軟棗獼猴桃內(nèi)生真菌的分離純化及分子鑒定

廖林　郭睿昕　趙欣　李澤敏　毛子龍　楊玉紅

摘要： 以軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）枝條為試驗(yàn)原料，采用內(nèi)生真菌三步消毒法（乙醇-次氯酸鈉-升汞）對(duì)樣品進(jìn)行表面消毒，從軟棗獼猴桃枝條組織分離出一株內(nèi)生真菌菌株，命名為Y1，對(duì)Y1進(jìn)行核糖體18S rDNA克隆測(cè)定，獲得長(zhǎng)度為1 020 bp的18S rDNA序列，在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上進(jìn)行同源性比對(duì)，構(gòu)建18S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，鑒定該菌為子囊菌（Sac fungi）。

關(guān)鍵詞： 軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）； 內(nèi)生真菌； 分離； 純化； 鑒定

中圖分類(lèi)號(hào)：S432.4+4 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2016）06-1459-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.06.024

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta），又名軟棗子、獼猴梨、藤瓜，屬于獼猴桃科獼猴桃屬多年生落葉藤本植物。全世界獼猴桃屬植物共有66種，中國(guó)分布有62種。軟棗獼猴桃是9種光果獼猴桃種類(lèi)之一[1-3]。軟棗獼猴桃的單果平均重18 g，最大果重33 g，果皮綠色光滑，果肉綠色、多汁、細(xì)膩、酸甜適度，含可溶性固形物15%左右，總糖8.8%，有機(jī)酸1.5%，維生素C 430 mg/100 g，是蘋(píng)果的100倍，氨基酸933.9 mg/100 g。而且，軟棗獼猴桃富含各種營(yíng)養(yǎng)成分，具有各種醫(yī)療保健功效。軟棗獼猴桃汁具有阻斷致癌性亞硝基化合物合成的作用，還含有硫醇蛋白酶的水解酶和超氧化物歧化酶（SOD），可以嫩化肉類(lèi)，具有養(yǎng)顏、提高免疫功能、增強(qiáng)抗癌、抗衰老、軟化血管、抗腫消炎的功能[4-9]。

植物內(nèi)生菌是指那些在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物各種組織和器官內(nèi)部或細(xì)胞間隙的真菌或細(xì)菌，被感染的宿主植物（至少是暫時(shí)）不表現(xiàn)出外在癥狀[6-9]，內(nèi)生菌一般會(huì)產(chǎn)生一些在微生物-宿主關(guān)系中發(fā)揮作用的生物活性物質(zhì)（如抗細(xì)菌、抗真菌、抗病毒物質(zhì)等）。內(nèi)生真菌研究的主要領(lǐng)域有內(nèi)生真菌入侵宿主的分子機(jī)理、內(nèi)生真菌與宿主的關(guān)系、內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的篩選等。內(nèi)生真菌在醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)、工業(yè)領(lǐng)域越來(lái)越受到人們的關(guān)注[10-15]。

本試驗(yàn)以軟棗獼猴桃為材料分離純化其內(nèi)生真菌，篩選可產(chǎn)生活性成分的獼猴桃潰瘍病生防菌種，以便開(kāi)發(fā)出農(nóng)藥活性物質(zhì)，為獼猴桃潰瘍病的防治和軟棗獼猴桃其他病害防治奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

軟棗獼猴桃枝條采自沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)東北野生獼猴桃資源圃。試劑有75%乙醇、2%次氯酸鈉、0.1%升汞等。主要儀器有LDZX-40BI型立式自動(dòng)電熱壓力蒸汽滅菌器（上海中安醫(yī)療器械廠）、SW-CJ-ICU雙人單面凈化工作臺(tái)（浙江蘇凈凈化設(shè)備有限公司）、HPX-9082 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）、BX-53奧林巴斯顯微鏡（上海澤仕光電科技有限公司）、JD100-3電子天平（沈陽(yáng)龍騰電子有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 PDA培養(yǎng)基的配制及滅菌 稱取300 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加去離子水1 000 mL煮沸0.5 h，紗布過(guò)濾，再加10～20 g葡萄糖和17～20 g瓊脂，充分溶解后于0.1 MPa滅菌30 min，待溫度冷卻至40～50 ℃，在培養(yǎng)基中加入濃度為50 μg/mL的氨芐青霉素（防止細(xì)菌污染），充分混勻后將培養(yǎng)基倒入平皿中讓其自然冷卻凝固。

1.2.2 樣品組織表面消毒 將采集到的樣品組織在流水下沖洗掉表面塵土，室溫晾干后選取新鮮完整的獼猴桃組織作為材料。在無(wú)菌環(huán)境中依次用75%乙醇、2%次氯酸鈉、0.1%升汞分別消毒2 min。

