響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取山杏種皮黑色素工藝及其抗氧化活性

李紅姣，李巨秀*，趙　忠*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，西部環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，陜西 楊凌 712100；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取山杏種皮黑色素工藝及其抗氧化活性

李紅姣1，2，李巨秀3，*，趙忠1，*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，西部環(huán)境與生態(tài)教育部重點實驗室，陜西 楊凌 712100；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河北 保定 071000；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100）

以山杏種皮黑色素得率為考察指標(biāo)，在單因素試驗的基礎(chǔ)上采用Box-Behnken方法，通過響應(yīng)面設(shè)計優(yōu)化超聲波輔助提取山杏種皮黑色素的工藝，并對山杏種皮黑色素的自由基清除能力、螯合金屬離子能力、抗脂質(zhì)過氧化等抗氧化活性進行了測定。結(jié)果表明，提取溫度、料液比、NaOH濃度這3 個因素對提取效果均有顯著影響（P＜0.05），超聲波輔助提取山杏種皮黑色素的最優(yōu)工藝為NaOH濃度0.33 mol/L、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度63.07 ℃，山杏種皮黑色素得率可達4.14%。山杏種皮黑色素具有較強的螯合金屬離子的能力，對羥自由基也有一定的清除作用，能顯著抑制大鼠肝臟自發(fā)性以及H2O2和Fe2+-VC誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，但鐵還原能力、體外清除1，1-二苯基-2-苦肼基（DPPH）自由基和2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（ABTS+·）的能力較弱。

超聲波輔助提??；山杏種皮；黑色素；響應(yīng)面法；抗氧化

黑色素普遍存在于生物界，是一類結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣的酚類或吲哚類生物大分子色素的總稱［1］，在醫(yī)藥、化妝品、食品、電子等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景［2］。目前，黑色素既可以通過酪氨酸或其衍生物的氧化進行化學(xué)合成，也可以從動植物材料中提取，還可以利用微生物合成［3-4］。姚增玉［5］從山杏種皮中提取出了黑色素，得率達到4.73%，而李巨秀等［6］將山杏種皮黑色素得率提高到了7.2%。相比而言，植物黑色素安全性較高，應(yīng)用范圍更廣。

天然黑色素是黑色食品中的主要活性成分［7］，具有抗氧化、延緩衰老、增強免疫力、促進造血功能、保護心血管、抗動脈粥樣硬化等功能特性［8-13］，可開發(fā)成保健食品或食品添加劑等。黑色素能有效地清除活性氧自由基［14］，這是其保護生物大分子如 DNA免受氧化損傷的重要原因。筆者前期研究［15-16］證明山杏種皮黑色素能有效抵抗紫外輻照和抑制晚期糖基化終末產(chǎn)物的形成，防止相關(guān)疾病的發(fā)生。這些都與黑色素的抗氧化活性有關(guān)。因此研究黑色素的抗氧化特性，對黑色素的開發(fā)有現(xiàn)實的指導(dǎo)意義。

超聲波輔助提取法應(yīng)用超聲波強化提取植物的有效成分，是一種物理破碎過程，其原理主要是利用超聲空化等性質(zhì)增大物質(zhì)分子運動頻率和速率，增加溶劑穿透力，提高有效成分的溶出速度和溶出次數(shù)，同時超聲波的熱效應(yīng)使水溫基本在60 ℃左右，對原料有水浴作用，縮短了提取時間，具有提取時間短、提出率高、低溫提取有利于保護有效成分等優(yōu)點［17］。

本研究采用響應(yīng)面法優(yōu)化山杏種皮中黑色素的提取工藝，并分別通過測定山杏種皮黑色素清除1，1-二苯基-2-苦肼基（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基能力、清除2，2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate），ABTS）自由基（ABTS+·）能力、鐵還原能力、金屬離子螯合能力和清除羥自由基的能力，分析山杏種皮黑色素的體外抗氧化活性；建立肝組織勻漿-脂質(zhì)過氧化模型，研究山杏種皮黑色素的抗脂質(zhì)過氧化活性。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

