水通道蛋白4基因敲除對博來霉素誘導小鼠肺纖維化的影響

余舒瑩 魏爾清

[摘要] 目的 觀察水通道蛋白4（AQP4）基因敲除對博萊霉素（BLM）致小鼠肺纖維化過程的影響，初步評價半胱氨酰白三烯受體在此過程的作用。 方法 設AQP4+/+對照組、AQP4+/+ BLM組、AQP4-/-對照組、AQP4-/- BLM組，每組各6只小鼠。每日記錄一般情況，第12天處死小鼠，算肺系數(shù)及HE、Masson染色觀察病理變化，提取蛋白行免疫印跡雜交（Western blotting）檢測半胱氨酰白三烯受體1（CysLT1R）、受體2（CysLT2R）的表達。 結果 第12天時，AQP4+/+BLM組小鼠肺系數(shù)（14.65±1.92）為AQP4+/+對照組（6.97±1.54）的2.1倍（P < 0.01），AQP4+/+ BLM組的CysLT1 R表達明顯高于AQP4+/+對照組（P < 0.05），而CysLT2 R表達稍低于AQP4+/+對照組，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。第12天時，AQP4-/-BLM組小鼠肺系數(shù)（10.99±1.66）為AQP4-/-對照組（6.19±2.09）的1.8倍（P < 0.01），AQP4-/- BLM組的CysLT1R、CysLT2R表達與AQP4-/-對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。AQP4-/-BLM組肺系數(shù)明顯低于AQP4+/+BLM組，差異有高度統(tǒng)計學意義（P < 0.01）。肺組織病理學結果表明AQP4-/-BLM組小鼠炎癥細胞浸潤及纖維化程度較AQP4+/+BLM組輕。 結論 AQP4基因敲除可減輕博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化過程中的肺水腫、肺泡炎，AQP4可能是通過調控CysLT1R參與此過程。

[關鍵詞] 水通道蛋白4；肺纖維化；半胱氨酰白三烯受體；博來霉素

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0043-04

[Abstract] Objective To observe the effects of aquporin-4 and Cysteinyl leukotriene receptor on Bleomycin （BLM） induced pulmonary fibrosis in mice. Methods The experiment was divided into AQP4+/+ control group， AQP4+/+ BLM group， AQP4-/- control group and AQP4-/- BLM group， with 6 mice in each group. General status of mice were recorded every day， The mice were sacrificed on the 12th day and the pulmonary index was calculated. HE and Masson's staining were administered to observe the pathological changes. The expression of CysLT1 receptor （CysLT1R） and CysLT2 receptor （CysLT2R） were observed by Western blotting. Results At the 12th day， the lung coefficient of AQP4+/+ BLM group （14.65±1.92） was 2.1 times as much as AQP4+/+ control group （6.97±1.54） （P < 0.01）， the level of CysLT1 receptor expression in AQP4+/+ BLM group was higher than that in AQP4+/+ control group （P < 0.05）， CysLT2R expression was slightly lower， but the differences were not statistically significant （P > 0.05）. At the 12th day， the lung coefficient of AQP4-/- BLM group （10.99±1.66） was 1.8 times as much as AQP4-/- control group （6.19±2.09） （P < 0.01）， CysLT1R and CysLT2R expression in AQP4-/- BLM group was compared with AQP4-/- control group， the differences were not statistically significant （P > 0.05）. the lung coefficient of AQP4-/-BLM group was lower than that in AQP4+/+BLM， the differences were statistically significant （P < 0.05）. Pathological examination results of lung tissues indicated that the effect of reducing alveolar catarrh and pulmonary fibrosis of AQP4-/- BLM group had an advantage over that of AQP4+/+ BLM group. Conclusion AQP4 gene knockout can attenuate the degree of Bleomycin induced pulmonary edema， alveolar inflammation， AQP4 may regulate bleomycin induced lung fibrosis via CysLT1R.

