小鼠肺癌模型研究進(jìn)展

胥孜杭 胡潔淼 陳曉 朱詩國

[摘要] 肺癌目前是世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率最高的惡性腫瘤，并且肺也是惡性腫瘤最容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的器官之一。加大肺癌的科研力度勢在必行，建立合適的肺癌動物模型可為肺癌的發(fā)病原因、發(fā)病機制、預(yù)防策略及臨床早期診斷和藥物療效評價等提供研究基礎(chǔ)。其中，又因小鼠是科研中最常使用的實驗動物，故本文旨在介紹目前最常用的各種小鼠肺癌模型，如化學(xué)誘導(dǎo)小鼠模型、轉(zhuǎn)基因小鼠肺癌模型、異位移植小鼠模型、原位移植小鼠模型及小鼠肺轉(zhuǎn)移模型等構(gòu)建方法，以及其在科研領(lǐng)域中的應(yīng)用。分析表明，小鼠肺癌模型不僅需要多學(xué)科的交叉滲透以拓展其研究寬度，而且也需要將各種現(xiàn)有模型進(jìn)行更靈活的運用和更深入的探索，這樣才能有所突破。

[關(guān)鍵詞] 肺癌；小鼠腫瘤模型；應(yīng)用

[中圖分類號] R714.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0063-05

[Abstract] Currently， lung cancer is one of the most common malignant tumors， and it has the highest morbidity and mortality rate all over the world. Besides， lung is also the most prone to distal metastasis organs among a variety of malignant tumors. In this case， it is critical to put more effort in lung cancer research. Aproper animal lung cancer model provides research foundation on etiology， pathogenesis， prevention strategies， the early clinical diagnosis and efficacy evaluation research. Because mice are the most commonly used experimental animals in research， this paper introduced different methods and applications of mouse lung cancer models， such as chemical inducing model， transgenic mouse model， xenograft tumor model， orthotopic tumor model，and tumor metastatic model. According to previous reports， multidisciplinary research， versatility and in-depth exploration should be the focus to achieve breakthroughs in mouse lung cancer models.

[Key words] Lung cancer； Mouse tumor models； Application

世界腫瘤流行病學(xué)研究資料顯示，在我國肺癌的發(fā)病率和死亡率已躍居惡性腫瘤之首[1]。據(jù)《2012中國腫瘤登記年報》顯示，每年新發(fā)腫瘤312萬例，死亡超過200萬例，其中肺癌已取代肝癌，成為中國致死率最高的惡性腫瘤。由于肺毛細(xì)血管十分豐富，位于整個循環(huán)系統(tǒng)的中心環(huán)節(jié)，因此肺又是惡性腫瘤轉(zhuǎn)移最常見的器官，據(jù)頭頸部、乳腺、消化道、腎、睪丸、骨等肺外惡性腫瘤患者尸檢統(tǒng)計，其肺轉(zhuǎn)移比例可達(dá)20%～54%[2]，可見肺轉(zhuǎn)移是多種腫瘤的致死原因。而肺癌療效得不到提高的主要障礙在于其臨床表現(xiàn)復(fù)雜，難以早期發(fā)現(xiàn)，診斷時大部分患者已處于晚期失去有效治療的機會。為制訂出更有效的肺癌治療方法，加強科研力度是大勢所趨，其中模擬出與人類肺癌病因、發(fā)病機制、發(fā)展過程相似的動物模型又是重中之重。在科研實驗動物中，又因小鼠肺組織在形態(tài)、分子特征上與人類肺組織相近，且?guī)缀跞祟愃谢蚨伎梢栽谛∈笊砩险业酵椿騕3-4]；其次，小鼠繁殖周期短、生長快、飼養(yǎng)方便，并且近親繁殖的小鼠腫瘤發(fā)生率高，因此小鼠在腫瘤研究領(lǐng)域中被廣泛使用[5]。本文主要介紹目前最常用的小鼠肺癌模型的制備方法及其應(yīng)用。