山杏仁產(chǎn)自甘肅平?jīng)?，手工去皮，自然條件下風(fēng)干備用。

抗壞血酸、DPPH、2，4，6-三（2-吡啶）-1，3，5-三嗪（2，4，6-tri（2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ）、ABTS、合成黑色素 美國Sigma公司；Trolox 美國Cayman公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設(shè)備

FA-1004型電子天平 上海精科天平有限公司；KQ-500DE型超聲波清洗機 舒美昆山市超聲波儀器有限公司；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋、85-2型恒溫磁力攪拌器 國華電器有限公司；DZF型真空干燥箱 北京科偉永興儀器有限公司；PHS-3C型酸度計 方舟科技有限公司；SC-3610型低速離心機 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；424 UV1101型分光光度計、F-4500 FL型熒光光譜儀 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1山杏種皮黑色素的提取

黑色素的提取流程見圖1。

圖1　山杏種皮黑色素提取工藝流程圖Fig.1　Flow chart for the extraction process of MTWA

1.3.2超聲輔助提取山杏種皮黑色素的單因素試驗

分別考察了提取劑NaOH濃度、料液比、超聲波功率、提取時間和提取溫度對黑色素得率的影響。以山杏種皮黑色素得率作為考察指標(biāo)，確定5 個因素的適宜范圍。

1.3.3響應(yīng)面法對超聲輔助提取山杏種皮黑色素工藝的優(yōu)化

根據(jù)Box-Behnken設(shè)計原理和單因素試驗結(jié)果，選擇提取溫度、料液比和NaOH濃度3個因素，以黑色素得率為響應(yīng)值設(shè)計了三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗。Box-Behnken試驗因素及水平設(shè)計見表1。

表1　響應(yīng)面分析因素與水平Table1　Factors and levels used for RSA

1.3.4黑色素溶液的配制

將100 mg純化干燥后的山杏種皮黑色素和合成黑色素用50 mL質(zhì)量分數(shù)0.2%的氨水在氮氣保護下超聲輔助溶解，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓抽去氨氣，直至pH值達7.5，最后用去離子水稀釋至所需質(zhì)量濃度。

1.3.5DPPH自由基清除能力的測定

分別取1 mL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)液，與4.5 mL100 μmol/L的DPPH甲醇溶液，充分混勻，避光靜置30 min后，用無水甲醇調(diào)零，在517 nm波長條件下測其吸光度，重復(fù)3 次，以Trolox濃度為橫坐標(biāo)，清除率為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。用不同濃度的山杏種皮黑色素溶液和合成黑色素的溶液代替Trolox，實驗方法與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，計算對DPPH自由基的清除率，從而計算相對應(yīng)的Trolox當(dāng)量。其中，對照組用無水甲醇代替DPPH甲醇溶液，空白組用蒸餾水代替黑色素溶液。按公式（1）計算DPPH自由基清除率：

式中：A2為對照組吸光度；A1為實驗組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.6鐵還原能力的測定

取1 mL不同濃度的FeSO4溶液，與4.5 mL TPTZ工作液混合，旋渦振蕩后，置于避光處37 ℃反應(yīng) 10 min，用水調(diào)零，在593 nm波長條件下測定吸光度，重復(fù)3 次，以FeSO4溶液濃度為橫坐標(biāo)，以鐵還原力為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用不同濃度的山杏種皮黑色素溶液和合成黑色素的溶液代替FeSO4溶液，實驗方法與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，計算相對應(yīng)的FeSO4當(dāng)量。其中，對照組用蒸餾水代替TPTZ工作液，空白組用蒸餾水代替黑色素溶液。按公式（2）計算鐵還原能力：

式中：A2為對照組吸光度；A1為實驗組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.7ABTS+·清除能力的測定

取1 mL不同濃度的Trolox標(biāo)準(zhǔn)液與4.5 mL ABTS工作液，漩渦振蕩后，室溫避光反應(yīng)6 min，用無水乙醇調(diào)零，在734 nm波長條件下測其吸光度，重復(fù)3 次，以Trolox標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)，ABTS+·清除率為縱坐標(biāo)，制作相關(guān)曲線。用不同濃度的山杏種皮黑色素溶液和合成黑色素的溶液代替Trolox，實驗方法與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，計算相對應(yīng)的Trolox當(dāng)量。其中，對照組用無水乙醇代替ABTS工作液，空白組用蒸餾水代替黑色素溶液。按公式（3）計算ABTS+·清除率：

