海馬齒甜菜堿醛脫氫酶基因克隆、高效表達及酶學特性分析

喻時周楊成龍郭建春段瑞軍

1貴州省油菜研究所， 貴州貴陽550008；2貴州省亞熱帶作物研究所， 貴州興義 562400；3中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所 /農業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室， 海南?？?571101；4貴州禾睦福種子有限公司， 貴州貴陽 550008

研究簡報

海馬齒甜菜堿醛脫氫酶基因克隆、高效表達及酶學特性分析

喻時周1，4楊成龍2，*郭建春3段瑞軍3

1貴州省油菜研究所， 貴州貴陽550008；2貴州省亞熱帶作物研究所， 貴州興義 562400；3中國熱帶農業(yè)科學院熱帶生物技術研究所 /農業(yè)部熱帶作物生物學與遺傳資源利用重點實驗室， 海南?？?571101；4貴州禾睦福種子有限公司， 貴州貴陽 550008

在許多滲透調節(jié)劑中， 甜菜堿是最理想的有機小分子滲透調節(jié)物質。甜菜堿在植物體內大量積累不會帶來危害，同時能提高植物對環(huán)境脅迫的抗性。將海馬齒中克隆到的甜菜堿醛脫氫酶基因構建到表達載體pET-28a（+）上， 獲得重組載體pET-SpBADH并將其成功地轉化到BL21（DE3）中得到重組工程菌， 經IPTG誘導能高效表達55 kD目的蛋白， 表達量可以達到301 μg mL-1。酶學特征分析表明， 該蛋白最適pH值為7.2， 在偏堿條件下能維持較高的催化活性； SpBADH蛋白對高溫敏感， 且溫度對催化活性影響較大， 超過 55℃時酶活性只有 20%， 最適酶催化活性溫度為 37℃； 而有機小分子醇類對酶的催化活性有保護作用， 可以通過自身特征維持酶催化活性的微環(huán)境。

海馬齒； 甜菜堿醛脫氫酶； 原核表達； 酶活測定

低溫、高溫、高鹽和干旱等環(huán)境脅迫是限制植物生長和分布的主要因素之一。植物在應答環(huán)境脅迫時， 甜菜堿是無毒害快速增加的滲透調節(jié)物質。同時在細菌、真細菌和動植物中， 甜菜堿是許多組織生理缺水時的重要滲透調節(jié)物質［1-3］。在植物體內， 甜菜堿以膽堿為底物， 經兩步催化合成， 即乙酰膽堿→甘氨酸甜菜堿醛→甘氨酸甜菜堿， 其中甜菜堿醛在甜菜堿醛脫氫酶（betaine aldehyde dehydrogenase， BADHase） 的作用下氧化生成甜菜堿。甘氨酸甜菜堿（GB）作為季胺堿， 是植物的一種重要的滲透保護劑， 不僅在植物受到環(huán)境脅迫時積累于細胞內以降低滲透勢， 還能對有氧呼吸、能量代謝過程和光呼吸生理功能具有良好保護和促進作用［4-6］。

海馬齒（Sesuvium portulacastrum L.）是一種真鹽生紅樹林植物， 該屬共有8個種， 中國只有1個種， 多生長于熱帶和亞熱帶海岸。海馬齒具有很強的生命力， 逆境生活能力非常強； 具有耐鹽， 耐旱和抗重金屬等作用， 且在淡水和海水澆灌下均能完成其生活史［7-8］。本文系統(tǒng)研究了甜菜堿脫氫酶基因的表達特性、酶的生物學特性， 以期了解 SpBADH基因的功能以及在海馬齒抗鹽過程中作用機理， 為培育理想的耐鹽植物新品系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

海馬齒采自海南省?？谑邪咨抽T濱海， pMD18-T Vector （貨號為 D101A）購自寶生物公司； 表達載體pET-28a（+）、大腸桿菌DH5α菌株及大腸桿菌BL21（DE3）plys由本實驗室保存。

