解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

騰軍偉，楊貞耐

（北京工商大學食品添加劑與配料北京高校工程研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048）

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化

騰軍偉，楊貞耐*

（北京工商大學食品添加劑與配料北京高校工程研究中心/食品質(zhì)量與安全北京實驗室，北京 100048）

從甜酒曲中分離篩選得到1株解淀粉芽孢桿菌菌株GSBa-1，為了提高該菌株液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的能力，采用單因素實驗和響應面法優(yōu)化其產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成。通過單因素實驗分析了碳源、氮源、金屬鹽、磷源對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶的影響，并采用響應面法對產(chǎn)酶培養(yǎng)基中麥芽糖、蛋白胨和酵母浸粉含量3個主要因素的優(yōu)化組合進行了定量研究，確定解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶的優(yōu)化培養(yǎng)基組成為：麥芽糖1.93 g/L、蛋白胨10.89 g/L、酵母浸粉2.15 g/L。在此優(yōu)化培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下，該菌株產(chǎn)凝乳酶活力可達（562.57±7.67）Su/mL，接近理論預測值537.10 Su/mL，且平均誤差為4.53%。優(yōu)化后解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力比基礎培養(yǎng)基提高了1.88倍。

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1；凝乳酶；響應面法；培養(yǎng)基組成

引用格式：騰軍偉，楊貞耐.解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基組成的優(yōu)化［J］.食品科學技術學報，2016，34（4）:31-38.

TENG Junwei，YANG Zhennai.Optimization by response surface methodology of medium composition for producing milk-clotting enzyme by Bacillus amyloliquefaciens GSBa-1［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（4）:31-38.

凝乳酶（milk-clotting enzyme，MCE）是干酪生產(chǎn)中添加于原料乳而導致凝乳的必需酶，通常是經(jīng)過牛犢第四胃（皺胃）的提取來制作。隨著干酪產(chǎn)業(yè)的發(fā)展單純靠宰殺牛犢的方法已經(jīng)無法滿足現(xiàn)代工業(yè)對凝乳酶的需求［1-2］，因此，研究開發(fā)不同來源的凝乳酶已受到越來越多的關注［3］。凝乳酶主要包括動物源凝乳酶、植物源凝乳酶、微生物源凝乳酶等［4］。微生物具有的生長期短、成本低、易于人工控制培養(yǎng)等優(yōu)點使得微生物源凝乳酶擁有廣闊的發(fā)展前景［5］。近年來，對霉菌的固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶方面的研究較多［6-8］，而關于細菌液發(fā)酵的研究報道較少。其中在細菌凝乳酶的研究報道中主要涉及枯草芽孢桿菌［9］、蠟樣芽孢桿菌［10］、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）［11］和地衣芽孢桿菌［12］等。細菌來源的凝乳酶具有的高蛋白水解能力使得其商業(yè)化應用存在障礙［13］，因此，獲得凝乳酶活力高同時蛋白水解活力低的細菌源凝乳酶是近年來凝乳酶研究開發(fā)的熱點問題。

微生物繁殖發(fā)酵產(chǎn)酶過程中，培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分組成也是影響產(chǎn)酶的關鍵因素［14］，因此微生物發(fā)酵產(chǎn)酶時首先必須有滿足其生長繁殖所需的碳源、氮源、礦物質(zhì)離子和各種微量元素等［15］；近年來，已有報道關于芽孢桿菌的培養(yǎng)基成分對其發(fā)酵過程的影響方面的研究［16-17］，同時，研究表明，采用優(yōu)化的培養(yǎng)基對于高效實現(xiàn)芽孢桿菌的高密度增殖并培養(yǎng)產(chǎn)酶至關重要［18］。目前，對于培養(yǎng)基的組成對解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的影響的研究甚少［16，19］。江米酒發(fā)酵劑酒曲中微生物發(fā)酵代謝可產(chǎn)生凝乳酶［20-21］。江米酒是一種傳統(tǒng)安全食品，采用其中篩選得到的菌株進行發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶，無須考慮非酶類代謝產(chǎn)物的安全性問題［22］。本研究采用1株從甜酒曲中分離篩選得到的高產(chǎn)凝乳酶解淀粉芽孢桿菌菌株GSBa-1，重點研究了培養(yǎng)基組成對其產(chǎn)酶的影響，并采用響應面法優(yōu)化其培養(yǎng)基組成，旨在提高該菌株的凝乳酶產(chǎn)量和活力，并希望能夠為解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的進一步開發(fā)利用提供技術參考。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

