高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用測定小鼠血漿中FG—4592濃度及其藥動學(xué)研究

張璇 鄭兆浠 鄭劍斌 李慧 周薇

[摘要] 目的 建立LC-MS/MS法檢測小鼠血漿內(nèi)FG-4592的濃度，研究FG-4592在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)。 方法 KM小鼠腹腔注射FG-4592 5 mg/kg，不同時間點采集血漿，樣品經(jīng)甲醇沉淀。選用Agilent Zorbax SB-Aq-C18色譜柱（2.1 mm× 100 mm，3.5 μm），柱溫25℃，流動相為甲醇-水（含5 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸）（90∶10），流速0.35 mL/min。采用ESI離子源，正離子模式多反應(yīng)監(jiān)測，離子通道分別為m/z 353.1→ m/z 278.1（FG-4592）和m/z 294.9→m/z 235.0（內(nèi)標(biāo)物）。 結(jié)果 測定血漿中FG-4592的線性范圍為1～1000 ng/mL，日內(nèi)及日間精密度均<10%，準(zhǔn)確度在90%～105%范圍內(nèi)，方法學(xué)考察均符合生物樣品的分析要求。藥代動力學(xué)參數(shù)：Cmax為（22.80±0.36）μg/mL，AUC（0-72）為（31.64±0.97）（μg·h）/mL，t1/2為8.81 h。 結(jié)論 本研究建立的FG-4592血藥濃度測定方法可行，該藥物在血液中吸收良好，測定結(jié)果可為藥物的基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] FG-4592；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用；藥代動力學(xué)

[中圖分類號] R969.1 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-7210（2016）03（c）-0014-05

[Abstract] Objective To develop a LC-MS/MS method for the quantitative analysis of FG-4592 in mice plasma and to study the pharmacokinetic profile of FG-4592 with this method. Methods KM mice were intraperitoneally administered 5 mg/kg FG-4592. The plasma samples were collected at different time points and precipitated by methanol. An Agilent Zorbax C18 （2.1 mm×100 mm， 3.5 μm） chromatographic column with the column temperature of 25℃ was used. The mobile phase consisted of methanol-water （contained 5 mmol/L ammonium formate and 0.1 % formic acid） （90∶10）. The flow rate of mobile phase was 0.35 mL/min. The analyte was monitored by positive electrospray ionization （ESI） in multiple reaction monitoring mode. The mass transition pairs was m/z 353.1→ m/z 278.1 （FG-4592） and m/z 294.9→ m/z 235.0 （internal standard） respectively. Results The calibration curve was established in concentration range of 1-1000 ng/mL. The intra-and inter-day RSDs were both less than 10%. The method recoveries were within 90%-105% and met for the requirements of biological sample analysis. The pharmacokinetic parameters were as follows： Cmax was （22.80±0.36） μg/mL， AUC（0-72） was （31.64±0.97） （μg·h）/mL， t1/2 was 8.81 h. Conclusion This method is reliable. FG-4592 is well absorbed in mice blood and the results can provide the basis for fundamental research.

[Key words] FG-4592； LC-MS/MS； Pharmacokinetic

Roxadustat（FG-4592）是一種脯氨酸羥化酶（PHD）的小分子抑制劑，屬于4-羥基異喹啉類衍生物[1]，目前正處于治療慢性腎病患者貧血癥狀的三期臨床試驗階段。2013年阿斯利康與FibroGen公司合作，計劃使FG-4592于2017年上市，彌補(bǔ)現(xiàn)有紅細(xì)胞生成刺激劑（ESA）治療貧血癥狀的不足[2-3]。FG-4592 通過抑制PHD穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子調(diào)控下游相關(guān)靶基因，主要參與血管生成、葡萄糖代謝、細(xì)胞遷移和胞外基質(zhì)重塑等生理生化過程[4-7]。

最新研究表明長期給予PHD抑制劑可以提高健康小鼠的認(rèn)知功能，增強(qiáng)突觸可塑性[8]。FG-4497可減輕缺血性中風(fēng)小鼠的腦組織損傷和水腫癥狀，具有神經(jīng)保護(hù)作用[9]，為有效治療中風(fēng)帶來新的希望[10-11]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)癡呆小鼠模型中，F(xiàn)G-4592具有顯著的癥狀改善作用，為進(jìn)一步研究該藥物癥狀改善機(jī)制，亟需了解FG-4592在小鼠體內(nèi)的藥代動力學(xué)情況，以便優(yōu)化日后的實驗設(shè)計安排，為后續(xù)的研究工作提供依據(jù)。因此，建立一種可快速、靈敏地檢測小鼠體內(nèi)FG-4592濃度的方法必不可少。本研究采用LC-MS/MS法測定小鼠血漿中FG-4592的藥物濃度，并將此方法應(yīng)用到藥代動力學(xué)研究中。

1 儀器與試藥

1.1 藥品與試劑

FG-4592（美國Selleck Chemical，批號：S100703，純度99.39%）；內(nèi)標(biāo)物（IS）由西北大學(xué)費因伯格醫(yī)學(xué)院鄭劍斌博士合成，純度98%以上，是合成FG-4592的中間產(chǎn)物。甲酸、甲醇（美國Tedia公司）均為色譜純，水為實驗室自制，其他試劑均為化學(xué)純。