式中：A2為對照組吸光度；A1為實驗組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.8螯合金屬能力的測定

取1 mL不同濃度的EDTA溶液，與3.7 mL無水甲醇，振蕩混勻，加入0.1 mL 2 mmol/L的FeCl2溶液，混勻，30 s后加入0.2 mL 5 mmol/L的菲啰嗪，避光反應(yīng)20 min，562 nm波長條件下測吸光度，重復(fù)3 次，以EDTA濃度為橫坐標(biāo)，金屬離子螯合能力為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用不同濃度的山杏種皮黑色素溶液和合成黑色素的溶液代替EDTA，實驗方法與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同，計算山杏種皮黑色素溶液和合成黑色素的溶液的螯合金屬離子的能力，從而計算相對應(yīng)的EDTA當(dāng)量。其中，對照組用蒸餾水代替FeCl2溶液和菲啰嗪，空白組用蒸餾水代替黑色素溶液。按公式（4）計算金屬離子螯合能力：

式中：A2為對照組吸光度；A1為實驗組吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.9羥自由基清除能力測定

在10 mL的比色管中依次分別加入5.00 mL pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液、0.3 mL 1.14 mmol/L CuSO4溶液、1.20 mL 0. 925 mmol/L苯甲酸和1.00 mL 97 μmol/L VC溶液，稀釋至刻度并搖勻，在室溫條件下放置90 min。在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為294 nm和414 nm條件下測定相對熒光強度［18］，以此分析羥自由基清除能力。

1.3.10山杏種皮黑色素抑制脂質(zhì)過氧化活性作用

1.3.10.1 山杏種皮黑色素對自發(fā)性肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用

參考皮建輝等［19］的方法，稍作改進。健康小鼠禁食過夜后脫頸錐處死，迅速取出肝臟組織，置于預(yù)冷的生理鹽水中沖洗后，冰浴研磨制成5%組織勻漿，取肝臟勻漿1.5 mL分裝于試管中，向各反應(yīng)試管中分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的山杏種皮黑色素溶液0.1 mL（對照組用生理鹽水代替），用生理鹽水補充至總體積2 mL，混勻后37℃水浴中振蕩溫育，啟動肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，當(dāng)反應(yīng)120 min后，各試管中加入1.5 mL 20%三氯乙酸終止反應(yīng)。3 500 r/min離心10 min，取上清液2 mL，加入1.5 mL 0.67%硫代巴比妥酸，95℃水浴15 min顯色，取出冷卻至室溫，測定其532 nm波長處的吸光度。吸光度越大表明丙二醛的生成越多，脂質(zhì)過氧化反應(yīng)越強烈。

1.3.10.2 山杏種皮黑色素對H2O2誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用

取肝臟勻漿1.5 mL分裝于試管中，向各反應(yīng)試管中分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的山杏種皮黑色素溶液0.1 mL（對照組用生理鹽水代替），在體系中加入H2O250 μL，用生理鹽水補充至總體積2 mL，混勻后37 ℃水浴中振蕩溫育，誘導(dǎo)啟動肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，后續(xù)測定方法同1.3.10.1節(jié)。

1.3.10.3 山杏種皮黑色素對Fe2+-VC誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的抑制作用

取肝臟勻漿1.5 mL分裝于試管中，向各反應(yīng)試管中分別加入0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L的山杏種皮黑色素溶液0.1 mL（對照組用生理鹽水代替），在體系中加入終濃度分別為1、10 mmol/L的FeSO4·7H2O和VC溶液總共50 μL，用生理鹽水補充至總體積2 mL，混勻后37 ℃水浴中振蕩溫育，誘導(dǎo)啟動肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，后續(xù)測定方法同1.3.10.1節(jié)。

1.4統(tǒng)計分析

采用Excel 2010軟件統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)表示方式為“±s”。采用單因素Duncan法進行多重比較，以SPSS 18.0軟件進行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

