不同粒徑鹿茸總氨基酸的含量及體外溶出度的測定

白珺 宋寧 李楊 李昕光 陳新

[摘要] 目的 建立鹿茸細(xì)粉、超微粉總氨基酸的含量測定方法，并以總氨基酸為指標(biāo)測定兩種粉體的體外溶出度。方法 采用單因素試驗和正交試驗優(yōu)選總氨基酸的提取工藝；以甘氨酸為對照品，采用紫外分光光度法測定總氨基酸含量；測定鹿茸細(xì)粉、超微粉在pH值1.2、4.0、6.8三種溶出介質(zhì)中溶出度。 結(jié)果 總氨基酸提取最優(yōu)工藝為100倍量70%乙醇，超聲提取60 min，提取1次；細(xì)粉和超微粉總氨基酸含量分別為4.16、4.30 mg/g；細(xì)粉在pH值1.2、4.0、6.8介質(zhì)中的溶出率分別為38.55%、56.42%、107.88%；超微粉在pH值1.2、4.0、6.8介質(zhì)中溶出率分別為30.97%、50.85%、99.67%。 結(jié)論 提取工藝合理、可靠；含量測定方法簡便、準(zhǔn)確；鹿茸兩種粉體的總氨基酸均在pH值6.8的磷酸鹽緩沖液中溶出度高，為鹿茸腸溶劑型的開發(fā)提供了一定的思路。

[關(guān)鍵詞] 鹿茸；細(xì)粉；超微粉；總氨基酸；溶出度；含量測定

[中圖分類號] R927.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0144-05

[Abstract] Objective To establish the determination method for total amino acids of antler powders and superfine powders， and measure in vitro dissolution of two powders with total amino acids as indexes. Methods Orthogonal test and single factor tests were adopoted to investigate extractions of total amino acids. Total amino acids were measured by UV spectrophotometry with glycine as reference. Two powders' dissolution were determined at pH 1.2， 4.0 and 6.8 three dissolution mediums. Resluts The optimum process： 100 times 70% ethanol， ultrasonic extracting 60 min， extracted once. The total amino acids content of two powders was 4.16 mg/g and 4.30 mg/g. Medium value of powder dissolution rate at pH 1.2， 4.0， 6.8 was 38.55%， 56.42%， 107.88% respectively. Medium value of superfine powder dissolution rate at pH 1.2， 4.5， 6.8 medium value was 30.97%， 50.85%， 99.67% respectively. Conclusion The extraction technology is reasonable and reliable. The measurement is simple and accurate. Both two powders have high contents at pH 6.8 phosphate buffer dissolution， which provides some certain ideas for antler enteric preparation developments.

[Key words] Antler； Powder； Superfine powder； Total amino； Dissolution； Determination

鹿茸為脊索動物門哺乳綱鹿科的動物梅花鹿（Cervusnippon temminck）或馬鹿（Cervuselaphus linnaues）雄鹿未骨化密生茸毛的幼角，鹿茸具有壯腎陽、益精血等功效，為溫補(bǔ)腎陽之要藥，更是滋補(bǔ)佳品。目前市場上鹿茸產(chǎn)品形式種類繁多，最常見的劑型均是由鹿茸粉體入藥進(jìn)而加工制成的保健酒、口服液、軟膠囊等。選擇合適的原料藥，控制原料藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，對鹿茸產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用具有較為重要的影響。

超微粉碎可使藥材破壁率增加，有效成分更易溶出，提高生物利用度[1]。通過單因素試驗和正交試驗優(yōu)選鹿茸總氨基酸的提取工藝，測定鹿茸普通細(xì)粉和超微粉中的總氨基酸含量，并測定兩種粉體在鹽酸溶液（pH值1.2）、醋酸-醋酸鈉緩沖鹽溶液（pH值4.0）、磷酸鹽緩沖鹽溶液（pH值6.8）三種溶出介質(zhì)中的溶出度。

1 儀器與材料

RT靜音粉碎機(jī)（榮聰精密科技有限公司）；FA1204B電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；HWS-12電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；Spectrumlab752S紫外分光光度計（上海棱光技術(shù)有限公司）；飛鴿 LXJ-OB 低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；KQ-250B超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ZRS-6G溶出試驗儀（天津市天大天發(fā)科技有限公司）。

鹿茸藥材購于吉林仙草藥業(yè)有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室姜大成教授鑒定為鹿科動物馬鹿的雄性未骨化密生茸毛的幼角；鹿茸超微粉（濟(jì)南倍力粉技術(shù)工程有限公司供）；鹿茸細(xì)粉自制；甘氨酸對照品（批號：110713-201410，中國食品藥品檢定研究院）；茚三酮（上?；菔仙噭┯邢薰荆?；試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 總氨基酸的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

稱取干燥至恒重的甘氨酸對照品12.5 mg，精密稱定，置于25 mL容量瓶中，加水搖勻，定容至刻度，制得濃度為0.505 mg/mL的對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取細(xì)粉、超微粉各0.25 g，置具塞錐形瓶中，依據(jù)各工藝水平參數(shù)進(jìn)行提取，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，收集續(xù)濾液，即得。

