玉米氮素敏感性差異自交系的表達譜分析

葛 敏 呂遠大 張體付 周 玲 林 峰 趙 涵

江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 / 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學重點實驗室， 江蘇南京 210014

玉米氮素敏感性差異自交系的表達譜分析

葛 敏 呂遠大 張體付 周 玲 林 峰 趙 涵*

江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究所 / 江蘇省農(nóng)業(yè)生物學重點實驗室， 江蘇南京 210014

玉米基因型的氮肥敏感性存在顯著差異， 但基因表達模式尚不清楚。本研究以玉米氮敏感型自交系 B73和鈍感型自交系Mo17為材料， 對足氮（sufficient nitrogen， SN）和低氮（limiting nitrogen， LN）條件下苗期葉片組織的轉(zhuǎn)錄組進行了分析。對于葉片總氮含量， 敏感型B73在足氮和低氮條件下存在顯著差異， 而鈍感型Mo17的差異小且不顯著?；虮磉_差異分析顯示，Mo17在2種氮環(huán)境下差異基因達13867個， 在低氮環(huán)境下上調(diào)基因是數(shù)下調(diào)基因數(shù)的1.9倍（9044/4823）； B73差異基因數(shù)為10 028個， 低氮環(huán)境下上調(diào)基因少于下調(diào)基因數(shù)（4233/5795）?；蚓垲惙治鲆诧@示，低氮環(huán)境下鈍感型 Mo17基因表達上調(diào)或下調(diào)的幅度高于敏感型 B73。差異基因雙尾方差分析表明，受氮環(huán)境和基因型共同影響的差異基因為 342個， 功能主要集中在與氨基酸代謝、光合作用、次級代謝及基因復制表達等途徑。綜上所述， 在低氮條件下氮鈍感型Mo17較敏感型B73激活更多的基因來提高植株對氮的吸收和同化能力， 被激活的基因可能與玉米氮肥同化和利用有關(guān)。

玉米； 氮素； 氮脅迫； 轉(zhuǎn)錄組分析； 氮素利用率

氮素作為必需的大量營養(yǎng)元素對植物的生長發(fā)育具有至關(guān)重要的作用， 氮素的缺乏將嚴重制約作物產(chǎn)量乃至整個生態(tài)系統(tǒng)的初級生產(chǎn)量［1-2］。玉米作為世界三大糧食作物之一， 其產(chǎn)量的高低很大程度上依賴于氮肥施用量的多少。據(jù)統(tǒng)計， 每年約1.2億噸的氮肥用于全球糧食生產(chǎn)， 被作物利用的氮肥卻不超過40%［3］， 氮肥有效利用率很低。因此， 如何提高作物對氮素的高效利用已成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟待解決的重要課題［4-5］。

作物氮素利用率（NUE）的廣義定義是生物產(chǎn)量與土壤氮肥水平的比值［6］， 既反映植物對氮素的獲得能力， 同時反映植物對體內(nèi)氮素的分配和利用能力。該性狀極為復雜， 涉及氮素吸收、轉(zhuǎn)運、同化利用等多個生理過程。水稻中曾發(fā)現(xiàn)多個 QTL對NUE有顯著貢獻， 并對主效QTL精細定位［7-9］。Sun等［10］利用水稻氮敏感材料NJ6和鈍感材料QZL2構(gòu)建的重組自交系及其回交群體鑒定出一個控制水稻NUE的主效QTL （qNGR9）， 經(jīng)定點克隆和遺傳互補實驗發(fā)現(xiàn)qNGR9為早期已鑒定的DEP1基因［11］， 該基因位點的改變可提高水稻籽粒產(chǎn)量。Sun等［10］后續(xù)試驗還發(fā)現(xiàn)DEP1蛋白可以與G蛋白亞基（RGA1 和RGB1）互作， 通過減小RGA1或增加RGB1的活性來抑制氮信號的感知和響應， 最終通過綜合分析推斷異三聚體G蛋白調(diào)控水稻的氮素利用率。此外，一系列研究也顯示玉米的多條染色體上都存在決定NUE的QTL［12-14］。因此， NUE是一個由多基因控制的數(shù)量遺傳性狀。

