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    食品中鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

    2016-10-18 06:03:28王亞楠王曉斐牛琳琳張海棠王自良
    食品科學(xué) 2016年18期
    關(guān)鍵詞:雜交瘤靈敏性膠體金

    王亞楠,王曉斐,牛琳琳,雷 壯,張海棠,王自良,*

    (1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    食品中鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

    王亞楠1,王曉斐2,牛琳琳1,雷壯1,張海棠1,王自良1,*

    (1.河南科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.河南科技學(xué)院新科學(xué)院,河南 新鄉(xiāng) 453003)

    目的:建立更加靈敏、特異的食品鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。方法:用1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(1-(4-isothiocyanobenzyl)ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid,iEDTA)鰲合鎘離子合成Cd2+-iEDTA半抗原,異硫氰酯法制備免疫原Cd2+-iEDTA-牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)和包被原Cd2+-iEDTA-雞卵清蛋白(ovalbumin,OVA),電感耦合等離子體發(fā)射光譜法和聚丙烯酰胺凝膠法進(jìn)行鑒定;用Cd2+-iEDTA-BSA免疫Balb/C小鼠,細(xì)胞融合技術(shù)篩選Cd2+-EDTA單克隆抗體(mAb)雜交瘤細(xì)胞株,體內(nèi)誘生腹水法制備Cd2+-EDTA mAb;應(yīng)用Cd2+-EDTA mAb建立Cd2+殘留膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法(Cd2+-Strip),并測(cè)定其性能。結(jié)果:免疫原偶聯(lián)成功,Cd2+-iEDTA-BSA中BSA與Cd2+的含量分別為7.1 mg/mL和191.7 μg/mL;篩選出1A3C11、2B7D8、2E10G9、4F3E7共4 株雜交瘤細(xì)胞,經(jīng)9 次傳代分泌抗體穩(wěn)定,親和力最高的2E10G9株親和常數(shù)(Ka)為7.58×108L/mol,對(duì)Cd2+-iEDTA的半數(shù)抑制濃度為16.3 μg/L,與Hg2+-EDTA的交叉反應(yīng)(cross-reaction,CR)率為18.6%,與其他重金屬離子無(wú)CR;Cd2+-Strip的檢測(cè)時(shí)間為10 min,檢出限為5 μg/L,其檢測(cè)結(jié)果與競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒(Cd2+ELISA-Kit)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法符合率為100%。結(jié)論:制備出了親和力高、特異性強(qiáng)的Cd2+mAb,建立了靈敏、特異、快速、簡(jiǎn)便的食品鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法。

    鎘離子;免疫原;單克隆抗體;膠體金免疫層析;快速檢測(cè)

    重金屬污染殘留給生態(tài)環(huán)境、食品安全和人類(lèi)健康帶來(lái)了嚴(yán)重危害,2012年發(fā)生在廣西的龍江河鎘污染事件[1]和2013年發(fā)生在湖南的大米鎘超標(biāo)事件[2],再次引發(fā)政府和社會(huì)對(duì)鎘污染的廣泛關(guān)注。鎘離子(Cd2+)對(duì)人體具有腎臟[3]、肝臟[4]、心血管[5]、神經(jīng)[6]、致癌[7]等多種毒性作用[8],已成為環(huán)境與食品污染的主要公害之一[9],聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織將Cd2+列為第3位食品安全重點(diǎn)監(jiān)控污染物[10],GB 2762—2005《食品中污染物限量》規(guī)定Cd2+最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn),大米不大于200 μg/kg,面粉、雜糧及肉類(lèi)不大于100 μg/kg,水果、鮮蛋不大于50 μg/kg。隨著檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展,目前已建立的檢測(cè)方法主要有火焰原子吸收法[11]、石墨爐原子吸收法[12]、電感耦合等離子體發(fā)射光譜(inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy,ICP-AES)法[13]、電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma mass spectrometry,ICPMS)法[14]等,但由于設(shè)備、技術(shù)、場(chǎng)地、成本等方面的制約,其應(yīng)用受到了限制。膠體金免疫層析(gold immunochromatography assay,GICA)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展成熟的一項(xiàng)新興檢測(cè)技術(shù),在食品安全快速檢測(cè)領(lǐng)域發(fā)揮了重要作用,適用于大量樣品篩檢及進(jìn)出口通關(guān)的快速檢測(cè)。國(guó)外Darwish[15]、Kazuhiro[16]等研制出了相關(guān)產(chǎn)品,國(guó)內(nèi)劉艷梅等[17]和本課題組成員張海棠等[18]研究報(bào)道了酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)方法,向軍儉等[19]報(bào)道了GICA檢測(cè)方法,檢出限較高為100 μg/kg,且與Hg2+有較強(qiáng)的交叉反應(yīng)(cross-reaction,CR)。本研究旨以篩選制備親和力高、特異性強(qiáng)的Cd2+mAb為切入點(diǎn),建立更加靈敏、特異的食品Cd2+污染殘留GICA檢測(cè)方法。

