博來(lái)霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因橢圓球藻（Chloroidium ellipsoideum）生長(zhǎng)及油脂積累的影響

陳 娟，丁蘭平，李 奧，李園園，劉麗麗

（1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津300387；2.天津師范大學(xué)天津市動(dòng)植物抗性重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300387）

小球藻是一類真核單細(xì)胞藻類，屬于小球藻目（Chlorellales）小球藻科（Chlorellaceae）. 國(guó)內(nèi)外廣泛培養(yǎng)的橢圓小球藻（Chlorella ellipsoidea）和蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）現(xiàn)分別被命名為橢圓球藻（Chloroidium ellipsoideum） 和 蛋 白 核 異 養(yǎng) 球 藻（Auxenochlorella pyrenoidosa），與小球藻屬（Chlorella）一起統(tǒng)稱為小球藻類（Chlorella complex）[1]. 小球藻類富含蛋白質(zhì)、氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)和碳水化合物，也是已知含量最高的葉綠素來(lái)源，其葉綠素質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)2%[2-3].由于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高且有利于健康，小球藻類已成為人們重要的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑，也可以加工成動(dòng)物飼料和其他高價(jià)值產(chǎn)品[3-4]. 小球藻的脂質(zhì)含量高，超過(guò)大多數(shù)陸生植物，是生物燃料生產(chǎn)的最佳候選微藻物種，也是最具潛力、最能實(shí)現(xiàn)可持續(xù)供給油脂的生物質(zhì)資源之一[5-8].另外，作為理想的研究基因表達(dá)及生理生化性質(zhì)的藻種，小球藻類也已廣泛應(yīng)用于基因工程領(lǐng)域[9]. 利用生物反應(yīng)器培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小球藻類具有比較明顯的優(yōu)勢(shì)，其分離純化表達(dá)產(chǎn)物和操作方法步驟簡(jiǎn)單，產(chǎn)業(yè)化培養(yǎng)技術(shù)成熟，適宜于規(guī)?；a(chǎn)[10-11].

我國(guó)抗生素的產(chǎn)量和使用量逐年增加，且存在過(guò)度使用的情況.抗生素的濫用，對(duì)陸地和水體環(huán)境均構(gòu)成了潛在污染[12-13].博來(lái)霉素是一種水溶性抗生素，應(yīng)用廣泛.有研究發(fā)現(xiàn)，博來(lái)霉素能抑制微擬球藻的生長(zhǎng)[14-15].Gus 基因是目前應(yīng)用較多的一種報(bào)告基因，可編碼β-葡萄糖苷酸酶，用于檢測(cè)外源基因的轉(zhuǎn)化效率，方法簡(jiǎn)單且靈敏度高[16].基于人工導(dǎo)入外源目的基因的小球藻類可能在環(huán)境適應(yīng)、生長(zhǎng)和油脂轉(zhuǎn)化等方面發(fā)生變化的設(shè)想，本課題組前期利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將Gus 基因成功轉(zhuǎn)入野生型橢圓球藻[17]，期望篩選到適應(yīng)環(huán)境能力強(qiáng)、生長(zhǎng)快且產(chǎn)油率高的轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)品系.在此基礎(chǔ)上，本研究擬通過(guò)對(duì)比分析不同濃度的博來(lái)霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因橢圓球藻pUGus 和野生型橢圓球藻的細(xì)胞密度、藻粉和油脂產(chǎn)量的影響，進(jìn)一步了解外源基因片段對(duì)小球藻類敏感性、生長(zhǎng)速率和代謝物生成的影響，為篩選環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)、產(chǎn)油率高的優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)基因橢圓球藻新品系以及構(gòu)建生物能源生產(chǎn)模式提供科學(xué)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 藻種

野生型橢圓球藻Chloroidium ellipsoideum（SD-0701），購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院淡水藻種庫(kù)；pUGus 型橢圓球藻（SD-0702，將Gus 基因轉(zhuǎn)入野生型橢圓球藻），由天津師范大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.2 試劑

葡萄糖、酵母粉、Ca（NO3）2、KH2PO4、MgSO4·7H2O、KCl、FeCl3·6H2O，分析純級(jí)（AR），購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；博來(lái)霉素，分析純級(jí)（AR），購(gòu)自天津智藍(lán)欣佰生物技術(shù)有限責(zé)任公司.

