宮頸鱗癌組織中血管生成擬態(tài)與HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達變化及意義

陳瑜，李爭，王振國

(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2中國人民解放軍第309醫(yī)院)

?

宮頸鱗癌組織中血管生成擬態(tài)與HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達變化及意義

陳瑜1，李爭1，王振國2

(1河北北方學(xué)院，河北張家口075000；2中國人民解放軍第309醫(yī)院)

目的觀察宮頸鱗癌(CSCC)組織中血管生成擬態(tài)(VM)與缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白(E-cadherin和Vimentin)的表達，并探討其臨床意義。方法 收集CSCC組織標(biāo)本43例(CSCC組)和正常宮頸組織切片20例(對照組)，以HE、CD34-PAS雙重染色檢測VM情況，免疫組化法檢測HIF-1α、E-cadherin、Vimentin，分析各指標(biāo)間及其與臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果 CSCC組16例存在VM，對照組無VM，P<0.05；CSCC組HIF-1α、E-cadherin、Vimentin陽性表達率分別為60.5%、37.2%、32.6%，對照組分別為20.0%、100%、0，P均<0.05。VM與CSCC分化程度、臨床分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓形成有關(guān)，HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達均與病理分級有關(guān)，Vimentin表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓形成有關(guān)，HIF-1α表達與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑有關(guān)，P均<0.05。CSCC組織中VM與HIF-1α、Vimentin表達呈正相關(guān)(r=0.426、0.697，P均<0.05)，與E-cadherin表達呈負相關(guān)(r=-0.394，P<0.05)；HIF-1α與E-cadherin表達呈負相關(guān)(r=-0.362，P<0.05)，與Vimentin表達呈正相關(guān)(r=0.359，P<0.05)；E-cadherin與Vimentin表達呈負相關(guān)(r=-0.330，P<0.05)。同一標(biāo)本表達定位觀察，發(fā)現(xiàn)存在VM者有56.2%(9/16)HIF-1α陽性時伴隨E-cadherin陰性表達、Vimentin陽性表達，無VM者HIF-1α陽性時不存在(0/27)這樣的對應(yīng)關(guān)系，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.959,P<0.05)。結(jié)論 VM、HIF-1α、E-cadherin和Vimentin的表達與CSCC的侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)；高侵襲性CSCC中HIF-1α可能通過下調(diào)E-cadherin、上調(diào)Vimentin的表達誘導(dǎo)EMT，促進VM的形成。

血管生成擬態(tài)；缺氧誘導(dǎo)因子1α；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化；E-鈣黏蛋白；波形蛋白；宮頸鱗癌

子宮頸癌是目前全球女性第三大常見惡性腫瘤[1]，其主要病理類型為鱗癌。眾所周知，腫瘤的生長具有血管依賴性，但抗血管治療效果又具局限性[2]，因此尋找新的抗癌靶標(biāo)顯得十分重要。近年來，血管生成擬態(tài)(VM)作為腫瘤功能性微循環(huán)中傳統(tǒng)內(nèi)皮血管外的補充在惡性腫瘤中的研究越來越多，與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF-1α)、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在VM形成及腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用[4]。本研究檢測了VM、HIF-1α及EMT相關(guān)蛋白[E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)]在宮頸鱗癌(CSCC)組織中的表達，并分析各指標(biāo)之間及其與CSCC臨床病理特征的關(guān)系，為CSCC的研究提供新思路。

1　資料與方法

1.1臨床資料收集中國人民解放軍第309醫(yī)院2011年8月～2015年3月行手術(shù)切除的CSCC患者43例(CSCC組)，術(shù)前未行化療、放療及免疫治療等腫瘤特異性治療，術(shù)中取腫瘤組織制作石蠟標(biāo)本?；颊吣挲g25～77歲，其中≥50歲18例、<50歲25例；腫瘤直徑>4 cm 11例，≤4 cm 32例；臨床分期：Ⅰa～Ⅰb期27例，Ⅱa～Ⅱb期16例；組織學(xué)分級：低分化23例，中、高分化20例；伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移11例，有脈管癌栓形成29例。另取同期子宮肌瘤患者手術(shù)切除的正常宮頸組織標(biāo)本20例作為對照組。