1 利用不同的方法建立小鼠肺癌模型

目前常用的肺癌小鼠模型有：化學(xué)誘導(dǎo)模型、異位移植模型、原位移植模型、轉(zhuǎn)基因模型、轉(zhuǎn)移模Z型等，下面對其分別進(jìn)行闡述：

1.1 化學(xué)誘導(dǎo)肺癌模型

化學(xué)誘導(dǎo)模型是指通過使用化學(xué)致癌物，常用的如苯并芘、二乙基亞硝胺、3-甲基膽蒽苯等采用口服、吸入、腹腔注射、支氣管灌注或支氣管黏膜下注射等方法對小鼠進(jìn)行誘癌。在此類模型中，自發(fā)肺腫瘤頻率最高的小鼠品系為A/J，而頻率最低的則為C57BL6/J[6]小鼠。

隨著流行病學(xué)對病因?qū)W調(diào)查資料的積累，化學(xué)誘癌取得了重大發(fā)展，為深入研究腫瘤形成機制提供條件。如建立小鼠被動吸煙模型，使用食物補充維生素E進(jìn)行干預(yù)，發(fā)現(xiàn)維生素E可明顯改善由香煙煙霧提取物所抑制的小鼠胚肺細(xì)胞的增殖活性，及其導(dǎo)致的細(xì)胞DNA損傷、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期發(fā)生改變情況等，還降低了肺腫瘤發(fā)病率，說明維生素E對此模型起到了化學(xué)預(yù)防作用[7]。此外，該模型還適用于中醫(yī)藥的抗肺癌研究，其用時較長的特點剛好符合“慢郎中”的中藥藥性，如使用中藥復(fù)方“陽和湯”連續(xù)給烏拉坦誘導(dǎo)的肺癌小鼠灌胃18周后，結(jié)果顯示在肺癌形成過程中“陽和湯”對超氧化物歧化酶（SOD），過氧化氫酶（CAT）的活性及白細(xì)胞介素-2（IL-2）與腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)有回升作用，并能阻止與癌變相應(yīng)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性及丙二醛（MDA）含量增高，可推遲腫瘤形成時間，降低腫瘤發(fā)生率[8]。該模型雖具有其優(yōu)勢，但也存在一些問題，如成瘤時間長，通常需要數(shù)月，且誘發(fā)的腫瘤一般不能很好地發(fā)生轉(zhuǎn)移。

1.2 轉(zhuǎn)基因肺癌模型

轉(zhuǎn)基因肺癌小鼠模型就是應(yīng)用基因工程技術(shù)，使小鼠體內(nèi)包含有整合在基因組中的克隆DNA序列，使其能夠生產(chǎn)出將遺傳改變傳遞給后代的轉(zhuǎn)基因小鼠，以獲得帶有某種遺傳性疾病的小鼠模型。

有報道指出在小鼠肺腫瘤中有80%檢測出Kras突變[9]。故有研究者[10]利用重組腺病毒載體表達(dá)Cre重組酶誘導(dǎo)K-ras G12D在小鼠肺部表達(dá)，由K-ras G12D引起肺組織腫瘤的發(fā)生，從而建立小鼠肺腺癌模型，該模型可以模擬人類肺癌散發(fā)性特征，能更好地研究肺癌在早期階段的發(fā)生發(fā)展，然而使用腺病毒載體的誘發(fā)方式構(gòu)建模型并不穩(wěn)定，并且使用大量病毒誘發(fā)基因突變?yōu)樗矔r過程，缺少了如間質(zhì)沉積、局部浸潤及轉(zhuǎn)移等腫瘤進(jìn)展期的特征。為了建立慢性自發(fā)肺部腫瘤的小鼠模型，我國有學(xué)者[11]利用SPC-CRE轉(zhuǎn)基因小鼠與LSL K-ras G12D轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，構(gòu)建一種肺組織特異性低表達(dá)Cre重組酶的SPC-CRE轉(zhuǎn)基因小鼠，并對7、9個月齡小鼠腫瘤結(jié)節(jié)進(jìn)行檢測，證實獲得了SPC-CRE-Kras雙陽性轉(zhuǎn)基因小鼠，建立了從肺部炎性反應(yīng)到肺腺瘤進(jìn)展時程較長的慢性自發(fā)肺部腫瘤小鼠模型，為肺癌病因的研究提供了更長的窗口期。