提高作物氮素利用率， 實際上就是挖掘作物氮高效利用的潛力。氮高效品種理論上可分為 “低氮高效”和“高氮高效” 兩類， 前者可以在相近產(chǎn)量水平下通過高效吸收環(huán)境氮素而達到節(jié)省氮肥的目的，而后者則可在高產(chǎn)的基礎上隨氮肥投入的增加進一步提高其產(chǎn)量［15］。然而， 面對國內(nèi)耕地土壤大規(guī)模養(yǎng)分貧瘠的現(xiàn)狀， 如何培育出適應低氮貧瘠環(huán)境的“低氮高效”玉米品種顯得尤為重要。已報道的表達譜研究結(jié)果表明植物對氮素的利用率高度依賴于環(huán)境和遺傳變異的互作和由其所對應的表型性狀。Chen等［16］通過對玉米自交系鄭 58和昌 7-2轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)氮環(huán)境和基因型顯著互作的96個基因， 這些基因富集于轉(zhuǎn)錄因子特別是 AP2/EREBP 和WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族， 推測轉(zhuǎn)錄因子在氮環(huán)境與基因型互作中發(fā)揮重要作用。Gelli等［17］篩選出3種氮敏感型和 4種鈍感型高粱材料， 比較其低氮環(huán)境中的轉(zhuǎn)錄組變化發(fā)現(xiàn)， 氮敏感型材料的差異表達基因富集于應激反應途徑， 例如氧化應激和刺激應激反應； 氮鈍感型材料中高親和氮轉(zhuǎn)運蛋白（NRT2.2、NRT2.3、NRT2.5和NRT2.6）和賴氨酸組氨酸轉(zhuǎn)運蛋白（LHT1）基因的表達量高， 并且鈍感型材料還可以通過提高根部的生物量來增加對氮素的攝入。Gelli等［17］研究發(fā)現(xiàn)， 在低氮環(huán)境下氮敏感和鈍感型高粱材料基因的表達模式存在差異， 鈍感型材料差異表達基因富集在氮高效吸收等途徑。然而， 玉米中這方面的較少。鑒于此， 本研究選取對氮素環(huán)境敏感性存在顯著差異的玉米自交系B73和Mo17， 借助于RNA-seq二代測序技術(shù)對足氮（SN）和低氮（LN）條件下V3期（3片完全展開葉）葉組織的轉(zhuǎn)錄組測序， 鑒定不同氮環(huán)境下的差異表達基因， 并對差異基因進行雙尾方差、聚類分析和基因富集分析（Gene set enrichment analysis）， 尋找響應氮環(huán)境的關(guān)鍵基因，為玉米氮高效育種提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料與處理方法

將玉米自交系B73和Mo17種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學院溫室（江蘇南京）。取飽滿的玉米種子置25℃培養(yǎng)箱催芽48 h， 挑選生長狀態(tài)一致的材料種植于2.5 L的盆缽中， 盆缽內(nèi)裝有充分拌勻的沙土（含氮量為87.5 ± 2.7 mg kg-1）。從玉米V1期（一片完全展開葉）開始進行足氮（SN）和低氮（LN）兩種處理， 直至玉米V3期， 每種處理各3盆， 每盆2株。處理溶液為改良的 Hoagland營養(yǎng)液［18］（SN： 15.00 mmol L-1KNO3，LN： 0.15 mmol L-1KNO3）， 每3 d施加一次， 每次每盆200 mL。處理期間利用凱氏定氮法實時監(jiān)控沙土氮含量， 并將SN和LN處理下沙土氮含量的比值控制在2～4范圍內(nèi)。待玉米生長至V3期， 取植株葉片利用凱氏定氮法測定葉片總氮含量。