解淀粉芽孢桿菌GSBa-1由本實驗室分離純化并冷凍保存；脫脂乳粉，澳大利亞進口；其他實驗試劑均為分析純；實驗用水為超純水；細菌基礎培養(yǎng)基（LB）:胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、瓊脂粉15 g/L，于121℃高溫滅菌20 min。細菌基礎發(fā)酵培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L、酵母浸粉5 g/L、氯化鈉10 g/L，于121℃高溫滅菌20 min。

HWS 12型恒溫水浴加熱鍋，上海一恒科學實驗裝備有限公司；HZQ-Q型氣浴恒溫搖床，哈爾濱東聯(lián)電子科技有限公司；CR21GⅢ型高速離心機，日本日立有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1種子液的制備

挑取-70℃冰箱中甘油管保藏的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1，于LB固體平板劃線活化，30℃條件下培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。挑取少量單一菌落接種到細菌發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30℃、120 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)14 h作為種子液。

1.2.2菌株發(fā)酵條件的確定

種子液按3%體積分數(shù)的比例接種到裝有30 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，在30℃、120 r/min的培養(yǎng)條件下?lián)u床回旋振蕩培養(yǎng)18 h。

1.2.3凝乳酶活力的測定

選用Arima等［23］方法。準確量取5 mL 100 g/L的脫脂乳于35℃中保溫5 min，加入0.5 mL解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵粗酶液，使之迅速混勻，加入粗酶液時開始計時，準確記錄脫脂乳凝固的時間（s）。發(fā)酵酶液活力的定義:將在40 min內(nèi)凝固100 g/L的脫脂乳1 mL所要的凝乳酶量規(guī)定為一個索氏單位（Soxhelt unit，Su）。計算公式見式（1）。

式（1）中，MCA為發(fā)酵液酶活力，Su/mL；T為凝乳時間，s；D為酶液稀釋倍數(shù)。

1.2.4蛋白水解活力的測定

取2 mL 1.5%酪蛋白溶液于35℃保溫5 min，加入0.5 mL預熱的待測粗酶液，混勻，反應60 min，加入2 mL 8%的三氯乙酸終止反應，過濾后測定濾液在280 nm的吸光度（A280）。制備對照樣品，先將預熱的粗酶液同三氯乙酸混合，使酶液失活，再加入2 mL酪蛋白溶液在35℃中保溫5 min，過濾后測定濾液在280 nm的吸光度。

本實驗條件下，60 min引起A280增加0.001個單位所需的酶量為1個酶活力單位。計算公式見式（2）。

式（2）中，A280′為對照樣品的吸光度；A280為水解后待測樣品的吸光度。

1.2.5單因素實驗

1.2.5.1碳源種類的確定

以1.1基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉為唯一碳源和能源的基礎上，分別添加質(zhì)量濃度為5 g/L的果糖、麥芽糖、蔗糖、乳糖、葡萄糖、可用性淀粉，其他組成成分不變，以細菌基礎發(fā)酵培養(yǎng)基作為對照，按照