1.2 實驗儀器

Agilent 6410質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技公司），配有ESI-電噴霧離子源，MassHunter數(shù)據(jù)采集處理工作站；Agilent 1200液相色譜系統(tǒng)（美國安捷倫科技公司），配有G1311A四元梯度泵，G1322A在線真空脫氣機(jī)，G1329A自動進(jìn)樣器，G1316A柱溫箱；XS 105dual range分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；-80℃冰箱（美國Thermo Fisher scientific公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國Sigma公司）；渦旋振蕩器（美國Scientific industries公司）。

1.3 實驗動物

6周齡健康昆明小鼠，雌雄各半，體重20～25 g，許可證號：SCXK（滬）2004-0001，由上海交大醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。本實驗由上海交大醫(yī)學(xué)院實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定條件

2.1.1 色譜條件 選用Zorbax SB-Aq-C18 column（2.1 mm×100 mm，3.5 μm；Agilent Technologies，美國）色譜柱，流動相為甲醇與水（內(nèi)含5 mmol/L甲酸銨，0.1%甲酸）混合，比例為90∶10。柱溫25℃，流速0.35 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。

2.1.2 質(zhì)譜條件 電噴霧離子源，采用正離子模式掃描；離子源電壓4 kV；干燥氣流速為8 L/min，噴霧氣壓力為25 psi，干燥氣溫度350℃。多反應(yīng)監(jiān)測的各參數(shù)見表1。FG-4592及IS化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1。

2.2 溶液的配制

2.2.1 FG-4592小鼠給藥溶液的配制 精密稱取適量FG-4592，以丙二醇∶PBS=15∶85作溶劑配制5 mg/mL溶液，臨用前用PBS稀釋1/10，給藥劑量5 mg/kg。

2.2.2 FG-4592標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)IS溶液的配制 精密稱取FG-4592和IS各1 mg，用甲醇（含0.1%甲酸）分別溶解，制得1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3 血漿樣品的處理

2.3.1 空白血漿樣品的制備 在小鼠清醒狀態(tài)下臉頰刺血約0.1 mL至包被肝素的EP管中，4℃ 4000 r/min離心10 min，吸取上清加入0.1%甲酸，-80℃保存。

2.3.2 樣品的處理與測定 取空白血漿或稀釋后的血漿樣品45 μL，加入甲醇（含0.1%甲酸）或FG-4592標(biāo)準(zhǔn)液5 μL混勻后，用200 μL含IS 20 ng/mL的甲醇（含0.1%甲酸）溶液沉淀蛋白，渦旋，14 000 r/min離心5 min，取上清150 μL于進(jìn)樣小瓶中，進(jìn)樣量5 μL。

2.4 專屬性實驗

取小鼠空白血漿45 μL，加入5 μL甲醇溶液，按“2.3.2”項下方法操作，得空白血漿的色譜圖（圖2a）。將5 μL 1000 ng/mL FG-4592溶液加入45 μL空白血漿中，按“2.3.2”項下方法操作得色譜圖（圖2c）。小鼠腹腔注射5 mg/kg FG-4592 10 min后的血漿處理進(jìn)樣，得色譜圖（圖2d）。結(jié)果表明FG-4592和IS的保留時間分別為1.2、1.1 min，二者出峰附近無雜質(zhì)峰干擾，峰形良好，說明方法有較高的特異性。

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

用甲醇稀釋1 mg/mL FG-4592標(biāo)準(zhǔn)液得到10、50、100、500、1000、5000、10000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取45 μL空白血漿中加入5 μL上述不同濃度的FG-4592標(biāo)準(zhǔn)品溶液，得到終濃度分別為1、5、10、50、100、500、1000 ng/mL的系列樣品，按“2.3.2”項下方法操作。以樣品藥物濃度（X）與樣品峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積之比（Y）進(jìn)行回歸，得到回歸方程Y=0.020 625X-0.017 767，r=0.999，結(jié)果顯示血漿藥物濃度在1～1000 ng/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，定量下限為1 ng/mL。見圖2b。

2.6 精密度與準(zhǔn)確度試驗

用甲醇稀釋1 mg/mL FG-4592標(biāo)準(zhǔn)液得到25、1000、7500 ng/mL的溶液，取45 μL空白血漿中加入5 μL上述溶液，配制成濃度分別為2.5、100、750 ng/mL的FG-4592質(zhì)控樣品，按“2.3.2”項下方法操作。每個濃度平行做5份，連續(xù)測定3 d。統(tǒng)計日內(nèi)、日間精密度和方法回收率。3種濃度質(zhì)控樣品的日內(nèi)、日間RSD值均≤2.09%，方法回收率在97.43% ～100.24%之間，精密度和準(zhǔn)確度均滿足生物樣品分析要求。見表2。