1.2 玉米葉片轉(zhuǎn)錄組分析

于玉米V3期取樣（B73-SN、B73-LN和Mo17-SN、Mo17-LN， 生物學重復混合池取樣）。利用Promega RNA Isolation System試劑盒提取葉片組織總RNA，并用TaKaRa公司的RNase-Free DNase I處理除去殘留的基因組DNA。所提取的總RNA經(jīng)質(zhì)量檢測后用于文庫構(gòu)建及Illumina paired-end測序（Illumina Hiseq2500 V4試劑測序平臺， 測序模式為125 PE，測序公司為貝瑞和康）。

1.3 主成分分析

首先對玉米葉片轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果進行預處理，經(jīng)低質(zhì)量Q20清理、Reads讀長過濾、rRNA及病毒序列過濾， 獲得清理后的高質(zhì)量序列。隨后利用Tophat2程序?qū)⑦@些序列比對到玉米參考基因組， 并利用eXpress程序解析比對結(jié)果， 統(tǒng)計分析獲得4個樣品轉(zhuǎn)錄組表達量的FPKM值（fragments per kilobase of exon per million fragments mapped）［19］。最后依據(jù)Patterson等所描述的操作流程對4組樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）， 利用EIGENSOFT軟件提供的 twstats 程序進行Tracey-Widom檢驗， 得到特征向量的顯著性分析［20］。

1.4 基因表達差異的分析

為解析氮素對玉米材料轉(zhuǎn)錄組的影響， 分析樣品的轉(zhuǎn)錄組基因差異表達。差異表達基因的篩選條件為玉米材料在低氮（LN）和足氮（SN）處理下基因相對表達量（FPKM值）的比值達2倍以上， 即log2LN/SN ≥1或≤-1。

1.5 差異表達基因的聚類分析

利用R軟件包， 根據(jù) Widiez等［21］研究方法， 對B73和Mo17中的差異表達基因（differentially expressed genes， DEGs）進行雙尾方差分析（因素A為氮環(huán)境； 因素B為基因型； P ≤ 0.05）。利用MeV4.9 （http：//www.tm4.org/mev.html）軟件包K均值聚類方法， 對DEGs進行表達模式的聚類分析。利用KOBAS 2.0 （http：//kobas.cbi.pku.edu.cn）［22］網(wǎng)站， 對DEGs進行功能注釋和序列相似性映射， 通過Fisher測驗找出基因顯著性富集的代謝途徑（P ≤ 0.05）。

1.6 氮標記基因（nitrogen biomarker gene）的表達模式分析

首先在NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取Yang等［23］研究中N標記基因的探針序列GSE32361 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi？acc=GSE32361）， 然后利用生物信息學軟件將探針序列比對到玉米V3版基因組（AGPv3； http：//www.maizegdb.org/）上， 獲得氮標記基因。如方法1.4所述對氮標記基因進行基因表達差異分析（即log2LN/SN ≥1或≤-1）。最后利用MEV4.9軟件包繪制氮標記基因的Heatmap圖， 并分析其表達模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 氮處理下玉米葉片氮含量分析

如圖1所示， B73足氮（SN）處理下葉片總氮含量為（22.9 ± 1.9） mg g-1， 低氮（LN）處理下葉片總氮含量為（12.5±0.4） mg g-1（圖1）。經(jīng)單因素方差分析，不同氮處理下B73葉片總氮含量差異顯著（表1）， LN處理下總氮含量僅為SN處理的54.6% （12.5/22.9），下降明顯。LN和SN處理下Mo17葉片總氮含量分別為（14.6±0.3） mg g-1和（16.5±0.6） mg g-1， 施氮量減少后葉片總氮含量有所下降但兩者差異并不顯著（表1）， LN和SN處理下總氮含量的比值為0.9， 接近一致。此外， LN處理下Mo17葉片總氮含量高于B73，為其1.3倍（圖1）。以上表明， 玉米自交系B73對環(huán)境中氮濃度敏感性強， 植株體內(nèi)的氮積累量極大依賴于外界氮的施加量， 而玉米自交系Mo17對外界氮依賴程度較低。