圖2　超聲波功率對山杏種皮黑色素得率的影響Fig.2　Effect of ultrasonic power on melanin yield

2.1.1超聲波功率對山杏種皮黑色素得率的影響由圖2可以看出，黑色素得率隨著超聲波功率的增大而增大。在超聲波功率為500 W（100%）時有最大值。這可能是由于超聲波對細胞膜的破壞作用隨著功率的增大而增大，溶出物增多，功率增大不會使提取物中部分黑色素結(jié)構(gòu)顯著破壞，因此選500 W為后續(xù)試驗條件。

2.1.2料液比對山杏種皮黑色素得率的影響

圖3　料液比對山杏種皮黑色素得率的影響Fig.3　Effect of solid-to-solvent ratio on melanin yield

由圖3可看出，料液比對山杏種皮黑色素得率有顯著的影響，黑色素得率隨著溶劑用量的增大而逐步增大，到1∶15（g/mL）時黑色素得率達到最大值，因此，選擇1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）作為進一步試驗的提取料液比。

2.1.3NaOH濃度對山杏種皮黑色素得率的影響

由圖4可以看出，NaOH濃度對黑色素得率有顯著影響，隨著NaOH濃度的增大，黑色素得率也不斷增大，當(dāng)NaOH濃度增大到0.3 mol/L時取得最大值，此后黑色素得率隨著NaOH濃度的增大而減小，可能是由于當(dāng)NaOH濃度過高時，山杏種皮黑色素的生物活性受到破壞，而且還會帶來不必要的能源損耗。綜合考慮，選擇0.2、0.3、0.4 mol/L作為后續(xù)優(yōu)化試驗條件。

圖4　NaOH濃度對山杏種皮黑色素得率的影響Fig.4　Effect of sodium hydroxide concentration on melanin yield

2.1.4提取時間對山杏種皮黑色素得率的影響

圖5　提取時間對山杏種皮黑色素得率的影響Fig.5　Effect of extraction time on melanin yield

由圖5可以看出，提取時間在3 h內(nèi)黑色素得率隨時間延長而增加的較快，可能是隨時間延長黑色素溶解出來更多。3 h之后增大速率變小，可能是時間過長溶解出來的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多，或者提取時間過長超聲波作用會使提取物中部分黑色素的結(jié)構(gòu)受破壞。

2.1.5提取溫度對山杏種皮黑色素得率的影響

圖6　提取溫度對山杏種皮黑色素得率的影響Fig.6　Effect of extraction temperature on melanin yield

由圖6可以看出，當(dāng)提取溫度升高時，得率升高，但超過70 ℃后，得率增加不大，而且溫度升得過高不但會導(dǎo)致成本增加還會造成色素降解。為確定多條件下綜合作用時的最佳提取條件選擇45、60、75 ℃作為優(yōu)化試驗條件。

2.2響應(yīng)面試驗結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選擇提取溫度、料液比和NaOH濃度3 個因素，共17 個試驗點的響應(yīng)面分析試驗，試驗設(shè)計與結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表2　響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table2　Program and experimental results of RSA

表3　回歸方程方差分析結(jié)果Table3　Analysis of variance of regression equation

由表3可知，模型的P值小于0.05，失擬項P＞0.05，不顯著，說明模型擬合良好，試驗誤差小，可以用來預(yù)測各因素對黑色素得率的影響。根據(jù)表3中各因素P值的大小可知，提取溫度、料液比和NaOH濃度對黑色素提取影響均達到P＜0.05的顯著水平，且顯著性大小為NaOH濃度＞料液比＞提取溫度，NaOH濃度的二次項對黑色素的提取也存在極顯著影響。建立二次響應(yīng)面回歸模型，經(jīng)回歸擬合后，各試驗因素對響應(yīng)值的影響可用以下函數(shù)表示：

Y=-3.81+0.19A-0.25B+0.36C+0.125AB-0.01AC+ 0.05BC-0.15A2+0.04B2-0.54C2

山杏種皮中黑色素超聲波輔助提取的優(yōu)化條件為：取10.00 g山杏種皮原料，NaOH濃度0.33 mol/L、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度63.07 ℃。山杏種皮黑色素得率可達4.14%。