    1 材料與方法

    1.1材料與試劑

    Balb/C小鼠 鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院;鼠源NS0骨髓瘤細(xì)胞 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物免疫學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;CdCl2(純度99.9%) 美國(guó)Alfa Aesar公司;牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)、雞卵清蛋白(ovalbumin,OVA) 美國(guó)Pierce公司;1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(1-(4-isothiocyanobenzyl)ethylenediamine-N,N,N’,N’-tetraacetic acid,iEDTA)上海同仁化學(xué)研究所;免疫原Cd2+-iEDTA-BSA、包被原Cd2+-iEDTA-OVA、兔抗鼠二抗(rabit anti mouse immunoglobulin G,RaMIgG)、Cd2+檢測(cè)競(jìng)爭(zhēng)ELISA試劑盒(Cd2+ELISA-Kit) 本課題組制備;弗氏完全佐劑(complete freund’s adjuvant,CFA)、弗氏不完全佐劑(incomplete freund’s adjuvant,IFA) 美國(guó)Sigma公司;細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI-1640、HAT、HT、PEG-2000美國(guó)Gibco公司;氯金酸(HAuCl4·3H2O)、檸檬酸三鈉(Na3C6H5O7·2H2O) 美國(guó)Pierce公司;硝酸纖維素膜(nitrocellulose filter membrane,NC)、玻璃纖維棉、樣品墊 美國(guó)Millipore公司;其他試劑為分析級(jí);實(shí)驗(yàn)用水為去離子水。

    1.2儀器與設(shè)備

    DU800型紫外掃描儀 德國(guó)Beckman公司;Optima 2100DV型ICP-AES儀 美國(guó)PE公司;Multiskan MK3酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;H-600透射電鏡 日本Hitachi公司;JY-3000型電泳儀 北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;X-only單向噴點(diǎn)儀、CM4000切槽儀 美國(guó)Biodot公司。

    1.3方法

    1.3.1免疫原合成

    圖1 免疫原合成路線Fig.1 Synthesis scheme of immunogen Cd2+-iEDTA-BSA

    參照Kuang等[20]所述的異硫氰酯法加以改進(jìn)合成免疫抗原Cd2+-iEDTA-BSA,如圖1所示。

    1.3.2免疫原鑒定

    載體蛋白與Cd2+含量測(cè)定:紫外掃描儀在波長(zhǎng)278 nm處測(cè)定免疫原中BSA的濃度;ICP-AES測(cè)定Cd2+含量。

    聚丙烯酰胺凝膠(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)法鑒定:選擇5%濃縮膠,10%分離膠,濃縮膠電壓60 V,分離膠電壓90 V,考馬斯亮藍(lán)染色,水煮快速脫色。

