腦死亡狀態(tài)豬血清炎性介質(zhì)水平與肝臟早期損傷的關(guān)系

趙靜雯，唐纓，牛寧寧，于慧敏，劉洋

(天津市第一中心醫(yī)院，天津300192)

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·基礎(chǔ)研究·

腦死亡狀態(tài)豬血清炎性介質(zhì)水平與肝臟早期損傷的關(guān)系

趙靜雯，唐纓，牛寧寧，于慧敏，劉洋

(天津市第一中心醫(yī)院，天津300192)

目的探討巴馬小型豬在腦死亡狀態(tài)下血清炎性介質(zhì)水平與肝臟早期損傷的關(guān)系。方法 采用顱內(nèi)漸進(jìn)加壓法建立豬腦死亡模型6只，分別于腦死亡前及腦死亡后0、3、6、9 h取血，ELISA法檢測(cè)血清炎性介質(zhì)IL-1β、IL-6、TNF-α；同時(shí)穿刺取肝組織，電鏡下行肝組織損傷評(píng)分。結(jié)果豬血清IL-6水平自腦死亡0 h開(kāi)始升高，9 h與腦死亡前比較差異顯著(P<0.01)；而血清IL-1β和TNF-α水平在腦死亡前后及腦死亡后各時(shí)點(diǎn)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)。隨腦死亡時(shí)間延長(zhǎng)，電鏡下豬肝組織逐漸出現(xiàn)不可逆性損傷，腦死亡后9 h較腦死亡前及腦死亡后0 h肝組織損傷評(píng)分升高(P=0.007、0.035)。腦死亡豬血清IL-6水平與電鏡肝組織損傷評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.702，P=0.000)。結(jié)論豬血清炎性介質(zhì)IL-6水平隨著腦死亡時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，與腦死亡狀態(tài)下肝臟的早期損傷可能有關(guān)。

肝臟移植；腦死亡；供體；炎性介質(zhì)；肝臟損傷；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

腦死亡供體已成為肝臟移植的主要供體來(lái)源[1]，但由于腦死亡狀態(tài)復(fù)雜的血流動(dòng)力學(xué)改變、內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂和代謝功能障礙等因素，嚴(yán)重影響供體肝臟的質(zhì)量[2]。有研究表明，腦死亡缺血缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致劇烈的氧化應(yīng)激反應(yīng)?；罨蟮募?xì)胞分泌IL-1β、IL-6及TNF-α等多種炎性介質(zhì)，參與機(jī)體的免疫應(yīng)答[3]。2015年9月～2016年3月，我們檢測(cè)了豬腦死亡不同時(shí)點(diǎn)的血清IL-1β、Il-6及TNF-α，探討腦死亡過(guò)程中炎性介質(zhì)變化與肝組織超微結(jié)構(gòu)改變的關(guān)系。

1　材料與方法

1.1腦死亡模型的建立取巴馬小型豬6只，雌雄不限，8～12月齡，體質(zhì)量(32±0.5)kg，由天津薊縣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物基地提供。術(shù)前禁食24 h、禁水12 h，肌內(nèi)注射氯胺酮10 mg/kg、安定0.4 mg/kg、阿托品0.03 mg/kg行基礎(chǔ)麻醉，取仰臥位固定。靜脈注射氯胺酮1 mg/kg、氯化琥珀膽堿注射液1 mg/kg，吸入2.5%～3.0%七氟烷維持全身麻醉；氣管內(nèi)插管維持呼吸，頸總動(dòng)、靜脈插管記錄動(dòng)脈血壓、心率和中心靜脈壓，置入氣囊導(dǎo)尿管。參照Pratschke等[4]和Alonso等[5]的顱內(nèi)漸進(jìn)加壓方法并改進(jìn)，建立腦死亡模型。腦死亡判定參照相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)[6，7]，首次判定全部符合，觀察12 h無(wú)變化，方可判定為腦死亡，確認(rèn)腦死亡后維持24 h。

1.2血清IL-1β、IL-6、TNF-α檢測(cè)分別于腦死亡前及腦死亡0、3、6、9 h取上腔靜脈血5 mL，靜置30 min后3 000 r/min離心10 min，取上清-80 ℃保存。ELISA法檢測(cè)血清IL-1β、IL-6、TNF-α，試劑盒購(gòu)自美國(guó)USCN公司，按說(shuō)明書(shū)操作。