圖1 玉米葉片總氮含量Fig.1 Nitrogen contents in maize leaves

表1 氮處理下玉米葉片氮含量方差分析Table1 ANOVA analysis of nitrogen contents between different treatments

2.2 玉米葉片轉(zhuǎn)錄組分析

為了系統(tǒng)分析氮敏感和鈍感型材料在不同氮素環(huán)境下轉(zhuǎn)錄組的變化情況， 對玉米自交系B73和Mo17在2種氮處理下V3期葉片進行取樣（B73-SN、B73-LN和Mo17-SN、Mo17-LN）和轉(zhuǎn)錄組測序分析。測序后獲得高質(zhì)量數(shù)據(jù)， B73-SN為14.3 Gb， B73-LN為12.5 Gb， Mo17-SN為14.0 Gb， Mo17-LN為17.1 Gb。4組數(shù)據(jù)經(jīng)清理過濾及標準化處理后， 分別獲得62 777、64 251、58 418和84 702個轉(zhuǎn)錄本（表達量FPKM值>0）。上述結(jié)果顯示敏感型材料B73在LN處理下轉(zhuǎn)錄本數(shù)目比SN多1474個， 而鈍感型材料Mo17在LN處理下比SN 多26 184個轉(zhuǎn)錄本， 數(shù)目遠高于B73。

2.3 轉(zhuǎn)錄組主成分分析

上述4組樣品的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（B73-SN、B73-LN和Mo17-SN、Mo17-LN）經(jīng)主成分分析后共獲得2個主成分， 第一主成分（PC1）的貢獻率為87.6%， 第二主成分（PC2）的貢獻率為12.4%， 清楚地說明了本研究數(shù)據(jù)的變化趨勢。如圖2所示， 基因型（B73和Mo17）間完全分開， 氮環(huán)境（SN和LN）間也完全分開， 并且Mo17在2種氮環(huán)境下的距離較B73遠。表明本研究氮濃度的試驗設計合理， 能夠使試驗材料在兩種不同氮濃度環(huán)境下轉(zhuǎn)錄組明顯變化， 并且為了更好適應低氮環(huán)境， 鈍感型材料Mo17轉(zhuǎn)錄組發(fā)生較大變化，該變化大于敏感型材料B73。

2.4 基因表達差異的分析

圖2 轉(zhuǎn)錄組主成分分析Fig.2 Principal component analysis （PCA） for experimental samples

氮敏感型材料B73在兩種氮處理下， 差異表達基因（DEGs， log2LN/SN ≥1或≤-1）數(shù)目為10 028個，其中包含氮代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Dof等； 氮鈍感型材料Mo17在不同氮環(huán)境下DEGs數(shù)目為13 867個， 高于B73， 約為其數(shù)目的1.4倍， 其中包含氮轉(zhuǎn)運蛋白基因（NRT）、氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白（AAT）、絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶（HT1）、氮代謝相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子Dof和Myb。兩材料共有DEGs數(shù)目3272個（圖3-A）。相對于足氮（SN）環(huán)境， B73在低氮（LN）條件下約42.2% （4233/10028） DEGs的表達上調(diào)， 約57.8% （5795/ 10028） DEGs的表達下調(diào)， 基因上調(diào)的比例低于下調(diào)的比例。然而， 在低氮（LN）環(huán)境， Mo17約65.2% （9044/13867） DEGs的表達上調(diào)， 約34.8% （4823/ 13867） DEGs的表達下調(diào)， 基因上調(diào)的比例高于下調(diào)的比例， 為其1.9倍（圖3-B）。上述結(jié)果表明， 相對于B73， 氮鈍感型材料Mo17較多基因發(fā)生差異表達， 且大部分DEGs表達上調(diào)， 推測與其適應氮脅迫有關(guān)。