1.2 工具酶及主要試劑

DNA Marker和蛋白質Marker、小量質粒提取試劑盒、T4 DNA連接酶、BamH I和Sal I限制性內切酶購自上海生工生物工程有限公司； DNA回收試劑盒購自申能博彩有限公司； IPTG、丙烯酰胺（Acr）及甲叉雙丙烯酰胺（Bis）和 Ni-NTA-Sefinose Colum 蛋白純化試劑盒購自BioBasic公司。四甲基乙二胺（TEMED）購自Sigma公司；其余試劑均為國產分析純。

1.3 重組載體pET-SpBADH的構建與鑒定

根據海馬齒甜菜堿醛脫氫酶全長基因 SpBADH的cDNA序列（GenBank登錄號為 JN192464）， 設計擴增SpBADH 開放閱讀框引物。上游引物為 5′-ATC GGATCC ATGGCGTTCCCTATACCT-3′， 引入BamH I酶切位點（下畫線部分）， 下游引物為 5′-ATCGTCGAC TCAAGGAGACTTGTAC-3′， 引入Sal I酶切位點（下畫線部分）。引物由上海生工生物工程有限公司合成。以海馬齒 cDNA為模板進行 PCR擴增， PCR體系（50 μL）含：5×Prime STAR緩沖液（Mg2+plus） 10 μL、2.5 mmol L-1dNTPs 3 μL、引物各 2 μL、模板 2 μL、2.5 U mL-1PrimeSTAR HS DNA聚合酶1 μL、ddH2O 30 μL。PCR程序為94℃預變性4 min； 94℃變性45 s， 60℃退火45 s， 72℃延伸l.5 min， 35個循環(huán)： 72℃延伸10 min。PCR產物經1%的瓊脂糖凝膠電泳分析， 其大小與預期一致。將目的片段切膠回收， 加尾連接pMD18-T Vector， 送上海生工生物工程有限公司測序， 陽性克隆提取質粒， 將 pMD18-SpBADH和pET-28a（+）質粒分別用BamH I和Sal I雙酶切，目的片段切膠回收， 回收產物以摩爾比 3∶1混合， 然后加入 T4 DNA連接酶， 16℃下連接過夜， 轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞， 在含有Amp抗性的平板上培養(yǎng)， 挑取陽性克隆進行PCR及BamH I和Sal I雙酶切初步鑒定， 鑒定正確后送上海生工生物工程有限公司測序。

1.4 重組SpBADH基因工程菌的構建及目的基因的表達

將已經鑒定的重組表達載體 pET-SpBADH轉化大腸桿菌 BL21（DE3）plys， 篩選陽性克隆。將陽性克隆活化過夜后， 以1∶100濃度加到液體LB培養(yǎng)基中37℃振蕩培養(yǎng)， 使OD600為0.6左右， 加入IPTG誘導培養(yǎng)， 取菌液進行SDS-PAGE分析。

1.5 重組SpBADH基因工程菌誘導條件的優(yōu)化

1.5.1 菌株最佳誘導起始生長量的確定 工程菌分別培養(yǎng)至OD值為0.1、0.2、0.5、0.6、0.8、1.0和1.2時向培養(yǎng)液中添加最佳濃度的IPTG， 37℃下誘導6 h， 取菌液作SDS-PAGE分析。

1.5.2 最適IPTG濃度的確定 在重組菌株生長至OD 為0.6時， 分別向6個搖瓶中加入不同量的IPTG， 使其終濃度分別為0.1、0.2、0.5、0.6、0.8和1.0 mmol L-1， 37℃下誘導6 h， 取菌液作SDS-PAGE分析。

1.5.3 最佳誘導溫度的確定 向處于最佳誘導起始生長量的搖瓶中添加最適濃度的IPTG， 分別在28℃、30℃、33℃和37℃下誘導6 h， 取菌液作SDS-PAGE分析。

1.5.4 最佳誘導時間的確定 培養(yǎng)菌液至 OD=0.6時，向菌液中添加最適濃度的IPTG， 于誘導1、2、3、4、5、6、7和8 h后取菌液作SDS-PAGE分析。