1.2.2的條件進行培養(yǎng)，測定凝乳酶活力和蛋白水解活力，研究碳源種類對菌株產(chǎn)凝乳酶的影響。

1.2.5.2氮源種類的確定

以1.1基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母粉為唯一氮源的基礎上，分別添加10 g/L質(zhì)量濃度的蛋白胨、大豆蛋白胨、牛肉粉、脫脂奶粉、硫酸銨、檸檬酸氨，其他組成成分不變，以基礎發(fā)酵培養(yǎng)基為對照，按照

1.2.2的方法進行培養(yǎng)，測定凝乳酶活力和蛋白水解活力，研究氮源種類對菌株產(chǎn)凝乳酶的影響。

1.2.5.3酵母浸粉添加量的確定

分別將1.1基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中5 g/L的酵母粉調(diào)整為1，2，3，4，5，6，7，9，12，15 g/L，其他條件不變，按照1.3.2的方法進行培養(yǎng)，研究酵母浸粉添加量對菌株產(chǎn)凝乳酶的影響。

1.2.5.4金屬離子種類的確定

改變1.1中基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的氯化鈉，換成相同條件的碳酸鈣、氯化鈣、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸銅、硫酸鋅、硫酸錳，其他成分不變，按照1.2.2的方法進行培養(yǎng)，研究不同金屬鹽對菌株產(chǎn)凝乳酶的影響。

1.2.5.5磷源種類的確定

在1.1基礎發(fā)酵培養(yǎng)基里分別添加1 g/L的K2HPO4·3H2O、KH2PO4、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4，以不加磷源的基礎培養(yǎng)基做對照，按照1.2.2的方法進行培養(yǎng)，研究不同磷源對菌株產(chǎn)凝乳酶的影響。

1.2.6響應面試驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取麥芽糖、蛋白胨和酵母浸粉3個因素，以MCA為響應值，依據(jù)Box-Behnken軟件進行中心組合試驗，設計3因素3水平的響應面試驗，結(jié)果見表1。每組試驗重復3次。

表1　響應面試驗因素水平Tab.1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.7數(shù)據(jù)分析

采用Design-Expert 8.0.5.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進行處理，并進行顯著性分析。

2　結(jié)果與分析

2.1單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1碳源對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶產(chǎn)量的影響

碳源為微生物生長和代謝提供最主要的碳素和能量。不同碳源種類對菌株產(chǎn)酶活力的影響見圖1。從圖1可以看出，與對照組基礎培養(yǎng)基以酵母浸粉為唯一碳源相比，再添加其他碳源有助于凝乳酶活力的提高，尤其是添加麥芽糖和可溶性淀粉時凝乳酶的活力比較高。研究結(jié)果和納豆芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶類似［24］，特別是添加麥芽糖時凝乳酶的凝乳活力與蛋白水解活力比值（C/P）最高，因此選擇麥芽糖作為較佳碳源。碳源質(zhì)量濃度對菌株產(chǎn)酶活力亦有較大影響，對麥芽糖較佳添加量的進一步研究結(jié)果（圖2）表明，麥芽糖添加量對凝乳酶活力的影響呈現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，可能是由于高質(zhì)量濃度的麥芽糖會導致酶的鈍化或培養(yǎng)基的營養(yǎng)失衡，從而影響微生物產(chǎn)酶［25］。當質(zhì)量濃度為2 g/L時，凝乳酶活力最高，因此，產(chǎn)酶培養(yǎng)基中麥芽糖的較佳添加量為2 g/L。

圖1　碳源對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力的影響Fig.1 Effect of carbon sources on production of MCE by strain GSBa-1

圖2　麥芽糖質(zhì)量濃度對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力的影響Fig.2 Effect of maltose mass concentration on production of MCE by strain GSBa-1