2.5 表達差異基因的聚類分析

受氮環(huán)境差異直接影響的DEGs為716個， 受基因型差異直接影響的DEGs為545個， 受氮環(huán)境和基因型共同影響的DEGs為342個。其中受兩者共同影響的基因數(shù)目與受基因型影響的數(shù)目重疊較大， 為62.8% （342/545）， 遠高于隨機分布。為了對受氮環(huán)境和基因型共同影響的DEGs建立更為系統(tǒng)的了解， 我們對上述基因進行了聚類分析。首先， 根據(jù)基因的表達模式利用 MEV 4.9軟件包K均值聚類方法將342個基因分為4個類群（Cluster1-4）， 如圖4所示， 4個類群B73和Mo17在兩種氮環(huán)境下表達模式均有所不同， 基因上調(diào)或下調(diào)的幅度差異較大。此外， 各類群基因富集分析（P≤0.05）表明， Cluster1中聚集的基因數(shù)目為83個， 此類群中B73和Mo17的DEGs基因在LN環(huán)境下表達量均上調(diào)， 上調(diào)幅度Mo17高于B73，此類基因富集在色氨酸代謝（Tryptophan metabolism，zma00380）和醚脂代謝（Ether lipid metabolism，zma00565）途徑； Cluster2中基因數(shù)目為103個， 在LN環(huán)境下基因表達量均下調(diào)， 整體表達量水平Mo17高于B73， 此類基因富集在賴氨酸降解（Lysine degradation， zma00310）、類胡蘿卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis， zma00906）和次生代謝產(chǎn)物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites， zma01110）途徑； Cluster3中基因數(shù)目為91個， 在LN環(huán)境下該類基因表達量均下調(diào)， 下調(diào)幅度Mo17高于B73， 此類基因富集在纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成（Valine， leucine and isoleucine biosynthesis，zma00290）途徑； Cluster4中基因數(shù)目為65個， 在LN環(huán)境下基因的表達量均上調(diào)， 上調(diào)幅度B73高于Mo17， 此類基因富集在堿基切除修復（Base excision repair， zma03410）、真核生物核糖體合成（Ribosome biogenesis in eukaryotes， zma03008）。整體而言， 低氮脅迫環(huán)境下受環(huán)境和基因型共同影響的DEGs中， 鈍感型Mo17基因表達上調(diào)或下調(diào)的幅度高于敏感型B73， 即對氮缺乏的響應更為劇烈（圖4）， 且此類基因富集在與氨基酸代謝、光合作用、次級代謝及基因復制表達相關(guān)途徑， 表明上述途徑極可能與低氮環(huán)境下氮素的高效利用有關(guān)。

圖3 基因表達差異分析Fig.3 Analysis of differentially expressed genes （DEG）

圖4 基因聚類分析Fig.4 Clusters of DEGs affected by N treatment and genotypes

2.6 氮標記基因的表達模式分析

為了探究前人報道的氮響應標記基因在本研究材料中的表達情況， 我們對Yang等［23］研究中的氮標記基因分析。發(fā)現(xiàn)， 2種氮處理下B73和Mo17中差異表達（log2LN/SN ≥1或≤-1）的氮標記基因［23］數(shù)目分別為69個和201個， Mo17遠高于B73 為其數(shù)目的2.9倍。在LN條件下， B73約44.9% （31/69）氮標記DEG的表達下調(diào)， 約55.1% （38/69）的基因表達上調(diào)， 基因上調(diào)和下調(diào)比例接近一致； Mo17氮標記 DEG上調(diào)和下調(diào)比例分別為 79.1% （159/ 201）和 20.9% （42/201）， 基因上調(diào)比例遠高于下調(diào)比例。此外， 在低氮環(huán)境下Mo17中約88.1% （177/ 201）的氮標記DEGs在B73中表現(xiàn)出相反或較弱的氮響應模式（圖5， 藍色為下調(diào)， 白色為無變化， 紅色為上調(diào)）。

圖5 兩種氮環(huán)境下氮標記基因的表達模式分析Fig.5 Differential expression of N biomarker genes in nitrate-induced Mo17 and B73

