組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。

3 討論

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，其預(yù)后較差，致殘率及病死率都很高[19]。膠質(zhì)瘤發(fā)生與發(fā)展伴有多種基因改變，因此基因治療提供了一種新的治療策略[20]。在此研究的基礎(chǔ)上，本研究提出一種由TTA1-Tat-PEG-GS NPs結(jié)合siRNA與膠質(zhì)瘤細(xì)胞mRNA相互作用的模式。這是一種將具有高特異靶向膠質(zhì)瘤的TTA1及Tat多肽同時(shí)作為靶向基團(tuán)，連接至GS NPs納米材料上，并對(duì)其進(jìn)行PEG修飾，設(shè)計(jì)成新型的TTA1-Tat-PEG-GS NPs基因載體。

為了研究新型基因載體TTA1-Tat-PEG-GS NPs結(jié)合siRNA是否能影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長和生存，本研究利用TTA1-Tat-PEG-GS NPs/siRNA-EGFR轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞后，通過Real-time PCR、Western blot分別在mRNA水平與蛋白水平檢測了其對(duì)EGFR的干擾效果，隨后通過CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測了細(xì)胞的增殖情況，并用流式細(xì)胞術(shù)檢測了細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示：TTA1-Tat-PEG-GS NPs結(jié)合siRNA-EGFR轉(zhuǎn)染C6細(xì)胞能夠有效干擾ERGF的表達(dá)，EGFR表達(dá)下調(diào)后可明顯降低C6細(xì)胞的增殖能力，并導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率上升。

總之，本研究建立了一種新的基因載體TTA1-Tat-PEG-GS NPs，它具有體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞的能力，并具備靶向傳遞能力以及穿膜功能，這使TTA1-Tat-PEG-GS NPs有可能成為一種獨(dú)特的基因傳遞載體，在膠質(zhì)瘤的基因治療中具有應(yīng)用潛力。鮮見有文獻(xiàn)報(bào)道以TTA1、Tat、PEG修飾的GS NPs作為基因傳遞系統(tǒng)在膠質(zhì)瘤治療的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中使用。然而，這種應(yīng)用目前只用于體外膠質(zhì)瘤細(xì)胞的siRNA傳遞，還沒有用于體內(nèi)膠質(zhì)瘤動(dòng)物模型。針對(duì)裸鼠原位膠質(zhì)瘤模型的siRNA傳遞的更多研究是筆者正在起步的工作。

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（收稿日期：2015-11-14 本文編輯：張瑜杰）