2.3山杏種皮黑色素的抗氧化活性

2.3.1DPPH自由基的清除能力

圖7　山杏種皮黑色素對DPPH自由基清除能力Fig.7　DPPH radical scavenging ability of melanins

由圖7可知，隨著黑色素質(zhì)量濃度的增大，清除DPPH自由基的Trolox當(dāng)量也隨之增大。山杏種皮黑色素和合成黑色素清除DPPH自由基的IC50分別為33.13 mg/L和8.88 mg/L，Trolox當(dāng)量分別為2.72、10.14 μmol/mg。與合成黑色素相比，山杏種皮黑色素對DPPH自由基的清除活性較低，這與姚增玉等［20］的研究結(jié)果一致。

2.3.2鐵還原能力

圖8　山杏種皮黑色素的鐵還原能力Fig.8　Ferric reducing ability of melanins

由圖8可知，隨著黑色素質(zhì)量濃度的增大，鐵還原能力的FeSO4當(dāng)量也隨之增大。山杏種皮黑色素和合成黑色素鐵還原力的IC50分別為18.85 mg/L和4.87 mg/L，F(xiàn)eSO4當(dāng)量分別為7.74、29.95 μmol/mg。與合成黑色素相比，山杏種皮黑色素鐵還原力較低，姚增玉等［20］也報道了山杏種皮黑色素鐵還原能力比2，6-二叔丁基對甲酚（butylated hydroxytoluene，BHT）和VC弱。

2.3.3ABTS+·的清除能力

由圖9可知，隨著黑色素質(zhì)量濃度的增大，清除ABTS+·的Trolox當(dāng)量也隨之增大。山杏種皮黑色素和合成黑色素清除ABTS+·的IC50分別為11.29 mg/L和3.67 mg/L，Trolox當(dāng)量分別為5.99、18.44 μmol/mg。與合成黑色素相比，山杏種皮黑色素對ABTS+·的清除活性較低，即其抗氧化活性較弱。

圖9　山杏種皮黑色素對ABTS+·清除能力Fig.9　ABTS+· scavenging ability of melanins

2.3.4螯合金屬離子能力

圖10　山杏種皮黑色素對金屬離子螯合能力Fig.10　Metal-chelating ability of melanins

由圖10可知，隨著黑色素質(zhì)量濃度的增大，螯合金屬離子的EDTA當(dāng)量也隨之增大。山杏種皮黑色素和合成黑色素螯合金屬離子的IC50分別為18.43 mg/L和50.83 mg/L，EDTA當(dāng)量分別為2.71、0.98 μmol/mg。與合成黑色素相比，山杏種皮黑色素對金屬離子的螯合能力較高。較強的螯合金屬離子的能力，這預(yù)示著在生物體內(nèi)它可以清除重金屬和過渡金屬離子的毒害［21］，在工業(yè)方面可用于提取重金屬以及污染治理。

2.3.5羥自由基清除活性

羥自由基是一種活性較強、危害較大的活性氧自由基，在生物體內(nèi)能與蛋白質(zhì)、DNA、脂類糖類等發(fā)生反應(yīng)，破壞這些物質(zhì)的功能［22］。由圖11可見，苯甲酸本身沒有熒光（曲線1），苯甲酸在VC和Cu2+的作用下產(chǎn)生羥基苯甲酸，在pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液中，羥基化苯甲酸有一激發(fā)波長296 nm、發(fā)射波長414 nm的熒光峰（曲線2）［18］，由于山杏種皮黑色素對羥自由基的清除使得熒光強度下降（曲線3），并且隨著山杏種皮黑色素質(zhì)量濃度的增大，熒光強度減小，表明山杏種皮黑色素對羥自由基有較強的清除活性。姚增玉等［20］研究也表明山杏種皮黑色素清除羥自由基能力與BHT無顯著差異而高于VC。

圖11　山杏種皮黑色素抑制羥自由基生成熒光光譜Fig.11　Fluorescence spectra showing the inhibitory effect of MYWA on hydrolyxyl radical