    1.3.3Cd2+-EDTA mAb制備與特性分析

    1.3.3.1Cd2+-EDTA mAb制備

    選擇細(xì)胞融合小鼠:用Cd2+-iEDTA-BSA按正常程序免疫5 周齡雌性Balb/C小鼠5 只,免疫5 次,時(shí)間間隔4 周,最后1 次免疫后第21天斷尾采血分離血清,間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定其效價(jià)與靈敏性,選擇效價(jià)高且靈敏性好的小鼠用于細(xì)胞融合。

    細(xì)胞融合與雜交瘤細(xì)胞株的篩選:按常規(guī)方法將免疫脾細(xì)胞與NS0瘤細(xì)胞以1∶10比例混合,在500 mL/L PEG-1500作用下進(jìn)行融合、篩選和克隆化,待確定雜交瘤細(xì)胞已單克隆化,用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA進(jìn)行陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞篩選,建立細(xì)胞株,凍存于液氮備用。

    Cd2+-EDTA mAb制備:體內(nèi)誘生腹水法制備Cd2+-EDTA mAb,選擇經(jīng)產(chǎn)雌性Balb/C小鼠5 只,腹腔注射IFA 1 mL,12 d后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1×106個(gè)/只,10 d后待小鼠腹部明顯膨大即可收集腹水,飽和硫酸鹽法進(jìn)行純化。

    1.3.3.2Cd2+mAb特性分析

    穩(wěn)定性分析:將篩選出的3 株雜交瘤細(xì)胞分別于1、10、20、30、40、50、60、90、120 d和150 d復(fù)蘇、傳代、制備腹水Cd2+-EDTA mAb,間接ELISA測(cè)定腹水抗體效價(jià)以確定雜交瘤細(xì)胞分泌抗體的穩(wěn)定性。

    親和性分析:按照Nam等[21]所述Batty飽和法測(cè)定親和常數(shù)(Ka),按公式(1)計(jì)算:

    式中:Ka為親和常數(shù)/(L/mol);n為每組中2 個(gè)包被抗原濃度的稀釋倍數(shù);[Ab’] t和[Ab]t分別為每組中2 個(gè)50% Amax所對(duì)應(yīng)的抗體濃度,其中Ab’和Ab為抗體濃度/(mol/L);t為反應(yīng)溫度/℃。

    靈敏性分析:間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定Cd2+-EDTA mAb對(duì)Cd2+-EDTA的半數(shù)抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50),確定其靈敏性。

    特異性分析:間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定Cd2+-EDTA mAb對(duì)Pb2+、Hg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Fe3+、Cr3+、Al3+等金屬離子與EDTA的螯合物及EDTA的CR,按照公式(2)計(jì)算CR率。

    1.3.4Cd2+-Strip方法建立及性能測(cè)定

    1.3.4.1Cd2+-Strip方法建立

    膠體金的制備與鑒定:參照Daesub等[22]所述的檸檬酸鈉還原法制備膠體金,用紫外掃描及透射電鏡掃描,通過(guò)觀察其顏色及粒徑大小進(jìn)行鑒定。

    金標(biāo)抗體的制備及單抗最佳用量的確定:采用Mey氏系列穩(wěn)定法[23]制備金標(biāo)抗體,取酶標(biāo)板9 孔,每孔100 μL雙蒸水鋪底;第1孔加入質(zhì)量濃度為1 mg/mL的Cd2+-EDTA mAb 100 μL,之后進(jìn)行倍比至第8、9孔為空白對(duì)照(BC);每孔加入25 μL pH 8.5的膠體金溶液,室溫反應(yīng)10 min,加入100 g/L NaCl溶液100 μL,室溫反應(yīng)10 min,觀察顯色情況。對(duì)照孔與Cd2+-EDTA mAb量不足以穩(wěn)定金溶膠的各孔呈現(xiàn)由紅變藍(lán)的聚沉現(xiàn)象,而Cd2+-EDTA mAb量達(dá)到或超過(guò)最低穩(wěn)定量的各管仍保持紅色不變,選擇其中含Cd2+-EDTA mAb量最低的紅色孔即為1 mL膠體金所需的Cd2+-EDTA mAb的量,在此基礎(chǔ)上增加10%即為待標(biāo)Cd2+-EDTA mAb的最佳用量。