2.1.2氮源對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶產(chǎn)量的影響

氮源主要為微生物細胞生長和代謝提供氮素及能量。不同氮源種類對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力的影響結(jié)果如圖3。從圖3可以看出，與對照組相比，當添加有機氮源蛋白胨與牛肉膏時對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶有促進作用；添加無機氮源則對菌株產(chǎn)酶有明顯的抑制作用，且添加硫酸銨和檸檬酸銨時，菌體基本不生長，測得發(fā)酵液凝乳活力為0，研究結(jié)果和葉為標等［26］的類似。當添加有機氮源如蛋白胨時，凝乳酶活力最高，同時酶的蛋白水解活力最低，因此，選擇蛋白胨為較佳氮源。氮源質(zhì)量濃度對菌株發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶量有重要影響，對蛋白胨添加量的研究結(jié)果（圖4）表明，隨著蛋白胨質(zhì)量濃度的增加，酶的凝乳活力逐漸提高，當質(zhì)量濃度增加到11 g/L時，凝乳活力達到最大值，之后隨著蛋白胨濃度的繼續(xù)增大，凝乳活力不斷降低。因此，選取11 g/L作為蛋白胨的較佳質(zhì)量濃度。

圖3　氮源對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力的影響Fig.3 Effect of nitrogen sources on production of MCE by strain GSBa-1

圖4　蛋白胨質(zhì)量濃度對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力的影響Fig.4 Effect of peptone mass concentration on production of MCE by strain GSBa-1

2.1.3酵母浸粉對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶產(chǎn)量的影響

酵母浸粉為微生物生長和代謝提供碳源和氮源，其質(zhì)量濃度對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力有重要影響，實驗結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，酵母浸粉添加量對凝乳酶活力也呈現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，且當質(zhì)量濃度是2 g/L時，發(fā)酵液凝乳活力達到最大值。由于酵母浸粉中含有嘌呤和嘧啶堿基以及B族維生素等，它們有利于微生物的生長繁殖和酶的合成，但是濃度過高反而會影響產(chǎn)酶［27］。當培養(yǎng)基中酵母浸粉的質(zhì)量濃度大于2 g/L時，凝乳酶的活力幾乎呈線性下降。因此，酵母浸粉的較佳添加量為2 g/L。

2.1.4金屬鹽對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶產(chǎn)量的影響

金屬鹽是影響微生物生長繁殖和凝乳酶合成的重要因素，不同金屬鹽種類對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力的影響見圖6。由圖6可以看出，與對照組相比，添加鎂鹽對產(chǎn)酶稍有促進作用，鈉鹽和鉀鹽有一定的抑制作用，而其他金屬鹽包括氯化鈣和碳酸鈣均對產(chǎn)酶具有明顯的抑制作用。李建濤等［16］報道，氯化鈣對一株從土壤中分離得到的解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶有顯著的抑制作用，而碳酸鈣卻具有促進產(chǎn)酶的作用，可見不同來源的解淀粉芽孢桿菌菌株所產(chǎn)凝乳酶，其酶學性質(zhì)也不同。本研究的解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶的酶促反應過程中可能不需要金屬離子的輔助，因此，該菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基中可以不添加金屬鹽。

圖5　酵母粉質(zhì)量濃度對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力的影響Fig.5 Effect of yeast mass concentration on production of MCE by strain GSBa-1

圖6　金屬鹽對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力的影響Fig.6 Effect of metal salts on production of MCE by strain GSBa-1

2.1.5磷源對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1凝乳酶產(chǎn)量的影響

磷源不僅提供磷源離子，還能影響培養(yǎng)基的pH值。不同磷源種類對菌株發(fā)酵產(chǎn)酶活力的影響如圖7。由圖7可以看出，與對照相比，添加不同磷源時均對菌株GSBa-1產(chǎn)酶有不同程度的抑制作用。不同磷源對另一株解淀粉芽孢桿菌也具有抑制作用，可能是因為加入磷源會降低發(fā)酵液的pH值，進而降低該菌株產(chǎn)凝乳酶活性［16］。因此，菌株GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)酶基礎培養(yǎng)基中不需要加入磷源。

圖7　磷源對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力的影響Fig.7 Effect of phosphorus sources on production of MCE by strain GSBa-1