1.6 重組SpBADH的純化

將大規(guī)模誘導的菌液于4℃， 6000 ×g離心10 min收集菌體， 用細胞破碎緩沖液（50 mmol L-1NaH2PO4、300 mmol L-1NaCl、10 mmol L-1咪唑， pH 8.0， 不含EDTA）洗2次， 加入破碎緩沖液重懸菌體后置冰上預冷， 以超聲波破碎菌體。待菌體完全破碎后以17 000 ×g離心30 min，上清液中的蛋白溶液含有可溶表達的重組SpBADH。再按照Ni-NTA-Sefinose Colum蛋白純化試劑盒說明書純化重組 SpBADH， 將純化的重組SpBADH進行SDS-PAGE，并測定重組SpBADH蛋白質的濃度， 余下的緩沖液于4℃保存。

1.7 甜菜堿醛脫氫酶酶活的測定和酶活力的計算

參照羅笛等［9］所述略有修改， l mL反應體系中， 取0.9 mL反應緩沖液（50 mmol L-1HEPES， 0.5 mmol L-1NAD+，5 mmol L-1DTT， pH 9.5）， 加入0.05 mL純化蛋白溶液于紫外分光光度計比色杯中。反應從加入0.05 mL甜菜堿醛（betaine aldehyde， BA） （0.5 mmol L-1）起， 以未加入甘氨酸甜菜堿醛的反應液作對照， 25℃下反應 15 min， 測定OD340。試驗重復3次， 取平均值。

參照崔喜艷等［10］方法， 酶活力單位定義為 25℃下每分鐘轉化生成1 nmol NADH所需甜菜堿醛脫氫酶的量為一個活性單位（U）， 比活力為每毫克蛋白的活力數。比活力（nmol min-1mg-1）= ΔOD×10-3/ （εmax×C）×10-9。式中ΔOD為吸光值每分鐘增加的平均值； εmax為NADH OD340摩爾消光系數（6220）； C為測定時加入的蛋白酶量， 單位為mg；10-3為1 mL反應體系轉化為升的系數； 10-9為摩爾轉化為納摩爾的系數?？扇苄缘鞍缀恳?BSA為標準品， 按照Bradford法定量。

1.8 甜菜堿醛脫氫酶的酶學性質研究

1.8.1 最適pH值及pH值的穩(wěn)定性 配制pH 4.0～12.0的反應緩沖液， 37℃下將酶液分別與不同pH值的緩沖液反應， 測 SpBADH在不同緩沖液中反應時的酶活性， 確定酶反應的最適pH值。

將反應體系中的一定酶液加入不同 pH值的緩沖液中（不含有底物和輔酶）， 在 37℃溫浴 1 h， 測剩余的酶活力，觀察SpBADH在不同pH值下的穩(wěn)定性。

1.8.2 最適溫度和熱穩(wěn)定性 采用pH值為7.2的反應體系， 分別在16～80℃下反應10 min， 測定其酶活力， 觀察不同溫度下對酶促反應的影響。將一定量的酶液置于以上不同溫度下1 h， 測定其剩余酶活力， 觀察SpBADH在不同溫度下的穩(wěn)定性。

1.8.3 不同醇類對酶活力的影響和熱穩(wěn)定性 選擇酶的最適溫度和pH值條件下， 在反應體系中分別加入終濃度為2%的乙二醇、丙二醇、丙三醇、甘露醇、山梨醇和聚乙二醇， 測定 SpBADH的活性， 以不加醇類的初始酶液的酶活力為對照， 測定不同醇類對酶促反應的影響。

將酶液分別置于以上6種醇類中于42℃保溫1 h， 測定保溫后的剩余酶活力。觀察不同酶類對 SpBADH穩(wěn)定性的影響。以初始酶液的活力為 100%， 以不加保護劑的酶液經同樣熱處理為對照。

2 結果與分析

2.1 SpBADH的克隆與重組表達載體的構建

根據 NCBI登錄的海馬齒甜菜堿醛脫氫酶基因（SpBADH）序列克隆出全長 cDNA， 將克隆到的序列測序，測序結果與NCBI登錄序列相似性100%。將連有SpBADH基因片段的pMD18-SpBADH的質粒和pET-28a（+）分別用BamH I和Sal I雙酶切， 將2片段割膠回收并連接。將連接產物轉化DH5α， 得到重組pET-SpBADH質粒， 經PCR和雙酶切鑒定表達載體正確（圖1）。并將鑒定正確的克隆測序， 測序結果與 NCBI比對結果一致， 說明pET-SpBADH表達載體構建成功。