    金標(biāo)抗體玻璃纖維棉的制備:用1%的BSA含0.05%吐溫-20的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline,PBS)浸泡玻璃纖維棉,晾干,將金標(biāo)抗體用X-only單向噴點(diǎn)儀均勻噴灑于玻璃纖維棉上。

    NC膜的制備:X-only單向噴點(diǎn)儀將質(zhì)量濃度為1 mg/mL的免疫原Cd2+-iEDTA-BSA和質(zhì)量濃度為1 mg/mL的RaMIgG點(diǎn)射于NC膜中央,形成間距0.5 cm的檢測(cè)線(T線)和質(zhì)控線(C線),自然干燥,密封,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    免疫層析條件的優(yōu)化:檢測(cè)線(T線)Cd2+-iEDTABSA最佳工作質(zhì)量濃度的確定,分別將Cd2+-iEDTA-BSA稀釋為0.5、0.75、1.0、1.25、1.5 mg/mL系列質(zhì)量濃度,在NC膜上劃線,與同質(zhì)量濃度金標(biāo)抗體組裝成試紙條,添加100 μL雙蒸水進(jìn)行檢測(cè),比較T線隨質(zhì)量濃度變化試紙條的顯色情況和穩(wěn)定性;質(zhì)控線(C線)RaMIgG最佳工作質(zhì)量濃度的確定,同樣按上述方法進(jìn)行。

    試紙的組裝:在支持板上首先黏貼上NC膜和吸水紙,此后依次黏貼上金標(biāo)墊和樣品墊,之后用切條機(jī)裁割,最后干燥、封閉,4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    Cd2+-EDTA標(biāo)準(zhǔn)品制備與待測(cè)樣品預(yù)處理:由于所制備的Cd2+-EDTA mAb是針對(duì)鎘離子螯合物(Cd2+-EDTA)的,取等體積的Cd2+標(biāo)準(zhǔn)品溶液(1 000 μg/L)與EDTA(1 mol/L)混合,靜置10 min,使Cd2+螯合充分,之后用PBS稀釋成所需質(zhì)量濃度;液體樣品如水樣、尿樣、血液樣、牛奶樣等,在液體樣品中加入體積分?jǐn)?shù)10%物質(zhì)的量濃度為0.1 mol/L的EDTA鰲合劑,混合反應(yīng)30 min,使Cd2+與EDTA充分鰲合,5 000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行檢測(cè);固體樣品如土壤樣、飼料樣、組織樣等,稱(chēng)取固體樣品1.0 g于50 mL容量瓶?jī)?nèi),加入1 mL水浸潤(rùn)后加入混酸溶液6 mL(3 mL濃磷酸和3 mL濃硫酸),加熱至冒白煙,冷卻后加入0.5 mL濃硝酸,繼續(xù)加熱至固體樣品變白色、消解液呈黃綠色,用水沖洗,全部轉(zhuǎn)移入50 mL離心管內(nèi),5 000 r/min離心10 min,將上清液移入50 mL容量瓶中,加入10 mL濃度為0.1 mol/L的EDTA鰲合劑溶液,混合反應(yīng)30 min,定容至50 mL,5 000 r/min離心10 min,取上清液進(jìn)行檢測(cè)。