2.2響應面試驗結(jié)果及分析

2.2.1響應面試驗結(jié)果

依據(jù)Box-Behnken試驗設計方法進行3因素3水平的響應面試驗，共安排17個小組，其中12組為分析點，5個為試驗零點。零點試驗共進行5次，用以估計誤差。試驗設計方案及結(jié)果見表2。

表2　Box-Behnken試驗設計和結(jié)果Tab.2 Box-Behnken design and experimental results

2.2.2回歸模型的建立及顯著性分析

根據(jù)Design-Expert（Version8.0.5.0）軟件對表2數(shù)據(jù)及結(jié)果進行多元回歸擬合分析，得到菌株GSBa-1凝乳活力（Y）對麥芽糖質(zhì)量濃度（X1）、蛋白胨質(zhì)量濃度（X2）和酵母浸粉質(zhì)量濃度（X3）3個因素的二次多項式回歸模型，見式（3）:

方差分析和各因素的顯著性見表3。從表3可以看出，模型的p值遠遠小于0.01，說明該模型是高度顯著的，與實際試驗擬合較好。本試驗中決定系數(shù)R2=0.959 7，說明優(yōu)化產(chǎn)凝乳酶活力的實驗值與模型回歸值有良好的一致性。其中校正系數(shù)R2Adj=0.907 8，說明該模型能夠很好地解釋0.907 8的響應值變化，失擬項F為3.49，p為0.129 2，大于0.05，表明模型失擬項不顯著，能很好地說明該方程充分反映了實際細菌發(fā)酵產(chǎn)酶情況。因此，該模型擬合程度良好，可以用此模型來分析和預測營養(yǎng)條件對提高解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力的影響?；貧w方程的各項方差分析結(jié)果說明，各營養(yǎng)因素對促進解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)凝乳酶活力的影響順序由大到小為:酵母浸粉質(zhì)量濃度、蛋白胨質(zhì)量濃度、麥芽糖質(zhì)量濃度。其中，X2、X3、X2X3、影響比較顯著。

表3　Box-Behnken設計方差分析Tab.3 ANOVA analysis of Box-Behnken

2.2.3響應面和等高值線分析

采用Design-Expert（Version 8.0.5.0）軟件對表2數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合分析，得到的二次回歸方程響應曲面和等高值線如圖8～10。從其等高值線圖可以看出，麥芽糖與蛋白胨添加量、麥芽糖與酵母浸粉添加量及蛋白胨與酵母浸粉添加量的交互作用均表現(xiàn)顯著。從響應面圖上可以看出，酵母浸粉添加量對發(fā)酵液凝乳酶活力的促進作用最大，表現(xiàn)為曲面最陡；蛋白胨添加量對發(fā)酵液凝乳酶活力的促進作用其次；麥芽糖添加量對發(fā)酵液凝乳酶活力的促進作用較小，其曲面最為平緩。通過響應面及等高線圖可以直觀地看出，不同營養(yǎng)因素對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶的影響。

圖8　麥芽糖和蛋白胨質(zhì)量濃度對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力影響的曲面圖及等高值線Fig.8 Response surface and contour plots showing effects of maltose concentration and peptone concentration on production of MCA by strain GSBa-1

圖9　麥芽糖和酵母粉質(zhì)量濃度對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力影響的曲面圖及等高值線Fig.9 Response surface and contour plots showing effects of maltose concentration and yeast concentration on production of MCA by strain GSBa-1

圖10　蛋白胨和酵母粉質(zhì)量濃度對菌株GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力影響的曲面圖及等高值線Fig.10 Response surface and contour plots showing effects of peptone concentration and yeast concentration on production of MCA by strain GSBa-1