Knap 培養(yǎng)基（/L）：葡萄糖3 g、酵母粉3 g、Ca（NO3）20.1 g、KH2PO40.025 g、MgSO4·7H2O 0.025 g、KCl 0.012 g、FeCl3·6H2O 0.2 g.共設(shè)置9個(gè)處理組，博來(lái)霉素質(zhì)量濃度梯度為：0（對(duì)照組Ⅰ和對(duì)照組Ⅱ）、4、6、8、10、12、14 和16 μg/mL，每組各3個(gè)重復(fù)，共27個(gè)處理.

1.2 方法

取對(duì)照組Ⅰ處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的2 種橢圓球藻細(xì)胞各3.676×107個(gè)，分別轉(zhuǎn)接至對(duì)照組Ⅱ和7個(gè)博來(lái)霉素含量不同的處理組中，培養(yǎng)基體積為30 mL，保證每瓶接種量一致，光照強(qiáng)度50 μmol/（m2·s）、25 ℃條件下靜置培養(yǎng)8 d，每組各3個(gè)重復(fù)，共24個(gè)處理.

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

藻液細(xì)胞密度與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：取對(duì)照組Ⅰ中處于指數(shù)期或者穩(wěn)定期的密度較大且無(wú)污染的藻種原液，分別稀釋2、4、6、10、20、40、60 和100 倍，利用分光光度法和血球計(jì)數(shù)法測(cè)定不同稀釋倍數(shù)藻液的OD680值和細(xì)胞密度，以細(xì)胞密度為橫坐標(biāo)，OD680值為縱坐標(biāo)，得到藻液吸光度與細(xì)胞密度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：y0=25.879x-1.776，R2=0.9756，其中x為細(xì)胞密度（106mL-1），y0為藻液的OD680值.

油脂含量與吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制：分別稱取對(duì)照組Ⅰ的干制藻粉0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg，以香草醛比色法浸提待測(cè)樣品的總脂[18]，在528 nm 下進(jìn)行比色.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：y1=5.8246x+0.0957，R2=0.9970，其中x為油脂質(zhì)量，y1為OD528值.

1.2.2 干藻粉的制備

橢圓球藻培養(yǎng)至第8 天，取各處理組的藻液10 mL，3500 r/min 下離心4 min，去除上清，收獲沉淀.將沉淀在-80 ℃冰箱中反復(fù)凍融2 次，每次間隔12 h，于25 ℃下風(fēng)干約48 h 至恒重.

1.2.3 細(xì)胞密度、藻粉產(chǎn)量及油脂含量的測(cè)量

每天定時(shí)取樣，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量各個(gè)處理組藻液的OD680值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y0計(jì)算藻液細(xì)胞密度.稱量1.2.2 制備的藻粉干重并計(jì)算產(chǎn)量.取各處理組干藻粉2 mg，以香草醛比色法制備待測(cè)樣品的總脂，測(cè)定樣品的OD528值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線y1計(jì)算橢圓球藻的產(chǎn)油率及油脂產(chǎn)量.

1.3 數(shù)據(jù)處理

用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用Spss17.0 軟件進(jìn)行單因素方差（One-Way ANOVA）統(tǒng)計(jì)分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 博來(lái)霉素對(duì)橢圓球藻生長(zhǎng)的影響

培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的博來(lái)霉素，培養(yǎng)期內(nèi)SD-0701 和SD-0702 的生長(zhǎng)情況如圖1 所示.

圖1 博來(lái)霉素對(duì)SD-0701 和SD-0702 細(xì)胞密度的影響Fig.1 Effect of zeocin on the cell density of SD-0701 and SD-0702

由圖1 可以看出，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，SD-0701和SD-0702 的生長(zhǎng)均呈上升趨勢(shì).博來(lái)霉素對(duì)2個(gè)藻株的生長(zhǎng)均存在一定的抑制作用，且質(zhì)量濃度越大抑制作用越明顯.比較2個(gè)藻株的生長(zhǎng)情況可知，博來(lái)霉素對(duì)野生型橢圓球藻（SD-0701）的抑制作用顯著強(qiáng)于pUGus 型橢圓球藻（SD-0702）.