1.2.3 內(nèi)生真菌的分離純化[16-21] 將消毒好的樣品枝條用無(wú)菌刀切成約1 cm長(zhǎng)的小段，每個(gè)平皿放4段，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)，每天觀察內(nèi)生菌的生長(zhǎng)狀況。分離純化方法如圖1所示。

1.2.4 菌種的鑒定方法[22，23] 內(nèi)生真菌的鑒定通常根據(jù)主要的群體和個(gè)體形態(tài)特點(diǎn)進(jìn)行歸類(lèi)與鑒定，同時(shí)可輔以生理生化及生態(tài)等特征加以鑒別。絲狀真菌的群體形態(tài)（即菌落形態(tài)）是鑒定的重要依據(jù)，如菌落大小、顏色、表面特征、質(zhì)地和生長(zhǎng)速度等，個(gè)體形態(tài)有菌絲、子實(shí)體、孢子和產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)等特征[24]。

純化后的菌株在生長(zhǎng)的最佳時(shí)期，用接種針挑取位于尖端、底部及外緣等不同位置的菌絲，置于滴加去離子水的載玻片上，菌絲散開(kāi)后蓋上蓋玻片，吸去多余的水分。在顯微鏡下觀察孢子及菌絲體的形態(tài)，并對(duì)其進(jìn)行拍照。根據(jù)菌株的菌絲體和孢子的形態(tài)特征，對(duì)照真菌鑒定手冊(cè)進(jìn)行初步鑒定[25]。顯微鏡觀察時(shí)也可以染色觀察，以方便觀察結(jié)果。

1.2.5 分子鑒定 形態(tài)學(xué)鑒定是傳統(tǒng)的方法，為確保鑒定的準(zhǔn)確性，采用分子鑒定和形態(tài)鑒定相結(jié)合的方法。在rDNA中的18S基因具有高度保守性，可以用來(lái)進(jìn)行在高分類(lèi)水平上的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的分析，以檢測(cè)和鑒定真菌。通過(guò)18S rDNA序列分析來(lái)鑒定軟棗獼猴桃內(nèi)生真菌菌株，并反映菌株的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 軟棗獼猴桃內(nèi)生真菌的菌種特征

按照最佳消毒條件，做多組重復(fù)試驗(yàn)，對(duì)樣品枝條進(jìn)行內(nèi)生真菌的分離純化，最終篩選得到一株生長(zhǎng)較好的內(nèi)生真菌，并將其命名為Y1，以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

內(nèi)生真菌菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成的菌落密度高、呈絨毛狀且菌絲體緊密。當(dāng)菌株在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d后，形成菌落直徑可達(dá)2 cm，菌落表面呈乳白色，無(wú)光澤，中心突起（圖2左）。

分離純化后得到的單菌落Y1，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，形成的菌落密度高、菌落表面呈白色，菌絲體松散。棉絮狀，菌絲體尖端有黑色孢子（圖2右）。

2.2 軟棗獼猴桃內(nèi)生真菌的形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)軟棗獼猴桃內(nèi)生真菌Y1進(jìn)行制片，顯微鏡下觀察，菌株形態(tài)較簡(jiǎn)單，菌絲生長(zhǎng)發(fā)達(dá)，有隔，較細(xì)，光滑，竹結(jié)狀，且都是雙核菌絲（圖3）。根據(jù)觀察到的菌落形態(tài)和菌絲的結(jié)構(gòu)特征，查閱真菌鑒定手冊(cè)及參考文獻(xiàn)進(jìn)行初步鑒定。結(jié)果表明，所分離純化后得到的軟棗獼猴桃內(nèi)生真菌屬于外囊菌屬真菌。為了得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果，對(duì)Y1內(nèi)生菌進(jìn)行分子鑒定。

2.3 分子鑒定

擴(kuò)增Y1菌株18S rDNA序列，并進(jìn)行電泳分析，如圖4所示。由圖4可知，Y1片段大小約1 000 bp，說(shuō)明擴(kuò)增的序列可以進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

將擴(kuò)增的Y1 18S rDNA序列送至金唯智生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序后去除載體及引物序列，共1 020 bp，判斷正反方向，正向序列結(jié)果如下所示。

登陸NCBI網(wǎng)站Blast，下載同源性99%以上的序列，多重序列比對(duì)后，尋找最優(yōu)核苷酸替代模型，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖5）。

Y1的18S rDNA序列在NCBI網(wǎng)站上Blast比對(duì)分析結(jié)果顯示，Y1與子囊菌（Sac fungi）相似度100%，結(jié)合形態(tài)鑒定，確定菌株Y1為子囊菌。

3 小結(jié)

從軟棗獼猴桃枝條中初步分離純化和鑒定獲得一株內(nèi)生真菌，經(jīng)過(guò)逐步純化后得到單一菌落，這株軟棗獼猴桃內(nèi)生真菌命名為Y1。經(jīng)形態(tài)學(xué)鑒定和分子鑒定，確定內(nèi)生菌Y1為子囊菌。

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