2.2.4營養(yǎng)條件的優(yōu)化組合及驗證

由等高值線圖和響應面圖可知，回歸模型存在最大值。通過響應面軟件分析得到解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)酶的優(yōu)化培養(yǎng)基組成條件:麥芽糖質(zhì)量濃度1.93 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度10.89 g/L、酵母浸粉質(zhì)量濃度2.15 g/L，此條件下理論預測最大凝乳酶活力為537.10 Su/mL。為了驗證結(jié)果的可靠性，將采取響應面分析法得到的優(yōu)化培養(yǎng)條件進行3次平行實驗，結(jié)果顯示，凝乳酶活力為（562.57± 7.67）Su/mL，且實驗平均誤差4.53%，表明使用響應面法優(yōu)化得到的模型參數(shù)準確可靠。

3　結(jié) 論

通過單因素實驗研究了培養(yǎng)基營養(yǎng)成分組成對解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶的影響，并采用Box-Behnken軟件進行中心組合設計及響應面分析，建立了解淀粉芽孢桿菌GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)酶條件的二次多項數(shù)學模型。經(jīng)檢驗證明，該模型是合理可靠的，能夠較好地預測解淀粉芽孢桿菌GSBa-1產(chǎn)凝乳酶活力。利用模型的響應面及其等高值線，對影響產(chǎn)凝乳酶的主要培養(yǎng)基組分即麥芽糖、蛋白胨和酵母浸粉質(zhì)量濃度等3個關鍵營養(yǎng)因素及其相互作用進行了探討，證明三因素彼此之間均存在顯著的交互作用。通過模型分析得到優(yōu)化工藝參數(shù)為:麥芽糖質(zhì)量濃度1.93 g/L、蛋白胨質(zhì)量濃度10.89 g/L、酵母粉質(zhì)量濃度2.15 g/L。利用此優(yōu)化培養(yǎng)基，經(jīng)30℃、120 r/min搖床培養(yǎng)18 h，發(fā)酵液中凝乳酶活力可達（562.57±7.67）Su/mL。本研究表明，用響應面法優(yōu)化菌株GSBa-1發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶培養(yǎng)基組成，較大幅度提高了菌株產(chǎn)凝乳酶活力。

［1］ 楊貞耐，張健.干酪質(zhì)量安全問題與控制技術［J］.食品科學技術學報，2015，33（6）:11-17.

YANG Z N，ZHANG J.Research advances and development trends in cheese safety and quality control［J］. Journal of Food Science and Technology，2015，33（6）: 11-17.

［2］ 高巖，王景會，李玉秋，等.枯草芽孢桿菌凝乳酶的酶學性質(zhì)［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2012，34（4）:385-390.

［3］ 孫寶國，曹雁平，李健，等.食品科學研究前沿動態(tài)［J］.食品科學技術學報，2014，32（2）:1-11.

SUN B G，CAO Y P，LI J，et al.Frontier dynamic of food science research［J］.Journal of Food Science and Technology，2014，32（2）:1-11.

［4］ 鄭麗，王昕，王景會，等.重組畢赤酵母產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵參數(shù)優(yōu)化的研究［J］.食品科技，2012，37（3）:16-21.

［5］ 周俊清，林親錄，趙謀明.微生物源凝乳酶的研究進展［J］.中國食品添加劑，2004（2）:6-9.

［6］ 韓玲玲，潘道東.根霉產(chǎn)凝乳酶的固態(tài)發(fā)酵條件優(yōu)化［J］.食品科學，2010，31（9）:156-160.

［7］ 李倬林，邵淑娟，李鐵柱，等.響應面法優(yōu)化微小毛霉固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)凝乳酶工藝研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33（4）:248-254.

［8］ 吳進菊，徐爾尼，陳衛(wèi)，等.酒曲根霉F34菌株凝乳酶的初步純化及部分酶學性質(zhì)的研究［J］.食品工業(yè)科技，2008，29（9）:135-137.

［9］ KAKOLI D，PRETESH G，SAURABH S，et al.Production of milk-clotting protease from Bacillus subtilis［J］. Appl Biochemistry and Biotechnology，2009，158（3）:761 -772.