1.2檢測方法

1.2.1VM采用HE、CD34-PAS雙重染色法。首先進行CD34免疫組織化學(xué)染色，于DAB顯色后顯微鏡下觀察；待血管內(nèi)皮細胞著色后，流水沖洗1 min，終止顯色反應(yīng)，蒸餾水水洗3遍。滴加PAS試劑盒試劑Ⅰ 0.5%高碘酸溶液1滴，染色10 min，流水沖洗1 min，蒸餾水水洗3遍；滴加試劑Ⅱ Schiff液1滴，閉光濕盒37 ℃恒溫反應(yīng)15 min(目測組織變紅)終止，流水沖洗1 min。蘇木素復(fù)染、分化、返藍、脫水、透明、封片等步驟同常規(guī)染色。 VM的判定：CD34陽性顆粒表達于血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)(膜)，PAS陽性表達于血管或類血管腔壁的基膜，呈紫紅色或櫻桃紅色。由CD34陰性的腫瘤細胞(HE光鏡下確認(rèn))圍成的內(nèi)有一層PAS陽性基膜樣物質(zhì)的不規(guī)則血管樣結(jié)構(gòu)，有時其內(nèi)可見紅細胞，管道周圍無出血、壞死及明顯的炎細胞，判定為VM。

1.2.2HIF-1α、Vimentin及E-cadherin采用免疫組化PV-6000兩步染色法。HIF-1α抗體工作濃度為1∶100，Vimentin及E-cadherin抗體為即用型單抗。將石蠟組織3 μm厚連續(xù)切片，常規(guī)脫蠟、水化；高壓熱修復(fù)后自然冷卻，以3%H2O2作用14 min，PBS沖洗2 min×3次；5%正常山羊血清封閉20 min；滴加一抗，4 ℃過夜或37 ℃溫箱孵育75 min，PBS沖洗2 min×3次；滴加二抗，37 ℃溫箱孵育20 min，PBS沖洗2 min×3次；DAB顯色，蘇木素復(fù)染、鹽酸乙醇分化、氨水返藍、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。用已知陽性片作陽性對照，PBS代替一抗作陰性對照。HIF-1α、E-cadherin和Vimentin蛋白陽性顆粒分別表達于細胞核(質(zhì))、細胞膜(質(zhì))、細胞質(zhì)，結(jié)果由2名病理醫(yī)師雙盲閱片?？偡e分=染色強度積分×陽性細胞比例積分。染色強度無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計為0、1、2、3分，陽性細胞數(shù)百分?jǐn)?shù)0、>0～10%、>10%～50%、>50%～80%、>80%分別計為0、1、2、3、4分。兩項得分相乘0～3為陰性，>3為陽性。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或校正χ2檢驗及Fisher確切概率法，相關(guān)性檢驗采用Spearman相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1兩組VM存在情況及HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達比較見表1。

表1　　　　兩組VM存在情況及HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達比較(例)

2.2VM存在情況及HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達與CSCC臨床病理特征的關(guān)系見表2。

表2　VM存在情況及HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達與CSCC臨床病理特征的關(guān)系[例(%)]

2.3CSCC組織中VM、HIF-1α、E-cadherin、Vimentin表達的關(guān)系CSCC組織中VM與HIF-1α、Vimentin表達呈正相關(guān)(r=0.426、0.697，P均<0.05)，與E-cadherin表達呈負相關(guān)(r=-0.394，P<0.05)；HIF-1α表達與E-cadherin表達呈負相關(guān)(r=-0.362，P<0.05)，與Vimentin表達呈正相關(guān)(r=0.359，P<0.05)；E-cadherin與Vimentin表達呈負相關(guān)(r=-0.330，P<0.05)。同一標(biāo)本的表達定位觀察發(fā)現(xiàn)，VM陽性患者中有56.2%(9/16)HIF-1α陽性時伴隨著E-cadherin陰性表達、Vimentin陽性表達，VM陰性患者HIF-1α陽性時不存在(0/27)這樣的對應(yīng)關(guān)系，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=15.959,P<0.05)。

3　討論

VM與傳統(tǒng)的內(nèi)皮血管不同，它不是由內(nèi)皮細胞、而是由腫瘤細胞通過自身塑形及細胞外基質(zhì)重塑圍成的能夠運輸血液的類血管樣管道，且與周圍血管相連通，是功能性微循環(huán)的一部分[5]。在體外3 D培養(yǎng)，細胞形成互相連接的環(huán)狀或網(wǎng)格狀結(jié)構(gòu)[6]。研究報道，在多種具有高侵襲性的腫瘤中均存在VM，且存在VM的腫瘤細胞遷移侵襲能力更強，患者預(yù)后更差[7]。本研究結(jié)果顯示，CSCC組出現(xiàn)VM的頻率高于對照組，在低分化、Ⅱ期CSCC患者癌組織中的頻率高于中高分化、Ⅰ期患者，且隨著脈管癌栓的轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移而增高。其原因可能為高侵襲性CSCC中VM的管道僅為連接比較松散的腫瘤細胞和一層基膜，缺乏內(nèi)皮細胞的屏障保護，使腫瘤細胞更容易脫落進入血液循環(huán)而發(fā)生轉(zhuǎn)移；此外，形成VM的高侵襲性細胞通常具有多能胚胎樣干細胞基因型，推斷該種細胞形成VM的能力可能是其胚胎樣表型的多能表現(xiàn)之一，其多能表型特征保障了腫瘤細胞的重塑、灌注、細胞活力和傳播等機制[8]。