2.3.6山杏種皮黑色素抑制脂質(zhì)過氧化活性作用

H2O2、Fe2+-VC等自由基引發(fā)劑均可激發(fā)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，明顯增加丙二醛的生成量。氧化劑H2O2中含有活性氧，在一定條件下可生成活性更強的羥自由基，可引發(fā)脂質(zhì)過氧化作用，并形成過氧化脂質(zhì)（lipid peroxidation，LPO）。LPO大部分由肝細胞產(chǎn)生，其分解也主要在肝臟。丙二醛是LPO的主要降解產(chǎn)物，其含量可反映脂質(zhì)過氧化的程度［19］。在Fe2+-VC自由基發(fā)生系統(tǒng)中，由VC所引起的三價鐵離子到亞鐵離子的循環(huán)促使超氧陰離子、H2O2、羥自由基的生成，誘發(fā)多不飽和脂肪酸氧化，產(chǎn)生脂氧自由基和脂過氧自由基，再引發(fā)鏈?zhǔn)健⒅ф準(zhǔn)椒磻?yīng)，使多不飽和脂肪酸進一步發(fā)生過氧化［23］。

圖12　山杏種皮黑色素抑制脂質(zhì)過氧化活性結(jié)果Fig.12　Inhibition of lipid peroxidation by MTWA

由圖12可見，H2O2和Fe2+-VC均能顯著誘導(dǎo)大鼠肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，且H2O2的誘導(dǎo)能力明顯強于Fe2+-VC。不同質(zhì)量濃度的山杏種皮黑色素溶液對大鼠自發(fā)性肝臟脂質(zhì)過氧化以及H2O2和Fe2+-VC誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化均具有明顯的抑制作用，隨著山杏種皮黑色素質(zhì)量濃度的增大，抑制作用增強，在0.3 g/L時，山杏種皮黑色素對自發(fā)性肝臟脂質(zhì)過氧化已經(jīng)達到極顯著的抑制作用（P＜0.01）。而對于H2O2和Fe2+-VC誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，0.2 g/L的山杏種皮黑色素已經(jīng)起到了顯著抑制作用（P＜0.05）。

3　討論與結(jié)論

山杏仁皮是山杏仁深加工過程中的下腳料，采用NaOH提取法提取山杏種皮黑色素的最優(yōu)工藝為NaOH濃度0.4 mol/L、提取溫度80 ℃、提取時間6 h、液料比20∶1（mL/g），得率最大值為7.2%［6］，而超聲波輔助提取的最優(yōu)工藝為NaOH濃度0.33 mol/L、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度63.07 ℃，其山杏種皮黑色素得率可達4.14%。超聲波輔助提取的方法耗時較短、提取劑濃度小、用量少、溫度低、提取條件較為溫和。從研究結(jié)果看，對于不同的提取方法，對山杏種皮黑色素得率影響最大的條件都是提取溫度，超聲波輔助提取的溫度較低，可能是超聲波輔助提取山杏種皮黑色素黑色素得率低的原因。姚增玉［5］認為黑色素的氧化程度越低，抗氧化活性就越高。因此，較短的提取時間、較溫和的提取條件，能縮短黑色素與空氣的接觸時間，降低其氧化程度，保證黑色素的抗氧化活性。

自由基是人體正常代謝的產(chǎn)物，可以促進細胞增殖，刺激白細胞和吞噬細胞，殺滅細菌，消除炎癥，分解毒物［9，24］。但是，由環(huán)境污染、農(nóng)藥、食品添加劑、酒精、吸煙等外來因素引發(fā)的外源性自由基及人體新陳代謝失衡導(dǎo)致體內(nèi)的自由基過量，可以引起生物體脂類、蛋白質(zhì)和核酸等分子的過氧化損傷。盡管人體自身具有抗氧化化合物和酶等抗氧化平衡系統(tǒng)以克服活性氧和自由基的傷害，但這些抗氧化物質(zhì)的量仍然不足。BHT和叔丁基羥基茴香醚（butyl hydroxyanisole，BHA）等人工合成抗氧化劑已普遍用于食品工業(yè)，但其安全性和毒性越來越受到關(guān)注，歐美等一些國家已禁止或限量使用這些抗氧化劑。姚增玉等［20］的研究表明山杏種皮黑色素具有較強的抗氧化能力，可以明顯抑制β-胡蘿卜素-亞油酸乳化液的氧化褪色，具有強的清除羥自由基能力，其效果接近BHT而高于VC，清除超氧陰離子自由基能力超過BHT和VC。山杏種皮黑色素既可以作為氫供體，清除DPPH自由基，但清除能力低于BHT和VC，也可作電子供體，將Fe3+還原為Fe2+，還原能力高于BHT和VC。而本研究表明，山杏種皮黑色素具有較強的螯合金屬離子的能力和清除羥自由基的能力，能顯著抑制大鼠肝臟自發(fā)性以及H2O2和Fe2+-VC誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，進一步證明了山杏種皮黑色素的抗氧化能力。尤其是較強的螯合金屬離子的能力，預(yù)示著在生物體內(nèi)它可以清除重金屬和過渡金屬離子的毒害，在工業(yè)方面可用于提取貴重金屬以及污染治理。