轉(zhuǎn)基因小鼠肺癌模型對各期癌組織病變提供了相對足夠的時間，有利于病因?qū)W及發(fā)病過程的研究，并且該模型能夠條件控制基因的改變，使其在藥物開發(fā)過程中具有獨一無二的優(yōu)勢，如Ohashi等[12]通過肺特異性表達(dá)活性蛋白C的病毒載體（SP-C/SV40），建立表皮生長因子受體特殊位點EG-FRde1748-752轉(zhuǎn)基因小鼠肺癌模型，發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體突變基因的活化可能是引起非小細(xì)胞肺癌對吉非替尼獲得性耐藥的機獨特制。但此模型的局限性在于建模時間難掌握、費用較高，數(shù)量上難以滿足實驗需求，且還要保證轉(zhuǎn)基因的相應(yīng)產(chǎn)物（如異體抗原）不會對與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移相關(guān)的因素及藥物治療效果產(chǎn)生影響，故在實際應(yīng)用上也受到一定限制。

1.3 異位移植模型

異位移植模型可分為皮下移植模型和腎被膜下移植模型，其中皮下移植是對肺癌進(jìn)行實驗研究的首選方法，由于其操作簡單方便，通常只需將腫瘤細(xì)胞懸液或外科手術(shù)中采集的腫瘤組織移植到小鼠的背部、腋部、后肢等即可。曹慧慧等[13]將1×107個Lewis肺癌細(xì)胞注射于昆明種小鼠右腋皮下，觀察到模型組小鼠飲食量減少，體重增加緩慢，成瘤率及肺癌形成率均為68.75%，提示使用Lewis肺癌細(xì)胞可以建立昆明種小鼠肺癌模型。又如卓瑩等[14]在國內(nèi)首次利用人新鮮完整肺癌組織塊移植于NOD/SCID小鼠右側(cè)前肢肩背部皮下，或經(jīng)皮肺穿刺取得腫瘤小塊移植于BALB/c裸小鼠腎包膜下。各代移植瘤模型的組織病理學(xué)及免疫組化表型、表皮生長因子受體和K-Ras基因檢測均與來源肺癌組織相一致。其中腎包膜下移植是一種使用較少的移植方法，但由于腎包膜下血供豐富，又相對缺乏免疫防御機能，有利于提高移植腫瘤的成瘤率[15]，故通常利用此方法讓腫瘤成功生長，然后再將腫瘤傳代移植到小鼠皮下或原位進(jìn)行研究。而對于瘤塊移植模型，一般來說原代移植成功率較低，一般需重復(fù)多次方可成功，耗時較長。

皮下移植模型為目前最常用的肺癌動物模型，其在新藥開發(fā)及藥物療效研究中有著舉足輕重的作用，如朱亞芳等[16]在C57BL/6小鼠皮下接種Lewis肺腺癌細(xì)胞，建立小鼠Lewis肺癌移植瘤模型，觀察川芎嗪聯(lián)合順鉑對小鼠Lewis肺癌Mac2-結(jié)合蛋白（Mac2-BP）和血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響。其次，又因皮下移植模型的腫瘤通常都接種于皮膚暴露部位，便于切除，故又有研究者利用此優(yōu)勢研究藥物對肺癌原發(fā)瘤切除后腫瘤轉(zhuǎn)移的影響，如觀察中藥復(fù)方“十全大補湯”對Lewis肺癌小鼠原發(fā)瘤切除后轉(zhuǎn)移瘤的生長及血管生成的作用[17]。雖然皮下移植模型方便實用，但也存在局限性，如受到移植部位特異性的影響，皮下移植瘤的細(xì)胞生長脫離了原組織的微環(huán)境，導(dǎo)致實驗結(jié)果與臨床治療效果差異較大，并且皮下接種模型周期較長，且不易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，或常于未出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時，負(fù)荷的腫瘤就已出現(xiàn)破潰，難以達(dá)到實驗要求等。