2.2 重組SpBADH大腸桿菌表達工程菌的誘導表達分析

對重組大腸桿菌表達工程菌 BL21（DE3）/pETSpBADH進行IPTG誘導表達。取誘導后的工程菌進行菌體蛋白制樣， 以相同的量上樣進行SDS-PAGE凝膠電泳分析， 以未誘導重組BL21（DE3）/pET-SpBADH工程菌為對照，SDS-PAGE結束后以考馬斯亮藍染色。

圖2表明， 重組大腸桿菌表達工程菌 BL21（DE3）/pET-SpBADH經誘導后在55 kD處比對照多一條蛋白條帶， 這與試驗預測大小一致。這說明重組大腸桿菌表達工程菌 BL21（DE3）/pET-SpBADH可以按照試驗設計正確表達目的蛋白。

2.3 重組SpBADH大腸桿菌表達工程菌的誘導條件的優(yōu)化

圖1 pET-SpBADH的PCR和酶切鑒定Fig.1 Identifications of pET-SpBADH by PCR and double digestion

圖2 重組SpBADH在大腸桿菌工程菌中的誘導表達Fig.2 Induction expression of the recombination SpBADH proteins in E.coli

2.3.1 最佳IPTG濃度 取工程菌8個濃度梯度誘導的菌體制樣， 并經SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色和脫色， 表明重組大腸桿菌表達工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH的表達量與 IPTG濃度關系相關性不緊密， 工程菌在不同IPTG濃度的表達量差異不顯著， 考慮到IPTG對菌體有毒害作用， 所以選擇最佳IPTG濃度為0.2 mmol L-1。

2.3.2 誘導時間的優(yōu)化 取7個誘導時間1、2、3、4、5、6和 7 h的工程菌全蛋白制樣， 取相同量的樣品經SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色和脫色， 表明重組大腸桿菌表達工程菌BL21（DE3）/pET- SpBADH誘導4 h時表達量最高， 隨著時間的增加工程菌的蛋白表達量不變。所以對重組大腸桿菌表達工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH最佳誘導時間為4 h。

2.3.3 最佳起始濃度優(yōu)化 取9個起始OD6000.1、0.2、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0、1.2和1.5誘導的工程菌全蛋白制樣， 取相同量的樣品SDS-PAGE凝膠電泳， 通過考馬斯亮藍染色和脫色， 表明重組大腸桿菌表達工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH誘導起始OD600為0.6時表達量最高， 隨著OD600的增加工程菌的表達量差異也不明顯。所以對重組大腸桿菌表達工程菌 BL21（DE3）/pET-Sp BADH最佳誘導起始OD600為0.6。

2.3.4 最佳誘導溫度 對重組 SpBADH大腸桿菌表達工程菌進行誘導溫度優(yōu)化表明， 重組大腸桿菌表達工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH在其他溫度時均也可誘導表達， 但在37℃下誘導蛋白表達量最高。所以重組大腸桿菌表達工程菌BL21（DE3）/pET-SpBADH的誘導表達的最佳溫度為37℃。

2.4 重組SpBADH的分離純化

分別取咪唑濃度洗脫液制樣， 經 SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色， 最后根據OD值測定重組SpBADH相對含量。圖3表明， 通過Ni-NTA-Sefinose Column分離純化重組SpBADH的含量為301 μg mL-1。

2.5 重組SpBADH的酶學特性

2.5.1 最適 pH 值和 pH 值穩(wěn)定性 將重組純化的SpBADH加入pH為4.0～10.0的反應體系中， 測定不同pH值下的酶活力表明， 重組SpBADH在pH為7.2時酶活力最大， 達到84.6 U mg-1。在pH為7.0左右時， SpBADH的酶活力較快上升并基本維持一個上升趨勢， 在超過最適pH值后其變化趨勢較為緩慢， 相對酶活力維持在 50%左右。表明該酶在pH值相對偏堿性的環(huán)境較穩(wěn)定。

圖3 重組SpBADH的分離純化Fig.3 Purification of the recombinant SpBADH protein

2.5.2 最適溫度及熱穩(wěn)定性 SpBADH在37℃范圍內的酶活力最高， 最大比酶活力100 U mg-1。由此可知， 37℃范圍是該酶反應的最適溫度。該酶對溫度變化敏感， 尤其對高溫表現最為顯著， 超過最適溫度以后的相對酶活力迅速下降到一半， 55℃以后的相對酶活力不足最高酶活力的20%。說明SpBADH對高溫很敏感， 在高溫條件下對酶活力影響最大。