腫瘤難以調(diào)控的快速生長很容易造成其周圍微環(huán)境的缺氧狀態(tài)，HIF-1為腫瘤應(yīng)對缺氧反應(yīng)的重要因子，其亞單位HIF-1α更是直接受氧分壓調(diào)節(jié)，可作為組織缺氧的內(nèi)在標(biāo)志。HIF-1α可靶向調(diào)控VEGF、GLUT1、碳酸酐酶Ⅸ等基因的轉(zhuǎn)錄過程，從而誘發(fā)腫瘤血管生成及糖酵解的耗能方式，使其更能適應(yīng)低氧低能的環(huán)境[9]，并能提高細胞抗凋亡、放療抵抗的能力[10]。本研究中，CSCC組HIF-1α表達明顯高于對照組，且隨著CSCC腫瘤病理分級的提高、體積的增大、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移其陽性率也呈現(xiàn)出升高態(tài)勢(P均<0.05)?？赡芤蚰[瘤惡性程度越高，其組織細胞分裂能力越強，生長越快，腫瘤體積也就越大，從而使腫瘤更易處于膨脹壓力較高及缺氧的微環(huán)境，誘導(dǎo)HIF-1α的表達增高，使其在低氧環(huán)境中具有更強的生存力及轉(zhuǎn)移能力。有研究報道，HIF-1α可通過VEGF激發(fā)的VE-cadherin/EphA2/PI3K/MMPs/Laminin-5γ2關(guān)鍵通路促進VM的形成[11]。在我們的研究中，VM與HIF-1α表達呈正相關(guān)關(guān)系，也恰恰支持了CSCC組織中HIF-1α可能促進VM形成這一微觀機制。

EMT，即上皮細胞向間質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的多步驟過程，其中以上皮表型E-cadherin的丟失以及間質(zhì)表型Vimentin的獲得最為典型，可作為EMT過程的標(biāo)志蛋白[12]。E-cadherin表達于上皮細胞的胞膜，與β-actin形成復(fù)合體增強細胞的黏附功能；Vimentin是典型表達于間質(zhì)細胞的中間絲狀體蛋白，可動員細胞游走。大量研究表明，E-cadherin的丟失以及Vimentin的獲得使得腫瘤細胞失去極性，細胞間連接變得松散，細胞的運動遷徙、侵襲能力增強[13]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，E-cadherin主要表達于正常宮頸組織及分化程度較高的CSCC胞膜，CSCC伴淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者其陽性率降低；而Vimentin則不表達于正常宮頸上皮，其往往表達于分化程度較低的腫瘤細胞的胞質(zhì)，相反隨著淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管癌栓轉(zhuǎn)移其陽性率增高；且二者在CSCC組織中的表達呈負相關(guān)。推測，CSCC可能發(fā)生了一定程度的伴隨E-cadherin下調(diào)、Vimentin上調(diào)的EMT，促進其侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進展。另外，有報道EMT在促進VM的形成過程發(fā)揮重要作用[14]，本結(jié)果中VM與EMT標(biāo)志蛋白E-cadherin、Vimentin的表達具有負、正相關(guān)性與之相符，推測CSCC中可能也存在這一進展機制。

更有研究發(fā)現(xiàn)，缺氧及缺氧導(dǎo)致的HIF-1α可通過誘導(dǎo)腫瘤中伴隨E-cadherin下調(diào)、Vimentin上調(diào)的EMT過程，促進VM的形成，促進腫瘤的侵襲和遷移[15]。我們的研究結(jié)果中， VM、HIF-1α及EMT標(biāo)志蛋白(E-cadherin和Vimentin)表達分別相關(guān)，其表達均隨著分化程度的降低、淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移而發(fā)生相應(yīng)變化；加之同一標(biāo)本的表達定位觀察發(fā)現(xiàn)，VM陽性患者有56.2%HIF-1α陽性時伴隨著E-cadherin陰性表達、Vimentin陽性表達，VM陰性者HIF-1α陽性時不存在這樣的對應(yīng)關(guān)系。推斷CSCC中可能也存在上述機制，協(xié)同促進其侵襲轉(zhuǎn)移。另外，我們還發(fā)現(xiàn)HIF-1α在CSCC組織的陽性率較高為60.5%，而VM、E-cadherin、Vimentin陽性率分別為37.2%、37.2%、32.6%。結(jié)合相關(guān)文獻[16,17]推斷，腫瘤快速生長形成的缺氧微環(huán)境可能刺激大量鱗癌細胞HIF-1α過表達，但僅部分具有多能胚胎樣干細胞基因型的細胞通過過表達的HIF-1α調(diào)控EMT的發(fā)生，進而使腫瘤細胞去分化為腫瘤干細胞樣細胞，然后模仿內(nèi)皮細胞樣形態(tài)，其間伴隨著一系列復(fù)雜的變化，最終連通于宿主血管形成VM，促進腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移等惡性進展的出現(xiàn)。