1.4 原位移植模型

原位移植的肺癌模型不僅有較高的腫瘤成瘤率，而且能突顯腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移特性，從更大程度上模擬人體肺腫瘤的微環(huán)境，故該模型為目前較為理想的肺癌動物模型，常用的有以下幾種：

1.4.1 支氣管注射模型 Iochmann等[18]將標(biāo)記有99Tcm的錫膠體（以便運用高分辨率影像定位觀測）的肺癌NCI-H209細(xì)胞與Matrigel基質(zhì)膠的混懸液注射進(jìn)小鼠的支氣管內(nèi)，同時還皮下注射相同數(shù)量的細(xì)胞建立皮下模型，待11周后將小鼠全部處死，發(fā)現(xiàn)經(jīng)支氣管注射的模型組小鼠的腫瘤經(jīng)研磨后，其細(xì)胞的增殖活力以及一些微觀特征與實驗前的狀態(tài)幾乎無差別，且該模型的細(xì)支氣管被壓縮，肺泡被侵襲和破壞，在腫瘤中心還可見壞死組織以及大量的巨噬細(xì)胞浸潤，而皮下模型組均未出現(xiàn)這些現(xiàn)象。另有，張賀龍等[19]將肺癌細(xì)胞PC14/PE6及SBC-3/DOX直接注入小鼠氣管以建立細(xì)支氣管內(nèi)的肺癌模型，并于注射后第42天將所有小鼠處死，觀察肺臟表面及解剖面均未發(fā)現(xiàn)腫瘤生長，將肺組織制做成病理切片，經(jīng)HE染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，也未觀察到肺癌細(xì)胞生長，說明模型建立失敗，此提示經(jīng)支氣管注射的肺癌模型較皮下模型而言雖更接近肺癌發(fā)生規(guī)律，但此方法操作困難、成瘤率低，其運用受到較大限制。

1.4.2 肺內(nèi)注射模型 胥孜杭等[20]將穩(wěn)定表達(dá)蟲螢光素酶的Lewis肺腺癌細(xì)胞與Matrigel按1∶1比例混勻后注射于C57 BL/6小鼠左肺，其特點是所需細(xì)胞數(shù)量少，5×104個即可成瘤，成功率達(dá)90%，且無需打開胸腔只需將左腋下皮膚剪一小口，并可利用活體成像技術(shù)監(jiān)測到模型小鼠的腫瘤可轉(zhuǎn)移至對側(cè)胸廓、右肺、雙側(cè)腋下及腹股溝淋巴結(jié)等。隨著肺內(nèi)注射法的技術(shù)越來越成熟，有研究者還構(gòu)建了IDO過表達(dá)的小鼠Lewis肺癌細(xì)胞株，以建立肺癌原位模型，并通過活體成像及生存分析方法，觀察中藥復(fù)方“肺積方”和黃芪甲苷對肺癌小鼠的作用[21]。此外，利用肺內(nèi)注射法還可研究腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特征，如王菲等[22]對比Lewis肺癌細(xì)胞（LLC）及LLC原位接種后獲得的第一代衍生細(xì)胞（R1-LLC）和R1-LLC原位接種后獲得的第二代衍生細(xì)胞（R2-LLC）間的生物學(xué)特性，并比較該三種細(xì)胞在原位移植模型中的侵襲轉(zhuǎn)移能力，發(fā)現(xiàn)這三種細(xì)胞的增殖能力雖無明顯差別，但R2-LLC比R1-LLC及LLC細(xì)胞不論在體外還是體內(nèi)實驗中都具有更強的侵襲及轉(zhuǎn)移能力。