2.5.3 不同醇類對酶活力的影響 在 37℃下測定SpBADH的活性， 以不加入醇類的初始酶活力為 100%，觀察各種醇類對酶活力的影響。從表1可以看出， 各種醇類對SpBADH的比酶活力影響不大。說明醇類在SpBADH的催化過程中起到緩沖液的作用。

2.5.4 不同醇類對酶熱穩(wěn)定性的影響 由以上試驗可知 SpBADH表現出熱不穩(wěn)定性， 醇類小分子有機物對酶的穩(wěn)定性有一定的作用。從表2可以看出醇類小分子有機物對 SpBADH具有熱穩(wěn)定性， 特別在反應體系中加入丙三醇后SpBADH的酶活力最高。

3 討論

鹽脅迫是影響植物分布和農作物產量及品質的重要因素之一， 植物通常以許多保護機制來維護自身正常的生理代謝。植物在受到脅迫時， 迅速合成并積累大量的滲透調節(jié)物質來維持植物細胞內正常生理功能， 免受脅迫傷害［11-13］。甜菜堿是最理想的有機小分子滲透調節(jié)物質。本研究將海馬齒甜菜堿醛脫氫酶基因克隆到表達載體pET-28a中， 轉化大腸桿菌BL21（DE3） plys， 得到能夠表達 SpBADH基因的重組菌株， 經 IPTG誘導， 重組SpBADH的蛋白的大腸桿菌重組工程菌能夠高效表達目的蛋白。它們的最優(yōu)表達條件為菌體培養(yǎng)溫度37℃， 蛋白質誘導表達菌體起始OD600為0.6， 誘導劑IPTG最佳濃度為0.2 mmol L-1， 誘導時間為6 h， 重組菌株SpBADH表達量達301 μg mL-1。通過Ni-NTA-Sefinose Column將重組SpBADH的可溶性蛋白分離純化， 以酶學特性分析表明SpBADH酶活性的最適pH值、最適溫度及熱穩(wěn)定性、醇類對酶活力和熱穩(wěn)定的影響。BADH蛋白的輔酶是NAD+，可以催化甜菜堿醛、4-三甲基氨基丁醛和4-氨基正丁醛［14］等醛類物質生成甜菜堿。本研究用甘氨酸甜菜堿醛作為底物與大腸桿菌中表達的 SpBADH基因的分離純化物反應表明， SpBADH全長基因表達的蛋白質其酶活性可以達到87 U mg-1， 說明我們從海馬齒植物中分離的SpBADH基因具有催化甘氨酸甜菜堿醛的功能， 所以該基因為甜菜堿醛脫氫酶基因。SpBADH酶活力的最適pH值為7.2； 最適反應溫度為37℃； SpBADH對高溫十分敏感， 溫度超過55℃時酶活性只有 20%。李秋莉等［15］在研究遼寧堿蓬SlBADH純化蛋白性質時發(fā)現， SlBADH純化蛋白在超過40℃后， 其活性迅速下降。本研究建立了重組 SpBADH蛋白在大腸桿菌表達系統(tǒng)中的完全可溶性表達及純化體系， 獲得了純度較高的重組 SpBADH蛋白， 并分析了甜菜堿醛脫氫酶的基本生物特性。本研究為重組 SpBADH蛋白在其他微生物表達系統(tǒng)中的表達提供了參考依據，為研究其在抗逆過程中的作用提供了技術支撐。海馬齒作為海濱鹽生植物具有很強的抗鹽能力， 因此研究海馬齒中的甜菜堿合成途徑， 及相關基因的分子特性等， 對揭示甜菜堿抗鹽機理具有重要意義。

表1 不同醇類對酶活力的影響Table1 Effect of alcohols on the activity of SpBADH

表2 不同醇類對酶熱穩(wěn)定性的影響Table2 Effect of alcohols on the thermal stability of SpBADH