2.7 提取回收率與基質(zhì)性考察

FG-4592質(zhì)控樣品按“2.3.2”項下方法操作，進(jìn)樣得峰面積A1；45 μL空白血漿加入200 μL甲醇沉淀蛋白，渦旋，14 000 r/min離心5 min，原管分別加入25、1000、7 500 ng/mL的FG-4592溶液5 μL，混勻離心后取上清進(jìn)樣，得峰面積A2；三蒸水45 μL加入200 μL甲醇，渦旋后分別加入25、1000、7500 ng/mL的FG-4592溶液5 μL，混勻后14 000 r/min離心5 min，取上清進(jìn)樣，得峰面積A3。每個濃度平行做5份。以A1/A2×100%計算得FG-4592的提取回收率，以A2/A3×100%計算得到基質(zhì)效應(yīng)。低、中、高濃度質(zhì)控樣品的提取回收率均>95%，基質(zhì)效應(yīng)在94% ～100%范圍內(nèi)，符合生物樣品的分析要求。見表3。

2.8 穩(wěn)定性考察及稀釋實驗

取FG-4592質(zhì)控樣品分別考察室溫放置4 h、處理后樣品進(jìn)樣器內(nèi)放置6 h、反復(fù)凍融3次、-80℃冰箱保存2周的穩(wěn)定性，每個濃度檢測3份樣品，結(jié)果表明以上各條件下測定濃度與實際濃度的相對誤差均在15%內(nèi)，表明在此放置條件下FG-4592較穩(wěn)定?？瞻籽獫{稀釋FG-4592標(biāo)準(zhǔn)液得25 μg/mL的血漿樣品，再用空白血漿稀釋20倍，按“2.3.2”項下方法操作，結(jié)果稀釋后測得藥物濃度的RSD<5%，RE<10%，表明此方法可應(yīng)用于高于標(biāo)準(zhǔn)濃度的FG-4592血漿樣品分析中。

2.9 小鼠體內(nèi)藥代動力學(xué)

小鼠隨機(jī)分為每個時間點6～8只，給藥前12 h禁食，腹腔注射5 mg/kg FG-4592后于0.08、0.17、0.33、0.5、0.67、1、1.5、2、3、5、8、12、24、48、72 h分別臉頰刺血約0.1 mL，4℃下4000 r/min離心10 min，取上清加入0.1%甲酸。用空白血漿稀釋20倍后，樣品按“2.3.2”項下方法操作，計算各時間點的藥物濃度，繪制血藥濃度-時間曲線（圖3）。結(jié)果血藥濃度數(shù)據(jù)符合非房室模型，以WinNolin（Version 6.3）軟件進(jìn)行擬合，得藥代動力學(xué)參數(shù)：達(dá)峰時間（tmax）為0.17 h，達(dá)峰濃度（Cmax）為（22.80±0.36）μg/mL，半衰期（t1/2）為8.81 h，AUC（0-72）為（31.64±0.97）（μg·h）/mL，清除率為157.81 mL/（h·kg）。見圖3。

3 討論

本文建立了一個靈敏、簡便、快速的LC-MS/MS方法，對小鼠血漿中FG-4592的濃度進(jìn)行檢測，并針對藥代動力學(xué)特征進(jìn)行了考察。

FG-4592以正離子模式進(jìn)行全掃描，確定母離子及定量子離子。選用FG-4592的合成中間產(chǎn)物作為內(nèi)標(biāo)，該中間產(chǎn)物保留了FG-4592的酰胺鍵，結(jié)構(gòu)與其相似，質(zhì)譜特征相近，并且與FG-4592的出峰互不干擾，因此是理想的內(nèi)標(biāo)[12]。本方法采用4倍體積甲醇沉淀蛋白，充分稀釋基質(zhì)，最低定量限的信噪比仍可達(dá)到15，滿足定量分析要求。同時，蛋白沉淀這種方法更易實現(xiàn)高通量[13-15]，每批樣品（24個）處理不超過30 min。綜上，本實驗建立的LC-MS/MS法可專一靈敏的檢測小鼠血漿內(nèi)FG-4592的濃度，樣品處理方法簡單，可有效地運用到藥代動力學(xué)的研究中。

對藥動學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G-4592在小鼠的血漿中半衰期較短，如需長期給藥，需每日2～3次，藥物在血漿中達(dá)峰較快，AUC較大，說明此藥物在小鼠體內(nèi)吸收快且吸收量大。若將該藥物運用到治療癡呆的小鼠模型中，仍需關(guān)注腹腔給藥后外周血漿和中樞腦內(nèi)的濃度比值，如外周濃度較高，則需注意在治療癡呆的治療劑量時，外周有無副作用發(fā)生[16-18]，后期將進(jìn)一步考察小鼠的腦藥濃度并對給藥方式進(jìn)行改良。清除率157.81 mL/（h·kg），給藥72 h后血漿中幾乎檢測不到藥物的存在，表明需要在后期實驗中對藥物的有效濃度和停藥后的藥效做進(jìn)一步研究[19-26]，為以后的臨床研究打下扎實的基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2015-11-01 本文編輯：趙魯楓）