1.3肝組織超微結(jié)構(gòu)觀察取血同時(shí)進(jìn)行肝臟穿刺，獲得組織大小≥0.5 mm3，固定于2.5%戊二醛溶液，電鏡下行肝損傷評(píng)分。根據(jù)線粒體腫脹輕重分別計(jì)0、1分，外膜破裂輕重分別計(jì)1、2分；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張輕重分別計(jì)0、1分；纖維化輕、中、重分別計(jì)0、1、2分。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料比較，采用單因素方差分析及LSD檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料比較采用秩和檢驗(yàn)；相關(guān)關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1腦死亡前后豬血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平變化見(jiàn)表1。

2.2腦死亡前后電鏡下豬肝組織損傷評(píng)分比較腦死亡后9 h與腦死亡前及腦死亡后0 h肝組

表1　　　　腦死亡前后不同時(shí)點(diǎn)豬血清IL-1β、IL-6、TNF-α水平比較

注：與腦死亡前比較，*P<0.05。

織損傷評(píng)分有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.007、0.035)。見(jiàn)表2。

表2　　　　腦死亡前后不同時(shí)點(diǎn)電鏡下豬肝組織損傷評(píng)分結(jié)果(只)

2.3腦死亡豬血清IL-6水平與電鏡下肝組織損傷評(píng)分的關(guān)系Spearman相關(guān)分析顯示，腦死亡豬血清IL-6水平與電鏡下肝組織損傷評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.702，P=0.000)。

3　討論

IL-1β主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，在發(fā)熱、免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、傷口愈合以及刺激造血中起重要作用[8]。IL-6可由單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞及T細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)的主要分子，在免疫及炎癥損傷中起重要作用。TNF-α可由多種細(xì)胞分泌，肝臟中的Kuppfer細(xì)胞是其主要來(lái)源，可通過(guò)誘導(dǎo)氧自由基產(chǎn)生及活化中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等介導(dǎo)炎癥損傷[9]。本研究結(jié)果顯示，豬血清IL-6水平逐漸升高，到腦死亡后9 h與腦死亡前有顯著性差異；血清IL-1β和TNF-α水平在腦死亡前后稍有波動(dòng)，但無(wú)顯著性差異。研究顯示[10,11]，在腦死亡狀態(tài)下機(jī)體血液循環(huán)中IL-6水平顯著升高。其原因可能是IL-6對(duì)于腦死亡狀態(tài)下的交感神經(jīng)異常及缺血缺氧應(yīng)激反應(yīng)較IL-1β和TNF-α更敏感，有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

電鏡下觀察腦死亡豬肝組織超微結(jié)構(gòu)改變包括線粒體腫脹、外膜破裂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞外基質(zhì)膠原蛋白增多[12]。其中，線粒體腫脹是可以恢復(fù)的，但是，如果線粒體腫脹到一定程度導(dǎo)致外膜破裂，為不可逆改變；在腦死亡狀態(tài)時(shí)肝臟細(xì)胞間基質(zhì)膠原蛋白可增加數(shù)倍，導(dǎo)致肝纖維化，該過(guò)程也為不可逆改變[13]。在本研究中，隨著腦死亡時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物肝臟超微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)以上變化，在腦死亡后9 h最明顯。因此，我們初步認(rèn)定在腦死亡后9 h豬肝臟細(xì)胞出現(xiàn)了不可逆的損傷。

綜上所述，在腦死亡早期過(guò)程中，豬血清IL-6水平隨時(shí)間延長(zhǎng)不斷升高，并與肝組織超微結(jié)構(gòu)改變具有良好的相關(guān)性，提示對(duì)腦死亡早期的肝臟炎癥損傷可能存在一定促進(jìn)作用，但其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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天津市衛(wèi)生行業(yè)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(13KG102)；天津市應(yīng)用基礎(chǔ)與前沿技術(shù)研究計(jì)劃(15JCYBJC27000)。

唐纓(E-mail： doctortang2010@aliyun.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.34.008

R446.11

A

1002-266X(2016)34-0023-02

2016-05-13)