1.4.3 胸腔注射模型 彭鵬等[23]在小鼠腋后線第6肋間胸腔或腋部皮下注射5×106個Lewis肺腺癌細(xì)胞，比較胸腔移植模型與皮下移植模型的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)胸腔模型組小鼠生存期范圍離散程度較皮下模型組?。≒ < 0.05），病程中胸腔模型組小鼠體重下降、攝食減少等惡病質(zhì)體征較皮下模型組明顯（P < 0.01），并且胸腔模型組還在早期就出現(xiàn)了胸水和腫瘤轉(zhuǎn)移，而皮下模型組中未發(fā)現(xiàn)。其中在胸腔移植模型中出現(xiàn)的消瘦、食欲不振、全身臟器不同程度損害等惡病質(zhì)癥狀為腫瘤晚期特征。故有研究者[24]利用該模型觀察中藥復(fù)方“銀草合劑”對荷肺癌小鼠惡病質(zhì)的影響，將肺癌H460細(xì)胞注射于小鼠胸腔內(nèi)，以誘發(fā)惡病質(zhì)，并于植入細(xì)胞后隔天灌服中藥“銀草合劑”，觀察小鼠惡病質(zhì)改善情況。3周后發(fā)現(xiàn)對照組小鼠的攝食量、體重、三酰甘油、血糖、白蛋白皆下降，而在用藥組中則發(fā)現(xiàn)“銀草合劑”具有明顯提升白蛋白的功能（P < 0.05）。

1.5 轉(zhuǎn)移模型

由于腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移是最重要的致死原因之一，而肺又為最常見的轉(zhuǎn)移灶，故構(gòu)建小鼠肺轉(zhuǎn)移模型是解決臨床問題的基礎(chǔ)。

1.5.1 尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型 陳愉生等[25]將1×106個A549細(xì)胞注射入BALB/c小鼠尾靜脈，第5周出現(xiàn)鏡下肺部轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)，第11周開始出現(xiàn)肺部結(jié)構(gòu)大量破壞，彌漫性的腫瘤細(xì)胞及淋巴結(jié)浸潤，病理證實為肺腺癌。通過尾靜脈建立的轉(zhuǎn)移模型可適用于多種腫瘤的轉(zhuǎn)移研究，比如乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移灶就為肺，龔宏霞等[26]用蟲熒光素酶標(biāo)記的小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1（4T1-luc），通過尾靜脈注射建立小鼠乳腺癌實驗性肺轉(zhuǎn)移模型。此外，肺轉(zhuǎn)移也常見于黑色素瘤，張永慈等[27]利用黑色素瘤細(xì)胞M21經(jīng)尾靜脈接種于裸鼠，50 d內(nèi)成瘤率達(dá)100%。除了這兩種肺轉(zhuǎn)移模型外，還有小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞肺轉(zhuǎn)移模型[28]、小鼠骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移模型[29]等，可見通過尾靜脈建立的肺轉(zhuǎn)移模型成功率高，轉(zhuǎn)移特性好，受到大家青睞。此外，該模型還常為新藥開發(fā)提供研究平臺，如涎腺腺樣囊性癌是比較常見的涎腺惡性腫瘤，雖生長緩慢，但易發(fā)生轉(zhuǎn)移，利用小鼠尾靜脈注射人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞（SACC-LM）1×106個/只，建立SACC-LM實驗性肺轉(zhuǎn)移模型，觀察新合成的可口服的精氨酸-天冬氨酸對該模型的作用[30]。雖然尾靜脈注射轉(zhuǎn)移模型已廣泛使用，但仍值得注意的是尾靜脈注射會迫使癌細(xì)胞集中于肺部毛細(xì)血管，使癌細(xì)胞從肺部溢出，導(dǎo)致過早出現(xiàn)轉(zhuǎn)移，這也是其應(yīng)用的局限性所在。