山杏種皮黑色素的這些抗氧化能力，為其保護生物大分子如DNA免受氧化損傷奠定了基礎(chǔ)［25］。山杏種皮黑色素能有效抵抗紫外輻射、抑制糖基化反應(yīng)也是能有效清除自由基、抗氧化反應(yīng)的結(jié)果［15-16］。

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Response Surface Optimization of Ultrasonic-Assisted Extraction of Melanin from Testae of Wild Apricots and Its Antioxidant Activities

LI Hongjiao1，2， LI Juxiu3，*， ZHAO Zhong1，*
（1. Key Laboratory of Environment and Ecology in Western China， Ministry of Education， College of Forestry， Northwest A&F University，Yangling 712100， China； 2. College of Forestry， Hebei Agricultural University， Baoding 071000， China；3. College of Food Science and Engineering， Northwest A&F University， Yangling 712100， China）

In this work， we isolated melanin from the testae of wild apricots （MTWA） by ultrasonic-assisted extraction. The optimization of the extraction process was carried out using by the combined use of one-factor-at-a-time method and response surface analysis （RSA） with Box-Behnken experimental design. Then the antioxidant activities of MTWA were analyzed including free radical scavenging capacity， metal ion-chelating capacity and lipid peroxidation inhibition. The results showed that the optimal extraction conditions were determined as follows: NaOH concentration， 0.33 mol/L；temperature， 63.07 ℃； time， 3 h； and solid-to-solvent ratio， 1:10 （g/mL）. Under these conditions， the maximum yield of MTWA of 4.14% was obtained. The in vitro antioxidant tests showed that MTWA had weaker 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl（DPPH） and 2，2’-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate）， radical scavenging activities and ferric reducing ability. However，compared with synthetic melanin， MTWA had much stronger metal ion-chelating ability. MTWA also had stronger hydroxyl radical-scavenging activity and provided significant inhibition of lipid peroxidation induced by H2O2and Fe2+-VC.

ultrasnic-assisted extraction； wild apricot testae； melanin； response surface analysis； antioxidant activities

10.7506/spkx1002-6630-201618005

S789.9

A

1002-6630（2016）18-0026-08

李紅姣， 李巨秀， 趙忠. 響應(yīng)面試驗優(yōu)化超聲波輔助提取山杏種皮黑色素工藝及其抗氧化活性［J］. 食品科學(xué)， 2016，37（18）: 26-33. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618005. http://www.spkx.net.cn

LI Hongjiao， LI Juxiu， ZHAO Zhong. Response surface optimization of ultrasonic-assisted extraction of melanin from testae of wild apricots and its antioxidant activities［J］. Food Science， 2016， 37（18）: 26-33. （in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201618005. http://www.spkx.net.cn

2016-03-03

國家林業(yè)公益性行業(yè)科研專項（200904020）

李紅姣（1987—），女，博士，研究方向為森林食品和林產(chǎn)品加工。E-mail：lihongjiao0103@163.com

李巨秀（1972—），女，副教授，博士，研究方向為食品化學(xué)和功能食品。E-mail：juxiuli@msn.com趙忠（1958—），男，教授，博士，研究方向為森林培育理論與技術(shù)。E-mail：zhaozh@nwsuaf.edu.cn