總之，VM、HIF-1α及EMT均在CSCC的發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移過程發(fā)揮重要作用，其聯(lián)合檢測對高度侵襲性、高度惡性CSCC的診斷具有一定的指導(dǎo)意義。HIF-1α可能通過下調(diào)E-cadherin、上調(diào)Vimentin誘導(dǎo)EMT，促進VM的形成，可能成為CSCC治療中配合抑制血管生成的新靶標(biāo)，但其具體機制十分復(fù)雜且相互交鎖，仍待更進一步研究。

[1] Jemal A, Bray F, Center MM, et al. Global cancer statistics[J]. CA Cancer J Clin, 2011,61(2):69-90.

[2] Zhang D, Sun B, Zhao X, et al. Twist1 expression induced by sunitinib accelerates tumor cell vasculogenic mimicry by increasing the population of CD133+cells in triple-negative breast cancer[J]. Mol Cancer, 2014,13:207.

[3] Lin P, Wang W, Sun BC, et al. Vasculogenic mimicry is a key prognostic factor for laryngeal squamous cell carcinoma: a new pattern of blood supply[J]. Chin Med J (Engl), 2012,125(19):3445-3449.

[4] Wang W, Lin P, Sun B, et al. Epithelial-mesenchymal transition regulated by EphA2 contributes to vasculogenic mimicry formation of head and neck squamous cell carcinoma[J]. Biomed Res Int, 2014,2014:803914.

[5] Fan YL, Zheng M, Tang YL, et al. A new perspective of vasculogenic mimicry: EMT and cancer stem cells[J]. Oncol Lett, 2013,6(5):1174-1180.

[6] Wan HY, Li QQ, Zhang Y, et al. MiR-124 represses vasculogenic mimicry and cell motility by targeting amotL1 in cervical cancer cells[J]. Cancer Lett, 2014,355(1):148-158.

[7] 鄭旭, 孫保存, 趙秀蘭, 等. 肺肉瘤樣癌中血管生成擬態(tài)的形成及其與上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系[J]. 中國腫瘤臨床,2013,40(8):431-435.

[8] Maniotis AJ, Folberg R, Hess A, et al. Vascular channel formation by human melanoma cells in vivo and in vitro: vasculogenic mimicry[J]. Am J Pathol, 1999,155(3):739-752.

[9] Mayer A, Hockel M, Schlischewsky N, et al. Lacking hypoxia-mediated downregulation of E-cadherin in cancers of the uterine cervix[J]. Br J Cancer, 2013,108(2):402-408.

[10] Fu Z, Chen D, Cheng H, et al. Hypoxia-inducible factor-1a protects cervical carcinoma cells from apoptosis induced by radiation via modulation of vascular endothelial growth factor and p53 under hypoxia[J]. Med Sci Monit, 2015,21(42):318-325.

[11] Paulis YW, Soetekouw PM, Verheul HM, et al. Signalling pathways in vasculogenic mimicry[J]. Biochim Biophys Acta, 2010,1806(1):18-28.

[12] Liu Z, Sun B, Qi L, et al. Zinc finger E-box binding homeobox 1 promotes vasculogenic mimicry in colorectal cancer through induction of epithelial-to-mesenchymal transition[J]. Cancer Sci, 2012,103(4):813-820.

[13] Qureshi R, Arora H, Rizvi MA. EMT in cervical cancer: Its role in tumour progression and response to therapy[J]. Cancer Let, 2015,356(2):321-331.

[14] Ma JL, Han SX, Zhu Q, et al. Role of Twist in vasculogenic mimicry formation in hypoxic hepatocellular carcinoma cells in vitro[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2011,408(4):686-691.

[15] Hendrix MJ, Seftor EA, Hess AR, et al. Vasculogenic mimicry and tumour-cell plasticity: lessons from melanoma[J]. Nat Rev Cancer, 2003,3(6):411-421.

[16] Du J, Sun B, Zhao X, et al. Hypoxia promotes vasculogenic mimicry formation by inducing epithelial-mesenchymal transition in ovarian carcinoma[J]. Gynecol Oncol, 2014,133(3):575-583.

[17] Sun D, Sun B, Liu T, et al. Slug promoted vasculogenic mimicry in hepatocellular carcinoma[J]. J Cell Mol Med, 2013,17(8):1038-1047.

王振國(E-mail: guozhen1963@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.025

R737.33

B

1002-266X(2016)34-0065-04

2016-05-13)