3 討論

基于已知的氮代謝生理途徑， 許多研究對一些關(guān)鍵基因過量表達以期顯著提高作物對氮素的利用率。例如， Liu等［24］研究發(fā)現(xiàn)擬南芥中過量表達根系氮轉(zhuǎn)運蛋白基因（NRT1.1）可以提高氮的吸收率。Martin等［25］通過在玉米中過量表達胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶基因（cytosolic glutamine synthetase）發(fā)現(xiàn)， 溫室中種植的轉(zhuǎn)基因玉米植株在籽粒數(shù)和籽粒產(chǎn)量上均比對照增加30%。但在隨后的大田試驗增產(chǎn)效果不顯著。Brauer等［26］則認為過量表達胞質(zhì)谷氨酰胺合成酶基因并不能提高低氮條件下轉(zhuǎn)基因水稻的NUE水平。目前尚未有足夠的證據(jù)表明過表達氮代謝途徑中的單個基因可以顯著提高植物 NUE， 說明氮素利用率是一個受多基因控制的復雜性狀并且和外界環(huán)境存在緊密的互作關(guān)系。本研究基于二代測序技術(shù)對不同氮環(huán)境下玉米氮敏感和鈍感型自交系 V3期葉片組織轉(zhuǎn)錄組進行分析， 挖掘出苗期氮環(huán)境和基因型互作的關(guān)鍵基因324個， 基因的功能集中于氨基酸代謝、光合作用、次級代謝及基因復制表達等相關(guān)的不同代謝途徑， 這與前人研究結(jié)果一致，玉米氮素利用率與環(huán)境存在緊密互作， 為多基因調(diào)控多個代謝途徑共同作用的復雜性狀。

通過轉(zhuǎn)錄組主成分分析驗證了本研究氮濃度設計的合理性， 分析結(jié)果顯示玉米材料間的確存在氮敏感性的差異， 鈍感型材料 Mo17為了更好適應低氮環(huán)境轉(zhuǎn)錄組發(fā)生較大變化。Mo17在兩種氮環(huán)境下差異基因的數(shù)目為13 867個， 遠高于B73差異基因的數(shù)目， 并且與B73相反， Mo17在低氮環(huán)境下基因上調(diào)比例高于下調(diào)比例， 表明氮鈍感型材料 Mo17在低氮環(huán)境下較敏感型材料B73激活更多的基因表達以提高植株對氮的吸收和同化能力。Yang等［23］研究中的氮標記基因在本研究中也得到較好的驗證，低氮處理下 Mo17差異表達的氮標記基因數(shù)目高于B73， 為其數(shù)目的 2.9倍， 且 79.1%的氮標記 DEGs表達量上調(diào)， 表明鈍感型材料在低氮環(huán)境下可激發(fā)更多的氮響應標記基因表達， 使氮代謝途徑中的關(guān)鍵基因處于活躍狀態(tài)， 盡可能多地吸收利用有限的氮素以適應低氮貧瘠環(huán)境。

本研究所鑒定的環(huán)境和基因型互作基因的功能涉及范圍較廣， 覆蓋上游基因的表達調(diào)控。前人曾發(fā)現(xiàn)在外界氮信號刺激下， 擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AtNLP7［2］作為初期氮響應的重要元件， 能迅速響應并對氮代謝關(guān)鍵基因（NRT、NIA、GS等）的表達有直接調(diào)控作用［27-28］。Chen等［16］也推測轉(zhuǎn)錄因子在氮環(huán)境與基因型互作中發(fā)揮重要作用。表明轉(zhuǎn)錄因子作為基因表達的調(diào)控元件， 對外界環(huán)境中氮濃度感知和氮信號轉(zhuǎn)導及氮代謝途徑的調(diào)控有重要作用。本研究鑒定的互作基因功能涉及基因的表達調(diào)控，可能其中也含有一些重要的轉(zhuǎn)錄因子基因， 后期可作更為詳盡的研究。此外， 互作基因的功能還直接涉及氨基酸代謝、光合作用等與氮代謝直接相關(guān)的代謝途徑。Bi等［3］對玉米自交系SRG100和SRG200，及其雜交種 SRG150表達譜分析發(fā)現(xiàn)， 氮響應基因富集在氮復合物代謝、氨基酸代謝等途徑。Humbert等［4］對干旱和氮脅迫下玉米材料的表達譜分析發(fā)現(xiàn)，光合作用和氨基酸代謝途徑與適應低氮脅迫有關(guān)。從上述研究結(jié)果可以推測， 氮鈍感型材料是通過積極的氮響應機制、轉(zhuǎn)錄因子的表達調(diào)控、氮代謝相關(guān)途徑直接調(diào)節(jié)共同作用以適應氮脅迫環(huán)境。然而，本研究所鑒定的氮環(huán)境和基因型互作基因是否對氮素利用率存在貢獻， 后期還需利用基因定點突變或轉(zhuǎn)基因技術(shù)手段對基因的功能進行更為深入的解析，以期獲得調(diào)控玉米氮素利用率的候選基因。此外本研究主要針對玉米苗期表達譜， 該時期為氮素吸收同化儲備時期， 鑒于NUE性狀的復雜性， 今后還可選擇玉米生長的其他關(guān)鍵時期例如籽粒灌漿期進行研究。