1.5.2 骨髓注射肺轉(zhuǎn)移模型 Cutrera等[31]將5×104個腸癌細(xì)胞CT26注射入Balb/C小鼠右腿脛骨結(jié)節(jié)，經(jīng)22 d后發(fā)現(xiàn)小鼠出現(xiàn)明顯肺部轉(zhuǎn)移，相同數(shù)量的細(xì)胞通過尾靜脈的方法注射進(jìn)入小鼠體內(nèi)也可出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移，但經(jīng)皮下注射2×106個CT26細(xì)胞后卻未出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移情況，說明骨髓注射法所需更少的腫瘤細(xì)胞就可誘導(dǎo)遠(yuǎn)端的肺部轉(zhuǎn)移。根據(jù)Fidler等[32]經(jīng)典理論，腫瘤細(xì)胞的生長到發(fā)生轉(zhuǎn)移，要經(jīng)歷細(xì)胞轉(zhuǎn)化、增殖，毛細(xì)血管新生，細(xì)胞入侵、進(jìn)入血管，形成癌栓，然后經(jīng)過血液循環(huán)至肺，著床，黏附血管，部分從血管溢出至肺實質(zhì)組織，最終形成肺轉(zhuǎn)移瘤等多個步驟，其中尾靜脈注射是將腫瘤細(xì)胞直接注射進(jìn)入血管中，相對于腫瘤的正常生理轉(zhuǎn)移情況來說，缺失了入侵血管前的一系列步驟，而骨髓注射具有入侵前環(huán)節(jié)，故相對來說經(jīng)歷了更完整的轉(zhuǎn)移過程，更接近人類腫瘤發(fā)生肺轉(zhuǎn)移的情況，故此模型可用于肺癌發(fā)病機制的研究，但操作難度較大。

2 結(jié)語與展望

肺癌動物模型是對肺癌進(jìn)行科學(xué)研究的重要手段和平臺，合適的動物模型對肺癌的發(fā)生機制、診斷及治療的研究具有十分重要的意義。而加強對肺癌的防治以降低其發(fā)生率和病死率是一個系統(tǒng)工程，需要預(yù)防醫(yī)學(xué)、影像學(xué)、病理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)等多學(xué)科的交叉滲透。如影像學(xué)在肺癌領(lǐng)域的應(yīng)用，利用相位襯度成像技術(shù)，以微米尺度的空間分辨對從原位接種的肺癌小鼠取出的腫瘤組織進(jìn)行成像，并定量分析，可重建清晰的三維模型，在此模型上還可發(fā)現(xiàn)小腫瘤結(jié)節(jié)的存在，該成果將有助于肺癌的早期診斷[33]。除了多學(xué)科的跨界合作以外，現(xiàn)有的肺癌小鼠模型也可靈活交叉、疊加應(yīng)用，如在轉(zhuǎn)基因小鼠上再利用化學(xué)誘導(dǎo)法建立肺癌模型，不僅可深入了解興趣基因在肺癌中的作用機制還可研究化學(xué)致癌劑的誘癌機制。又如在肺癌研究中使用最多的異位移植模型，如今也有改良版本——腫瘤患者來源的移植瘤（patient-derived xenografts，PDXs）模型，即將各種患者來源的腫瘤組織移植到免疫缺陷或轉(zhuǎn)基因小鼠的恰當(dāng)部位，有研究顯示使用此方法的荷瘤小鼠經(jīng)過四代傳代后，其基因序列還可與原代腫瘤保持一致，說明該模型可更準(zhǔn)確地模擬原發(fā)腫瘤[34]。所以小鼠肺癌模型的研究不僅需要多領(lǐng)域的跨學(xué)科合作以拓展其研究寬度，同時也需要將各種現(xiàn)有模型進(jìn)行更靈活的運用及更深入的探索，這樣才能取得更大更快的突破。

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（收稿日期：2015-12-08 本文編輯：任 念）