    1.3.4.2Cd2+-Strip性能測(cè)定

    靈敏性:用PBS配制1 000 μg/L的Cd2+溶液與1 mol/L的EDTA等體積混合,得到質(zhì)量濃度為500 μg/L的Cd2+-EDTA溶液,用PBS稀釋?zhuān)渲平K質(zhì)量濃度分別為160.0、80.0、40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.0 μg/L和0 μg/L的Cd2+-EDTA標(biāo)準(zhǔn)溶液,用于Cd2+-Strip測(cè)定,根據(jù)測(cè)定結(jié)果判斷其靈敏性。實(shí)際檢測(cè)時(shí),將樣品加到Cd2+-Strip樣本墊上,室溫反應(yīng)10 min,觀察顯色結(jié)果。結(jié)果判定方法:T、C線均顯示紅色,樣品呈陰性;T線不顯示紅色、C線顯示紅色,則呈陽(yáng)性;T、C線均不顯示紅色,則表面檢測(cè)卡失效。

    穩(wěn)定性:取不同批次的6 批Cd2+-Strip,分別在6 d對(duì)Cd2+-EDTA質(zhì)量濃度為1.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的水樣、面粉樣、豬肉樣進(jìn)行檢測(cè),檢驗(yàn)其穩(wěn)定性。

    特異性:用PBS分別配制質(zhì)量濃度為1 000 μg/L的Pb2+、Hg2+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Mg2+、Ni2+、Fe3+、Cr3+、Al3+標(biāo)準(zhǔn)品溶液,與1 mol/L的EDTA等體積混合,用PBS分別稀釋至0、100、200、400、800、1 600 μg/L,用Cd2+-Strip進(jìn)行測(cè)試,10 min后觀察顯色情況。

    實(shí)際應(yīng)用與復(fù)核實(shí)驗(yàn):課題組分別從河南省新鄉(xiāng)市、焦作市、安陽(yáng)市采集水樣98 份、面粉樣36 份、豬肉樣16 份,用Cd2+-Strip、Cd2+ELISA-Kit和ICP-AES進(jìn)行檢測(cè),測(cè)定其準(zhǔn)確率。

    2 結(jié)果與分析

    2.1免疫原鑒定

    2.1.1BSA與Cd2+含量測(cè)定

    紫外掃描儀于波長(zhǎng)278 nm處測(cè)定Cd2+-iEDTA-BSA中BSA的質(zhì)量濃度為7.1 mg/mL;ICP-AES測(cè)定其Cd2+含量為191.7 μg/mL,結(jié)果說(shuō)明成功制備了免疫原。

    2.1.2SDS-PAGE鑒定

    圖2 Cd2+-iEDTA-BSA的SDS-PAGE凝膠電泳圖Fig.2 SDS-PAGE electrophoresis of Cd2+-iEDTA-BSA

    如圖2所示,Marker、BSA與Cd2+-iEDTA-BSA的電泳條帶清晰,且BSA遷移距離明顯大于免疫原Cd2+-iEDTA-BSA,說(shuō)明Cd2+-iEDTA-BSA的分子質(zhì)量大于BSA,證明成功制備了免疫原。

    2.2Cd2+mAb制備

    2.2.1細(xì)胞融合小鼠選擇

    圖3 抗Cd的靈敏性測(cè)定(B)Fig.3 Titer (A) and sensitivity measurement (B) of anti-Cd2+pAb against Cd2+in serum2+多抗血清效價(jià)測(cè)定(A)、對(duì)Cd2+

    如圖3所示,5只免疫小鼠血清多克隆抗體(pAb)效價(jià)均達(dá)到了1∶(1×104),且4號(hào)小鼠效價(jià)最高達(dá)到了1∶(5.12×104),靈敏性也最好,IC50為26.7 μg/L,選用4號(hào)小鼠進(jìn)行細(xì)胞融合。

    2.2.2雜交瘤細(xì)胞株的建立

    融合細(xì)胞經(jīng)3 次克隆化后陽(yáng)性率達(dá)100%,間接ELISA分別測(cè)定其IC50,篩選出4 株雜交瘤,分別命名為1A3C11、2B7D8、2E10G9、4F3E7。