4 結(jié)論

本研究鑒定的玉米自交系氮敏感型B73和遲鈍型 Mo17在不同氮環(huán)境下轉(zhuǎn)錄組存在較大差異。發(fā)現(xiàn) 342個氮環(huán)境和基因型互作基因， 低氮環(huán)境下鈍感型材料中這些基因大部分表達量上調(diào)， 這些基因的功能與氨基酸代謝、光合作用、次級代謝及基因復制表達等途徑相關(guān)。

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Global Transcriptome Analysis in High- and Low-Nitrogen Responsive Inbred Lines of Maize

GE Min， LYU Yuan-Da， ZHANG Ti-Fu， ZHOU Ling， LIN Feng， and ZHAO Han*

Institute of Biotechnology， Provincial Key Laboratory of Agrobiology， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing 210014， China

Different maize genotypes exhibit variation in nitrogen （N） responsiveness， however， the corresponding gene expression patterns are unexplored yet.Here， we performed a comprehensive transcriptome profiling of high- and low-nitrogen responsiveness genotypes in the conditions of sufficient-nitrogen （SN） and limiting-nitrogen （LN） supply.Under LN condition， B73， a high-N-responsive inbred line， accumulated a much lower N content in leaf than under SN condition.Whereas， the Mo17， a low-N-responsive inbred line， showed no significant difference in leaf N content between SN and LN.The RNAseq assay revealed a total of 13 867 and 10 028 differentially expressed genes in Mo17 and B73， respectively， including 9044 （Mo17） and 4233 （B73） up-regulated genes and 4823 （Mo17） and 5795 （B73） down-regulated under LN.Moreover， the principal component analysis （PCA） showed that the magnitude of transcriptome variation was greater in Mo17 than in B73 under LN.According to two-tail variance analysis， 342 differentially expressed genes had significant genotype-by-nitrogen interaction.These genes were mainly involved in amino acid metabolism， photosynthesis， biosynthesis of secondary metabolites， and gene replication and expression.Our results suggest that more genes might be activated under N limiting condition in the low-N-responsive genotype than in the high-N-responsive genotype in order to modulate N assimilation and utilization in maize plant.

Maize； Nitrogen； Nitrogen stress； Transcriptome profiling； Nitrogen use efficiency （NUE）

10.3724/SP.J.1006.2016.01487

本研究由國家自然科學基金項目（31271728）和江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（14）2009）資助。

This work was supported by the Natural Science Foundation of China （31271728） and the Jiangsu Agriculture Science and Technology Innovation Fund ［CX（14）2009］.

（Corresponding author）： 趙涵， E-mail： zhaohan@jaas.ac.cn

聯(lián)系方式： E-mail： gemin8614@163.com

Received（）： 2016-02-22； Accepted（接受日期）： 2016-06-20； Published online（網(wǎng)絡出版日期）： 2016-07-28.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160728.0817.014.html