2.1.3 測定方法

精密量取“2.1.2”項下供試品溶液各2.0 mL，置于25 mL容量瓶中，依次加入醋酸-醋酸鈉緩沖鹽溶液（pH值5.0）0.5 mL、3%茚三酮乙醇溶液0.5 mL，沸水浴加熱20 min取出，冷至室溫，加50%異丙醇溶液定容至刻度，搖勻。同法制成空白溶液，于570 nm波長處測定吸光度（A），采用對照品比較法計算總氨基酸含量。

2.1.4 線性關(guān)系考察

精密吸取甘氨酸對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，分別加水0.5、0.4、0.3、0.2、0.1 mL，以下操作同“2.1.3”項下測定法。以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。甘氨酸線性關(guān)系曲線方程為：Y = 144.88X + 0.06848，r=0.996，甘氨酸對照品在0.001～0.005 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5 精密度試驗

取甘氨酸對照品溶液0.3 mL，按“2.1.4”項下測定方法，連續(xù)測定6次。對照品溶液RSD為0.11%，小于5%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗

精密吸取供試品溶液各2.0 mL，按照“2.1.3”項下測定方法，分別于0、30、60、90、120、150 min測定吸光度（A）。結(jié)果兩種供試品溶液RSD為2.95%、3.72%，均小于5%，表明兩種供試品溶液在150 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7 重復(fù)性試驗 按照“2.1.2”項下細(xì)粉供試品溶液制備方法，制備6份供試品溶液，按照“2.1.3”項下測定方法，分別測定A值，結(jié)果總氨基酸含量平均值為4.16 mg，RSD為3.18%，說明重復(fù)性良好。

2.2 總氨基酸提取工藝篩選

2.2.1 單因素考察試驗

2.2.1.1 料液比的篩選 分別稱取細(xì)粉、超微粉各4份，每份0.25 g，分別加入30、50、100、150倍量70%乙醇，超聲提取30 min，提取1次，按照“2.1.2”項下供試品溶液制備方法，按“2.1.3”項下進(jìn)行測定。由圖1可知：增大料液比可明顯提高總氨基酸含量，且1∶100所得產(chǎn)物與1∶150所得產(chǎn)物總氨基酸含量差異不大，故從實際角度考察選擇1∶100作為料液比。見圖1。

2.2.1.2 提取時間的篩選 分別稱取細(xì)粉、超微粉各4份，每份0.25 g，均加入100倍70%乙醇，分別超聲提取30、45、60、80 min，提取1次，按照“2.1.2”項下供試品溶液制備方法，按“2.1.3”項下進(jìn)行測定。增加提取時間可明顯提高總氨基酸含量，且60 min所得產(chǎn)物與80 min所得產(chǎn)物總氨基酸含量差異不大，故從實際角度考察選擇60 min作為提取時間。結(jié)果見圖2。

2.2.1.3 提取次數(shù)的篩選 分別稱取細(xì)粉、超微粉各4份，每份0.25 g，均加入100倍70%乙醇，分別超聲提取60 min，分別提取1、2、3次，按照“2.1.2”項下供試品溶液制備方法，按“2.1.3”項下進(jìn)行測定。增加提取次數(shù)對總氨基酸含量無明顯影響，故從實際角度考察選擇提取1次作為提取次數(shù)。結(jié)果見圖3。

2.2.2 正交試驗優(yōu)選提取工藝

鹿茸粉體與提取介質(zhì)的料液比、提取時間、提取次數(shù)可能會對鹿茸總氨基酸的提取產(chǎn)生一定的影響，因此使用L9（34）正交試驗表對提取工藝影響因素進(jìn)行正交試驗，篩選最佳工藝條件。因素水平見表1。

稱取鹿茸細(xì)粉各9份，每份0.25 g，精密稱定，按照L9（34）正交試驗表的實驗條件進(jìn)行提取，以總氨基酸含量為考察指標(biāo)。通過正交試驗直觀分析結(jié)果顯示，因素影響的強(qiáng)弱順序為：A>B>C。通過綜合評價直觀分析結(jié)果顯示，因素A（料液比）、因素B（提取時間）對總氨基酸的含量結(jié)果影響差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）；因素C（提取次數(shù)）對總氨基酸含量影響差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P > 0.05）。最佳提取工藝為A3B3C1，即加入100倍量的提取溶劑，提取60 min，提取1次。

L9（34）直觀分析結(jié)果見表2，綜合評價直觀分析結(jié)果見表3。

2.3 總氨基酸含量測定方法驗證性試驗

取三批細(xì)粉、超微粉樣品，按照最佳提取工藝條件，制備三批樣品的供試品溶液，結(jié)果鹿茸細(xì)粉、超微粉總氨基酸含量均值分別為均值為4.16、4.30 mg/g，RSD分別為1.70%、0.84%。工藝穩(wěn)定、可靠。鹿茸細(xì)粉、超微粉中總氨基酸的含量按甘氨酸計算比較差異不大。