[Key words] Aquporin-4； Pulmonary fibrosis； Cysteinyl leukotriene receptor； Bleomycin

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）是肺慢性病變的最終階段，其發(fā)病機制并不清楚但可能與急性、持續(xù)或反復發(fā)生的肺損傷和炎癥有關[1-2]。半胱氨酰白三烯（Cysteinyl leukotienes，CysLTs）是重要的炎性介質，主要通過CysLT1類受體（CysLT1R）和CysLT2類受體（CysLT2R）發(fā)揮作用[3]。臨床研究發(fā)現(xiàn)特發(fā)性肺纖維化患者的肺勻漿中LTC4和LTB4水平顯著增加[4]。使用CysLT1R拮抗劑1～2周后可抑制博萊霉素誘導的小鼠肺纖維化進程[5-6]，提示LTs與肺纖維化的發(fā)病機制有關。水通道蛋白（aquaporins，AQPs）介導了多種類型細胞的跨膜水轉運，而AQP4主要調節(jié)氣道表面液體與氣體濕化過程[7]。研究表明AQP4在慢性阻塞性肺病患者氣道中表達越少，氣道炎癥程度越重[8]，提示AQP4在呼吸系統(tǒng)的病理生理作用。但AQP4在肺纖維化形成過程中的影響，及與AQP4功能調節(jié)有關的CysLT受體亞型等問題，有待于進一步闡明。由于缺乏特異性的拮抗劑，對AQP4的生理作用及其調節(jié)機制仍缺乏深入的了解，水通道基因敲除的動物模型是目前研究AQP4功能的主要手段[9]。本研究利用AQP4敲除小鼠，通過博萊霉素氣管內注射誘導的小鼠肺纖維化模型，觀察AQP4對此過程中的作用及初步探討AQP4與CysLT受體的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

野生型（AQP4+/+）和AQP4基因敲除（AQP4-/-）CD1成年健康雄性小鼠，25～30 g，由南京醫(yī)科大學藥理教研室提供，其遺傳背景及鑒定見文獻[10]。所有的動物飼養(yǎng)在溫度控制的環(huán)境（22±1）℃下，12 h明暗循環(huán)，自由飲食和飲水。

1.2 主要藥物、試劑及儀器

注射用鹽酸博萊霉素A2（日本化藥株式會社，批號191140，進口注冊證號H20040205）、生理鹽水（華東醫(yī)藥股份有限公司）；兔抗小鼠CysLT1R、CysLT2R多克隆抗體由本研究室制備[11]。熒光顯微鏡（Olympus BX51）（Olympus DP70，日本Olympus公司）；切割式勻漿器（Heidolph Diax 900，德國Heidolph公司）；SDS-PAGE膠電泳轉膜裝置（BIO-RAD公司）；ODYSSEY免疫印跡膜熒光成像系統(tǒng)（美國LI-COR Biosciences公司）。

1.3 肺纖維化模型的建立與樣本處理

按文獻報道的方法[12]，予以小鼠10%水合氯醛腹腔麻醉，按1.5 mg/kg緩慢經氣管注入博萊霉素（BLM），對照組用同樣方法注入生理鹽水。待動物清醒后常規(guī)飼養(yǎng)，每天記錄小鼠的一般情況（體重、毛色、活動、呼吸等），給藥12 d后處死，計算肺系數(shù)。右肺供組織學檢查，左肺作免疫印跡用。

1.4 肺系數(shù)的計算

肺系數(shù)是反映肺炎癥水腫程度的一個指標，計算公式：肺系數(shù)=（肺重/體重）×100（g/g），其值越高說明肺病變程度越重。

1.5 肺組織病理學觀察

常規(guī)取肺組織固定、脫水包埋，制成4 μm切片行HE及Masson染色，光學顯微鏡下觀察肺組織病理學改變。

1.6 Western blotting測定CysLT1R、CysLT2R蛋白

按報道的方法[13]提取小鼠肺組織蛋白，考馬斯亮藍法測定肺組織蛋白濃度。相應濃度和等量的樣品蛋白經SDS-PAGE電泳轉膜，漂洗封閉后，分別放入混有兔抗小鼠CysLT1多克隆受體（1∶500）、GAPDH（小鼠單克隆抗體1∶5000）及CysLT2多克隆抗體（1∶500）、GAPDH的一抗及二抗（1∶5000）進行免疫反應，膜漂洗后利用成像系統(tǒng)，以GAPDH為內參用Quality One軟件，結果以CysLT1R、CysLT2R與GAPDH的條帶光密度值相對百分比表示。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用Prism 5 for Windows（美國Graph Pad軟件公司）作統(tǒng)計分析，正態(tài)分布計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，以One-way ANOVA檢驗差異顯著性，組間比較用Dunnett-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠體重及肺系數(shù)變化