References

［1］ Ohnishi Y， Yamazaki H， Kato J Y， Tomono A， Horinouchi S.AdpA， a central transcriptional regulator in the A-factor regulatory cascade that leads to morphological development and secondary metabolism in Streptomyces griseus.Biosci Biotechnol Biochem， 2005， 69： 431-439

［2］ Chen T H H， Murata N.Glycinebetaine： an effective protectant against abiotic stress in plants.Trends Plant Sci， 2008， 13：499-505

［3］ Fan W J， Zhang M， Zhang H X， Zhang P.Improved tolerance to various abiotic stresses in transgenic sweet potato （Ipomoea batatas） expressing spinach betaine aldehyde dehydrogenase.PLoS One， 2012， 7： 1-14

［4］ Bohnert H J， Ayoubi P， Borchert C， Bressan R， Burnap R， Cushman J C.A genomics approach towards salt tolerance.Plant Physiol Biochem， 2001， 39： 295-311

［5］ 侯彩霞， 湯章城.細胞相容性物質的生理功能及其作用機制.植物生理學通訊， 1999， 35（1）： 1-7 Hou C X， Tang Z C.Function and mechanism of compatible solutes.Plant Physiol J， 1999， 35（1）： 1-7 （in Chinese with English abstract）

［6］ Munns R， Tester M.Mechanisms of salinity tolerance.Annu Rev Plant Biol， 2008， 59： 651-81

［7］ 楊成龍， 段瑞軍， 李瑞梅， 胡新文， 符少萍， 郭建春.鹽生植物海馬齒耐鹽的生理特性.生態(tài)學報， 2010， 30： 4617-4627 Yang C L， Duan R J， Li R M， Hu X W， Fu S P， Guo J C.Preliminary study on physiological characteristics of salt-tolerance in Sesuvium portulacastrum L.Acta Ecol Sin， 2010， 30： 4617-4627 （in Chinese with English abstract）

［8］ Yang C L， Zhou Y， Fan J Fu Y H， Shen L B， Yao Y， Li R M， Fu S P， Duan R J， Hu X W， Guo J C.SpBADH of the halophyte Sesuvium portulacastrum， strongly confers drought tolerance through ROS scavenging in transgenic Arabidopsis.Plant Physiol Biochem， 2015， 10： 377-387

［9］ 羅笛， 牛向麗， 余進德， 劉永勝.水稻、菠菜甜菜堿醛脫氫酶（BADH）重組蛋白表達及酶活性分析.農業(yè)生物技術學報，2012， 20： 1390-1397 Luo D， Niu X L， Yu J D， Liu Y S.Recombination and activity assay of betaine aldehyde dehydrogenase（BADH） protein of rice （Oryza sativa subs.japonica） and spinach （Spinacia oleracea）.J Agric Biotechnol， 2012， 20： 1390-1397 （in Chinese with English abstract）

［10］ 崔喜艷， 郭繼勛.不同鹽堿化草地羊草甜菜堿含量和甜菜堿醛脫氫酶活性的變化.吉林農業(yè)大學學報， 2006， 28： 606-609 Cui X Y， Guo J X.Changes of betaine content and activity of betaine aldehyde dehydro-genase of Leymus chinensis in different saline-alkali grassland.J Jilin Agric Univ， 2006， 28： 606-609 （in Chinese with English abstract）

［11］ Wyn Jones R G， Storey R， Leigh R A， Ahmad N， Pollard A.Ahypothesis on cytoplasmic osmoregulation.In： Marre E， Ciferri O，eds.Regulation of Cell Membrane Activities in Higher Plants.Amsterdam， the Netherland： Elsevier/North Holland Publication Corporation， 1977.pp 121-136

［12］ Lehmann S， Funck D， Szabados L， Rentsch D.Proline metabolism and transport in plant development.Amino Acids， 2010， 39：949-962

［13］ Chen J B， Zhang X Y， Jing R L， Blair M W， Mao X G， Wang S M.Cloning and genetic diversity analysis of a new P5CS gene from common bean （Phaseolus vulgaris L.）.Theor Appl Genet， 2010，120： 1393-1404

［14］ ángel G， Díaz-Sánchez， Lilian G S， Carlos M J， Enrique R P，Carmina M， León P M C， Rosario A M C.Amino acid residues critical for the specificity for betaine aldehyde of the plant ALDH10 isoenzyme involved in the synthesis of glycine betaine.Plant Physiol， 2012， 158： 1570-1582