2.4 細(xì)粉與超微粉的體外溶出度測定

2.4.1 供試品溶液的制備

照溶出度測定法（《中國藥典》2010年版二部附錄XC）中槳法測定，分別以經(jīng)脫氣處理的HCl溶液（pH值1.2）、醋酸-醋酸鈉緩沖鹽溶液（pH值4.0）、磷酸鹽緩沖溶液（pH值6.8）為溶出介質(zhì)，體積為900 mL，轉(zhuǎn)速為50 r/min，溫度為（37.0±0.5）℃。分別稱取三份鹿茸細(xì)粉、超微粉9 g，精密稱定，投入溶出杯中。樣品接觸溶質(zhì)即開始計時，分別于5、10、15、30、45、60、120 min，取樣5 mL，立即補(bǔ)充等溫等體積的溶出介質(zhì)，樣品溶液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.4.2 測定法

將兩種供試品溶液置于25 mL容量瓶中，以下操作同“2.1.3”項下測定法。

2.4.3 溶出度的計算

2.4.4 溶出曲線的繪制

以總氨基酸在不同時間點的溶出度為縱坐標(biāo)，以不同時間點為橫坐標(biāo)，繪制溶出曲線。結(jié)果見圖4～8。

2.4.5 試驗結(jié)果

細(xì)粉在pH值1.2、4.5、6.8介質(zhì)中的溶出率分別為38.55%、56.42%、107.88%；超微粉在pH值1.2、4.5、6.8介質(zhì)中溶出率分別為30.97%、50.85%、99.67%。在pH值1.2、4.0、6.8介質(zhì)中，細(xì)粉與超微粉均在15、45、60 min后達(dá)到溶出平衡。為排除溶出時間不足的因素，同法測定了經(jīng)24 h后的平衡溶出率，發(fā)現(xiàn)與120 min測定值無差異，故將溶出時間考察選定在120 min內(nèi)。

3 討論

鹿茸中含有豐富的氨基酸[2]，含量最多的為甘氨酸、脯氨酸和谷氨酸[3]，氨基酸總量在50%以上，包含人體不能合成的七種必需氨基酸[4]。大量藥效學(xué)研究表明[5-12]，總氨基酸是鹿茸發(fā)揮功效的一組有效部位群，課題組前期實驗表明[13-15]，氨基酸可能為鹿茸填益精髓、提高免疫力的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。鹿茸制劑及其保健食品可以為人體提供更為豐富的氨基酸，是人體獲得氨基酸的一種有效途徑，水解氨基酸含量在一定程度上決定了鹿產(chǎn)品的藥用價值[16]。因此選用總氨基酸作為測定指標(biāo)，既是主要成分又是有效成分，為制訂鹿茸及相關(guān)制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)具有一定的意義。

生物活性成分通常是分布于初級代射產(chǎn)物的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間質(zhì)由其衍生出來的次級代射產(chǎn)物，如生物堿類、萜類、黃酮類、香豆素類、氨基酸等，它們在植物體內(nèi)的含量很低。中藥的超微粉碎主要是基本成分的破碎，次級代謝產(chǎn)物對中藥粉碎的影響不大[17]，超微粉碎對鹿茸氨基酸類成分的影響不大的原因可能在于此。鹿茸為動物類藥材，其組織結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，某些易碎組織在粉碎過程中易于形成小顆粒，而一些不易粉碎的組織則在大顆粒粉末中較多，會導(dǎo)致成分在不同粒徑粉末中分布不均勻[18]。因此，為了使有效成分集中、避免原料浪費(fèi)，則需要較為嚴(yán)格地控制原料藥入藥粒徑的均一性、穩(wěn)定性，避免分量不均勻，造成批內(nèi)差異。

中藥經(jīng)不同程度粉碎后，表面能增加，使顆粒處于非穩(wěn)定狀態(tài)，從而造成流動性差、吸濕性強(qiáng)，產(chǎn)生了一定的膠黏性，因而其在投入到溶出杯中后，并沒有迅速分散至溶出介質(zhì)中，造成了超微粉較細(xì)粉溶出度較低的現(xiàn)象。有研究[19-20]也曾指出有效成分為水溶性成分溶出并非粒度越小越好，而應(yīng)在一個最佳粒度范圍內(nèi)。總氨基酸在胃液環(huán)境中溶出較少，而在腸液環(huán)境中釋放程度得到很大的提高，可考慮制備腸溶性固體分散體，提高鹿茸的生物利用度，但仍存在著一定的不足和局限，實驗后期，應(yīng)繼續(xù)從蛋白質(zhì)含量等多方面來評價鹿茸有效成分的在體內(nèi)的吸收利用程度[21-23]。

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（收稿日期：2015-11-25 本文編輯：趙魯楓）