AQP4+/+對照組、AQP4-/-對照組小鼠毛色潤澤，體重在各時間點，比較差異均無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）（圖1）；AQP4+/+BLM組小鼠活動減少，體重稍下降，而AQP4-/-BLM組小鼠體重隨時間呈明顯下降趨勢。第12天時，AQP4+/+BLM組小鼠肺系數(shù)（14.65±1.92）為AQP4+/+對照組（6.97±1.54）的2.1倍（P < 0.01）；AQP4-/-BLM組小鼠肺系數(shù)（10.99±1.66）為AQP4-/-對照組（6.19±2.09）的1.8倍（P < 0.01）；與AQP4+/+BLM組小鼠比較，AQP4-/-BLM組小鼠肺系數(shù)明顯降低（P < 0.05）（圖2）。

2.2 肺組織病理學變化

對照組小鼠支氣管黏膜上皮完好，管腔規(guī)則，周圍無炎癥細胞浸潤（圖3A）且未見有肺實質膠原沉積（圖3B）。造模第12天，給藥組小鼠支氣管與血管周圍有大量炎癥細胞浸潤及纖維組織增生，但AQP4-/-BLM組小鼠肺內損傷明顯輕于AQP4+/+BLM組小鼠，炎癥細胞浸潤及纖維化程度也有所減輕。

2.3 肺組織CysLT1R、CysLT2R的表達

Western blotting結果顯示，與AQP4+/+對照組比較，AQP4+/+BLM組小鼠CysLT1R表達顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05），CysLT2R的表達稍有下降，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）；AQP4-/-BLM組小鼠CysLT1R表達較AQP4-/-對照組無明顯增高（P > 0.05），CysLT2R表達稍有升高，但差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05）。見表1、圖4。

3 討論

肺纖維化伴隨多種類型炎癥細胞的滲透，炎癥介質的釋放，從而導致血管通透性的增加及慢性肺水腫[2，14-15]。研究發(fā)現(xiàn)經氣管內灌注BLM可以造成小鼠肺纖維化，病理組織學和生理學的改變均與人類肺纖維化近似，因此常以該藥制作肺纖維化模型[16-17]。氣管內注射BLM后AQP4+/+、AQP4-/-小鼠的肺系數(shù)均增高，表明BLM成功誘導小鼠發(fā)生肺纖維化，組織病理學結果也證實這一結論。與AQP4+/+BLM組相比，AQP4-/-BLM組小鼠肺系數(shù)明顯降低，纖維化程度也有所減輕，表明AQP4缺失可能減輕肺纖維化的癥狀。AQPl、AQP4雙敲除小鼠肺內毛細血管與肺泡水通透性較野生型降低14～16倍[18]。重量檢測的方法顯示AQP4-/-小鼠肺泡毛細血管間水的滲透性明顯下降[19]。本研究結果也提示AQP4在小鼠肺泡毛細血管間水轉運過程中發(fā)揮重要作用，對BLM誘導的小鼠肺部炎癥水腫有促進作用。

有文獻報道在BLM誘導肺纖維化的小鼠模型中，靶向斷裂胞漿磷脂酶A2阻斷LTs的生成，可明顯減輕肺纖維化的程度[20]；BLM誘導的肺組織中CysLT1R mRNA表達增高，而CysLT2R mRNA表達降低，CysLT1R拮抗劑孟魯司特可通過調節(jié)CysLT1R和CysLT2R的平衡來改善肺纖維化[21]。本研究發(fā)現(xiàn)AQP4+/+BLM組CysLT1R表達顯著增高，與上述文獻結果一致，推斷AQP4可能通過調控CysLT1R參與肺纖維化的過程，但這一結論尚待進一步實驗證實。而AQP4+/+BLM小鼠CysLT2R表達稍有增高但未有顯著差異，盡管這種變化的原因尚不明確，但可能與與兩種受體的相互作用有關。AQP4參與了氣道炎癥的病理生理過程[22]，而肺纖維化是氣道炎癥之一，提示AQP4在小鼠肺纖維化炎癥過程中的重要作用，關于AQP4在調節(jié)肺纖維化發(fā)生病理生理過程中的具體機制還需通過進一步的研究來證明。

綜上所述，AQP4-/-可減輕BLM誘導的小鼠肺纖維化過程中的肺水腫，AQP4可能是通過調控CysLT1R參與此過程。本研究初步確定AQP4對小鼠肺纖維化過程的影響及可能的作用機制，為認識AQP4在呼吸系統(tǒng)中的作用提供參考。

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（收稿日期：2015-12-20 本文編輯：蘇 暢）