    2.3Cd2+mAb特性分析

    2.3.1穩(wěn)定性分析

    圖4 細(xì)胞傳代腹水抗體效價(jià)變化Fig.4 The indirect ELISA titer of mAb secreted by hybridomas continually in ascites

    如圖4所示,經(jīng)10 次凍存及復(fù)蘇,9 次傳代,雜交瘤分泌抗體穩(wěn)定,腹水抗體效價(jià)均達(dá)到了105以上。

    2.3.2親和性分析

    圖5 親和力測(cè)定Fig.5 Affinity measurement of anti-Cd2+-EDTA mAb

    如圖5所示,1A3C11、2B7D8、2E10G9、4F3E7的Ka分別為1.01×108、1.29×107、7.58×108、1.87×108L/mol,均為高親和力抗體[24],其中2E10G9的親和力最高。

    2.3.3靈敏性分析

    圖6 靈敏性測(cè)定Fig.6 Sensitivity measurement of anti-Cd2+-EDTA mAb

    如圖6所示,抑制曲線的回歸方程為y=-39.991x+ 98.476,由此可計(jì)算出親和力最高的2E10G9株所產(chǎn)生的Cd2+-EDTA mAb對(duì)Cd2+-EDTA的IC50為16.6 μg/L,為高靈敏性抗體。

    2.3.4特異性分析

    表1 Cd2+-EDTA mAb CR率測(cè)定Table1 Cross-reactivity measurement of anti-Cd2+-EDTA mAb

    如表1所示,Cd2+-EDTA mAb對(duì)Cd2+-EDTA的IC50為16.3 μg/L,對(duì)Hg2+-EDTA的IC50為87.63 μg/L,CR率為18.6%,對(duì)EDTA與其他類(lèi)似化合物CR率均小于0.9%,對(duì)Cd2+-EDTA的檢測(cè)基本不存在干擾現(xiàn)象。結(jié)果表明,本實(shí)驗(yàn)制備的Cd2+-EDTA mAb可特異性識(shí)別結(jié)合Cd2+-EDTA。

    2.4膠體金質(zhì)量鑒定

    2.4.1紫外掃描鑒定

    圖7 膠體金紫外掃描圖Fig.7 Absorption spectrum of colloidal gold

    如圖7所示,膠體金的最大吸收峰(λmax)位于523.8 nm,最大吸光度(Amax)為0.984,根據(jù)Zhou等[25]的研究結(jié)果,膠體金粒徑為25 nm。

    2.4.2透射電鏡掃描鑒定

    圖8 膠體金電鏡掃描結(jié)果Fig.8 Scanning electron microscopic observation of colloidal gold

    如圖8所示,所制備的膠體金在透射電鏡下分布均勻,形狀規(guī)則,隨機(jī)測(cè)量100 個(gè)顆粒,粒徑在(25±1.0)nm,與紫外掃描結(jié)果基本一致。

    2.5金標(biāo)抗體單抗最佳用量的確定

    如表2所示,Cd2+-EDTA mAb與膠體金標(biāo)記的適宜質(zhì)量濃度為6.25 μg/mL,在此基礎(chǔ)上增加10%,Cd2+-EDTA mAb最佳標(biāo)記質(zhì)量濃度為7.0 μg/mL膠體金。

    2.6Cd2+-Strip性能測(cè)定

    2.6.1靈敏性測(cè)定

    表3 Cd2+-Strip靈敏度測(cè)定(n=6)Table3 Sensitivity of Cd2+-Strip (n= 6)

    由表3可知,Cd2+-Strip的檢出限為5 μg/L。

    2.6.2穩(wěn)定性測(cè)定

    表4 Cd-Strip穩(wěn)定性測(cè)定(n=6)Table4 Stability measurement of Cd2+-Strip (n= 6)

    如表4所示,不同批次的6 批Cd2+-Strip對(duì)水樣、面粉樣、豬肉樣進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定,檢測(cè)結(jié)果完全一致,說(shuō)明Cd2+-Strip的穩(wěn)定性和重復(fù)性好。