博來(lái)霉素雖然對(duì)SD-0701 生長(zhǎng)的抑制作用明顯，但受濃度影響較小，在培養(yǎng)的第8 天，對(duì)照組中SD-0701 的細(xì)胞密度達(dá)7.494×108mL-1，各博來(lái)霉素濃度處理組中的細(xì)胞密度相近，約為0.756×108mL-1.博來(lái)霉素對(duì)SD-0702 生長(zhǎng)的抑制作用明顯受濃度的影響，濃度越高抑制越強(qiáng)烈.不添加博來(lái)霉素的2個(gè)對(duì)照組中，SD-0701 和SD-0702 的生長(zhǎng)狀況存在差異，在培養(yǎng)的第8 天，SD-0702 的細(xì)胞密度為6.377×108mL-1，低于SD-0701 的細(xì)胞密度.SD-0701 在培養(yǎng)基中添加博來(lái)霉素后基本處于停止生長(zhǎng)的狀態(tài)，博來(lái)霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL 時(shí)抑制率已經(jīng)達(dá)到87.31%；而SD-0702僅在添加14 μg/mL 和16 μg/mL 的博來(lái)霉素后基本處于停止生長(zhǎng)的狀態(tài)，抑制率分別為88.68%和88.63%，添加4 μg/mL 時(shí)抑制率僅為12.23%.由此可見(jiàn)，SD-0701對(duì)博來(lái)霉素的抗性差，而SD-0702 對(duì)博來(lái)霉素的抗性較強(qiáng)，且與博來(lái)霉素的濃度相關(guān)，低濃度的博來(lái)霉素對(duì)SD-0702 生長(zhǎng)的影響較小，高濃度的抑制作用明顯.

2.2 博來(lái)霉素對(duì)橢圓球藻藻粉產(chǎn)量的影響

靜置培養(yǎng)的第8 天，各處理組中橢圓球藻藻粉的產(chǎn)量如圖2 所示.

圖2 博來(lái)霉素對(duì)SD-0701 和SD-0702 藻粉產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of zeocin on the yield of algal powder of SD-0701 and SD-0702

由圖2 可以看出，博來(lái)霉素對(duì)SD-0701 和SD-0702的藻粉產(chǎn)量均存在一定的抑制作用.培養(yǎng)基中未添加博來(lái)霉素時(shí)，SD-0701 的藻粉產(chǎn)量略高于SD-0702，分別為3.34 g/L 和3.21 g/L. 添加博來(lái)霉素后，因SD-0701 對(duì)博來(lái)霉素敏感，細(xì)胞生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，因此制備不出藻粉.博來(lái)霉素對(duì)SD-0702 藻粉產(chǎn)量的抑制作用明顯受添加量的影響，濃度越高抑制越明顯.博來(lái)霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL 和6 μg/mL 時(shí)，SD-0702 的藻粉產(chǎn)量分別降低12.44%和13.81%，隨著博來(lái)霉素質(zhì)量濃度的增加，藻粉產(chǎn)量大幅度下降，質(zhì)量濃度為14 μg/mL 和16 μg/mL 時(shí)，藻粉產(chǎn)量分別下降58.64%和66.31%.

2.3 博來(lái)霉素對(duì)橢圓球藻含油率和油脂產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的博來(lái)霉素時(shí)，各處理組中SD-0701 和SD-0702 的含油率和油脂產(chǎn)量如圖3所示.

圖3 博來(lái)霉素對(duì)SD-0701 和SD-0702 含油率和油脂產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of zeocin on oil content and yield of SD-0701 and SD-0702

由圖3（a）可以看出，不添加博來(lái)霉素時(shí)，SD-0701的含油率略高于SD-0702，分別為14.20%和13.61%.培養(yǎng)基中添加博來(lái)霉素時(shí)，SD-0702 的含油率明顯受博來(lái)霉素濃度的影響，低濃度會(huì)稍微促進(jìn)其油脂積累，高濃度則產(chǎn)生抑制作用.博來(lái)霉素質(zhì)量濃度為4、6和8 μg/mL 時(shí)，SD-0702 的含油率分別為14.38%、14.27%、13.66%，超過(guò)對(duì)照組的含油率；質(zhì)量濃度為10、12、14和16 μg/mL 時(shí)，SD-0702 的含油率分別為13.10%、12.70%、10.26%和9.89%，低于對(duì)照組的含油率.

由圖3（b）可以看出，不添加博來(lái)霉素時(shí)，SD-0701和SD-0702 油脂產(chǎn)量分別為0.474 g/L 和0.436 g/L.博來(lái)霉素質(zhì)量濃度較低時(shí)（≤6 μg/mL），SD-0702 的油脂產(chǎn)量略有下降，博來(lái)霉素質(zhì)量濃度超過(guò)6 μg/mL 時(shí)，油脂產(chǎn)量急劇下降.