［15］ 李秋莉， 張毅， 尹輝， 李丹.遼寧堿蓬甜菜堿醛脫氫酶（BADH）基因啟動子分離及序列分析.生物工程學報， 2006，22： 77-81 Li Q L， Zhang Y， Yin H， Li D.Isolation of BADH gene promoter from Suaeda liaotungensis and its sequence analysis.Chin J Biotechnol， 2006， 22： 77-81 （in Chin with English abstract）

Cloning， Expression， and Enzymatic Characteristics of Betaine Aldehyde Dehydrogenase Gene in Sesuvium portulacastrum L.

YU Shi-Zhou1，4， YANG Cheng-Long2，*， GUO Jian-Chun3， and DUAN Rui-Jun31Guizhou Rape Institute， Guiyang 550008， China；2Guizhou Institute of Subtropical Crops， Xingyi 562400， China；3Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology / Key Laboratory of Biology and Genetic Resources of Tropical Crops， Ministry of Agriculture / Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Haikou 571101， China；4Guizhou Hemufu Seed Co.Ltd， Guiyang 550008， China

Among many osmotic materials， glycine betaine is a best organic micro-molecular， and functionally works for osmotic regulation in plants， which is non-toxic to plant growth.A lot of glycine betaine accumulated in plant can enhance the resistance of plants to environmental stresses.In the study， a full-length sequence of betaine aldehyde dehydrogenase gene from Sesuvium portulacastrum was ligated with the vector pET-［28a］（+）， named pET-SpBADH， and successfully transformed into BL21（DE3） to obtain the corresponding recombinant engineering bacteria， which could highly express 55 kD protein induced by IPTG， with the expression level to 301 μg mL-1.The purified protein was obtained， showing the optimum pH value of 7.2， and maintain high catalytic activity the enzyme under slightly alkaline conditions.SpBADH protein very sensitive to high temperature effected the enzyme activity， with the optimum temperature to 37℃.The enzyme activity was only 20% when temperature was over 55℃.The small organic molecules of the reveral compounds of alcohol had a protective effect on the catalytic activity of the enzyme.The microenvironment of catalytic activity could be maintained by its own characteristics.

Sesuvium portulacastrum L.； Betaine aldehyde dehydrogenase； Prokaryotic expression； Enzyme activity assay

10.3724/SP.J.1006.2016.01569

本研究由國家農業(yè)科技成果轉化資金項目（2014GB2F200240）， 國家科技支撐計劃項目（2014BAD01B07）， 貴州省農業(yè)科學院自主創(chuàng)新專項［（2014）014］， 貴州省科研機構服務企業(yè)行動計劃項目黔科合服企［（2015）4001］， 貴州省科技廳重大專項［黔科合重大專項字（2013）6005］， 貴州省農業(yè)科學院專項［黔農科院院專項（2015）16］， 貴州省科技廳‘百層次’人才項目［黔科合人才（2015） 4018］和貴州省農業(yè)科學院人才團隊項目［黔農科合CR合字（2014）64］資助。

This study was supported by the National Agricultural Science and Technology Achievements Transformation Fund Project （2014GB2F200240），the National Key Technology Support Program of China （2014BAD01B07）， the Special Project of Independent Innovation Project［（2014）014］， the Project of Guizhou Province for Service Enterprise by Scientific Research Institution ［（2015）4001］， the Key Special Project for Guizhou Science and Cooperation ［（2013）6005］， the Special Project of Guizhou Academy of Agricultural Sciences ［（2015）16］， Guizhou Top 100 Talents Hierarchy Project of Science and Technology Department of Guizhou Province ［（2015）4018］， and the Talent Team Project of Guizhou Academy of Agricultural Sciences ［CR（2014）64］.

（Corresponding author）： 楊成龍， E-mail： yangchenglong208@163.com， Tel： 0859-3911295

聯(lián)系方式： E-mail： yushizhou2008@163.com

Received（）： 2016-02-19； Accepted（接受日期）： 2016-07-11； Published online（網絡出版日期）： 2016-07-28.

URL： http：//www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20160728.0817.022.html