    2.6.3特異性測(cè)定

    用Cd2+-Strip測(cè)定不同金屬離子與EDTA螯合物反應(yīng)情況,結(jié)果表明,除與Hg2+在質(zhì)量濃度達(dá)到400 μg/L時(shí)有輕微CR外,與其他化合物無(wú)CR。

    2.6.4符合性測(cè)定

    如表5所示,發(fā)現(xiàn)98 份水樣中陽(yáng)性1 份,36 份面粉樣中陽(yáng)性3 份,16 份豬肉樣中陽(yáng)性1 份,3 種檢測(cè)方法結(jié)果完全一致;6 份陽(yáng)性樣品用Cd2+-Strip半定量測(cè)定,用Cd2+ELISA-Kit和ICP-AES定量測(cè)定,Cd2+-Strip與Cd2+ELISA-Kit、ICP-AES的靈敏性相當(dāng),符合率為100%。

    表5 Cd2+-Strip與Cd2+ELISA-Kit和ICP-AES檢出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的比較Table5 Results of parallel test of Cd2+-Strip and ELISA-kit

    3 討 論

    3.1關(guān)于Cd2+mAb的質(zhì)量性能

    靈敏性是由抗體與其對(duì)應(yīng)抗原反應(yīng)的親和力大小所決定的,實(shí)驗(yàn)所用2E10G9株雜交瘤細(xì)胞所分泌Cd2+-EDTA mAb的Ka為7.58×108L/mol,為高親和力抗體。特異性是由抗體分子超變區(qū)空間結(jié)構(gòu)與抗原決定簇之間的互補(bǔ)性決定的,本研究用iEDTA螯合Cd2+制備免疫原Cd2+-iEDTA-BSA,通過(guò)改變離子半徑、空間構(gòu)象來(lái)提高抗體特異性,用CR實(shí)驗(yàn)進(jìn)行鑒定,Cd2+直徑為0.203 nm,與Hg2+的直徑僅相差0.035 nm,Cd2+-EDTA與Hg2+-EDTA的空間結(jié)構(gòu)相差小于0.02 nm,因此Cd2+-EDTA與Hg2+-EDTA三維結(jié)構(gòu)相似,因而兩者具有輕微的CR,此結(jié)果與Sreepriya[24]、Jones[26]等研究結(jié)果一致。

    3.2關(guān)于Cd2+-Strip的質(zhì)量性能

    本研究采用檸檬酸鈉還原法制備膠體金,并采用紫外掃描、透射電鏡掃描進(jìn)行鑒定,粒徑為25 nm,形狀規(guī)則,分布均勻,物理吸附抗體能力強(qiáng),減少了非特異性反應(yīng)。采用Mey氏系列穩(wěn)定法標(biāo)記抗體,篩選確定了最適標(biāo)記濃度,提高了抗體反應(yīng)的穩(wěn)定性。NC膜上的T線和C線是抗原抗體反應(yīng)的所在部位,其孔徑規(guī)格、黏附抗原抗體蛋白質(zhì)能力及檢測(cè)樣品在NC膜上的遷移速率影響試紙質(zhì)量,經(jīng)多次實(shí)驗(yàn),本研究選擇帶有背襯的AE180NC膜用于黏附Cd2+-iEDTA-BSA和RaMIgG,提高了反應(yīng)的特異性,顯色結(jié)果明顯。

    4 結(jié) 論

    本研究采用分子交聯(lián)技術(shù)成功合成Cd2+免疫原CdiEDTA-BSA,應(yīng)用細(xì)胞融合技術(shù)研制出高效價(jià)、高親和力、特異性強(qiáng)的Cd2+mAb,采用膠體金標(biāo)記抗體模式,成功建立了食品Cd2+污染殘留膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法,Cd2+-Strip具有快速(10 min)、靈敏(5 μg/L)、特異(除與Hg2+的CR率為18.6%,與其他重金屬離子無(wú)CR)、簡(jiǎn)便(不需要任何儀器與附加試劑)的優(yōu)點(diǎn),具有廣闊的市場(chǎng)前景和應(yīng)用價(jià)值。