3 討論

本研究以野生型橢圓球藻（SD-0701）和含有外源基因Gus 的橢圓球藻（SD-0702）為實(shí)驗(yàn)材料，在Knap培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量的博來(lái)霉素，觀察測(cè)量2個(gè)藻株的生長(zhǎng)、藻粉產(chǎn)量、含油率和油脂產(chǎn)量.培養(yǎng)基中不添加博來(lái)霉素時(shí)，野生型橢圓球藻的細(xì)胞密度、藻粉產(chǎn)量、含油率和油脂產(chǎn)量均高于含有外源基因Gus 的橢圓球藻.吳海月等[19]研究發(fā)現(xiàn)，含有外源基因Gus 的藻株性能較野生型藻株低，生長(zhǎng)速率低，代時(shí)長(zhǎng)，藻粉產(chǎn)量低，油脂產(chǎn)量也低，與本研究結(jié)果相符.當(dāng)添加博來(lái)霉素時(shí)，轉(zhuǎn)入外源基因Gus 的藻株生長(zhǎng)速率明顯高于野生型藻株.博來(lái)霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL 時(shí)，野生型藻株的生長(zhǎng)就受到顯著抑制；隨著培養(yǎng)基中博來(lái)霉素濃度的增加，轉(zhuǎn)入外源基因Gus 的藻株所受的抑制作用也隨之增強(qiáng)，但在添加14 μg/mL 和16 μg/mL 的博來(lái)霉素時(shí)才受到較強(qiáng)的抑制作用.張琳等[15]研究表明，微擬球藻對(duì)博來(lái)霉素高度敏感，在固體培養(yǎng)時(shí)，0.5 μg/mL博來(lái)霉素即可完全抑制微擬球藻生長(zhǎng)，在液體培養(yǎng)時(shí)，1 μg/mL 博來(lái)霉素即可完全抑制其生長(zhǎng).本研究結(jié)果表明，在Knap 液體培養(yǎng)基中添加4 μg/mL 博來(lái)霉素時(shí)野生型橢圓球藻基本停止生長(zhǎng)，與微擬球藻的完全抑制濃度不同，這可能是由于不同藻種對(duì)博來(lái)霉素的敏感程度不同.

培養(yǎng)基中添加4 μg/mL 的博來(lái)霉素時(shí)，2 種橢圓球藻的生長(zhǎng)均開(kāi)始受到抑制，此時(shí)博來(lái)霉素對(duì)SD-0701的抑制率達(dá)到87.31%，對(duì)SD-0702 的抑制率僅有12.23%.由于SD-0701 在博來(lái)霉素質(zhì)量濃度為4 μg/mL時(shí)已經(jīng)基本停止生長(zhǎng)，藻粉產(chǎn)量微小無(wú)法制備，油脂產(chǎn)量極低；但SD-0702 在此質(zhì)量濃度下藻粉產(chǎn)量和油脂產(chǎn)量的抑制率僅分別為12.44%和8.49%，當(dāng)質(zhì)量濃度為16 μg/mL 時(shí)藻粉產(chǎn)量和油脂產(chǎn)量的抑制率分別達(dá)到66.31%和75.46%. 由此可見(jiàn)，SD-0701 對(duì)博來(lái)霉素的抗性差，而SD-0702 具有較強(qiáng)抗性，且與博來(lái)霉素濃度相關(guān)，高濃度的博來(lái)霉素對(duì)SD-0702 有顯著抑制作用.

綜合以上結(jié)果，野生型橢圓球藻內(nèi)轉(zhuǎn)入外源基因Gus 確實(shí)能夠影響其對(duì)抗生素的敏感性、生長(zhǎng)速率和代謝物的生成.野生型橢圓球藻對(duì)博來(lái)霉素很敏感，抗性差；轉(zhuǎn)入外源基因Gus 的橢圓球藻對(duì)博來(lái)霉素敏感程度弱，抗性較強(qiáng).相對(duì)于野生型橢圓球藻，轉(zhuǎn)入外源基因Gus 的藻株在低抗生素污染的水體中具有適應(yīng)能力強(qiáng)、生長(zhǎng)情況好以及產(chǎn)油率高的特性，適合在低污染水體中推廣應(yīng)用.另外，本研究也表明博來(lái)霉素可作為篩選培養(yǎng)基，用于識(shí)別小球藻類的抗性基因.