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    Establishment and Preliminary Application of Colloidal Gold Immunochromatography for Detecting Heavy Metal Cadmium Ion in Foods

    WANG Yanan1, WANG Xiaofei2, NIU Linlin1, LEI Zhuang1, ZHANG Haitang1, WANG Ziliang1,*
    (1. College of Animal Science and Veterinary Medicine, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China;2. Xinke College, Henan Institute of Science and Technology, Xinxiang 453003, China)

    Objective: To establish a colloidal gold immunochromatographic assay (Cd2+-Strip) for detecting Cd2+residues in foods. Methods: Artificial hapten Cd2+-iEDTA was synthesized by using isotrhiocyanobenzyl-EDTA (iEDTA) to chelate Cd2+. The isothiocyanate method was used to conjugate Cd2+-iEDTA to BSA to obtain the artificial immunogen Cd2+-iEDTA-BSA. The coating antigen Cd2+-iEDTA-OVA was obtained in the same way. Both ICP-AES and SDS-PAGE were used to identify Cd2+-iEDTA-BSA. Balb/C mice were immunized with Cd2+-iEDTA-BSA and hybridoma lines that secreted anti-Cd2+-EDTA monoclonal antibody (mAb) were generated by cell fusion. A Cd2+test strip was established with Cd2+-EDTA mAb and its traits were tested. Results: Cd2+-iEDTA-BSA was synthesized successfully and its concentration of BSA and Cd2+was 7.1 mg/mL and 191.7 μg/mL respectively. Four hybridoma lines, namely 1A3C11, 2B7D8, 2E10G9,4F3E7, were screened out and 2E10G9 was found to be the best one. The dissociation constant (Ka) of 2E10G9 was 7.58 × 108L/mol and its sensitivity (IC50) was 16.3 μg/L, and it had little or no cross-reactivity with other metal ions, except for Hg2+-EDTA with 18.6%. The qualitative detection of Cd2+with the Cd2+test strip could be achieved in 10 minutes, with a limit of detection (LOD) of 5 μg/L. Its sensitivity was the same as that of competitive ELISA-Kit (Cd2+ELISA-Kit) and inductively coupled plasma atomic emission spectrometry (ICP-AES), and its coincidence rate was 100% as compared with Cd2+ELISA-Kit and ICP-AES. Conclusion: The high affinity and specificity Cd2+-EDTA mAb has successfully beengenerated and used to establish a Cd2+test strip with high sensitivity, specificity, rapidity and briefness. The test strip can be used for the rapid detection of Cd2+residues in foods.

    cadmium ion; immunogen; monoclonal antibody; colloidal gold immunochromatographic assay; rapid detection

    10.7506/spkx1002-6630-201618025

    R392.33

    A

    1002-6630(2016)18-0152-07

    王亞楠, 王曉斐, 牛琳琳, 等. 食品中鎘離子膠體金免疫層析快速檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(18): 152-158. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618025. http://www.spkx.net.cn

    WANG Yanan, WANG Xiaofei, NIU Linlin, et al. Establishment and preliminary application of colloidal gold immunochromatography for detecting heavy metal cadmium ion in foods[J]. Food Science, 2016, 37(18): 152-158. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618025. http://www.spkx.net.cn

    2016-03-13

    “十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAK10B01;2014BAD13B05)

    王亞楠(1989—),女,碩士研究生,研究方向?yàn)槭称钒踩庖邫z測(cè)。E-mail:792176339@qq.com

    王自良(1966—),男,教授,博士,研究方向?yàn)槊庖邔W(xué)與抗體工程。E-mail:wangziliang66@126.com

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