［10］ 周俊清.凝乳酶優(yōu)良菌株的選誘及酶活特性的研究［D］.長沙:湖南農(nóng)業(yè)大學，2005.

［11］ HE X L，REN F Z，GUO H Y，et al.Purification and properties of a milk-clotting enzyme produced by Bacillus amyloliquefaciens D4［J］.Korean J Chem Eng，2011，28（1）:203-208.

［12］ 宋曦，甘伯中，賀曉玲，等.天祝放牧牦牛生活環(huán)境土壤中一株產(chǎn)凝乳酶細菌的分離與鑒定［J］.食品科學，2009，30（11）:158-162.

［13］ RAO L K，MATHUR D K.Studies on the production of bacterial rennet in a pilot plant fermentor［J］.Biotechnol Bioeng，1975，17（9）:1349-1356.

［14］ LIU Binglan，TZENG Yewmin.Optimization of growth medium for the production of spores from Bacillus thuringiensis response surface methodology［J］.Bioprocess Engineering，1998，18:413-418.

［15］ 宋文君.L-異亮氨酸高產(chǎn)菌的選育及其發(fā)酵條件研究［D］.天津:天津科技大學，2003，11:13-14.

［16］ 李建濤，陳歷俊，姜鐵民.響應面法優(yōu)化解淀粉芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)凝乳酶的工藝條件［J］.中國乳品工業(yè)，2012，40（6）:26-30.

［17］ 陳羽，馮鎮(zhèn)，張宏偉，等.響應面法優(yōu)化芽孢桿菌FC96培養(yǎng)基組分的研究［J］.食品科技，2011，36（6）:30-35.

［18］ QUARATINO D，CIAFFI M，F(xiàn)EDERICI E.Response surface methodology study of laccase production in Panustigrinus liquid cultures［J］.Biochemical Engineering Journal，2008，39（2）:236-245.

［19］ ZHANG Weibing，HE Xiaoling，LIU Hongna，et al. Statistical optimization of culture conditions for milkclotting enzyme production by Bacillus amyloliquefaciens using wheat bran-an agro-industry waste［J］.Indian J Microbiol，2013，53（4）:492-495.

［20］ 劉振民，駱承庠.江米酒乳凝固機理研究［J］.食品科學，2000，21（7）:13-15.

［21］ WANG Y P，CHENG Q L，AHMED Z，et al.Purification and partial characterization of milk-clotting enzyme extracted from glutinous rice wine mash liquor［J］.Korean Journal of Chemical Engineering，2009，26（5）: 1313-1318.

［22］ ZHAO Xiao，WANG Ji，ZHENG Zhe，et al.Production of a milk-clotting enzyme by glutinous rice fermentation and partial characterization of the enzyme［J］.Journal of Food Biochemistry，2015，39（1）:70-79.

［23］ ARIMA K，YU J，IWASSAKI S.Milk-clotting enzyme from Mucor pusillus var.Lindt［J］.Method in Enzymology，1970，19:446-459.

［24］ SHIEH C J，PHAN T L A，SHIH I L.Milk-clotting enzymes produced by culture of Bacillus subtilis natto［J］. Biochemical Engineering Journal，2009，43（1）:85-91.

［25］ DING Z Y，LIU S P，GU Z H，et al.Production of milkclotting enzyme by Bacillus subtilis B1 from wheat bran［J］.African Journal of Biotechnology，2011，10:9370-9378.

［26］ 葉為標，吳進菊，陳衛(wèi)平，等.根霉產(chǎn)凝乳酶發(fā)酵條件的研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28（8）:53-55.

［27］ THAKUR M S，KARANTH N G，NAND K.Production of fun-gal rennet by mucor miehei using solid state fermentation［J］.Appl Microbiol Biotechnol，1990，32（4）: 409-413.

Optimization by Response Surface Methodology of Medium Composition for Producing Milk-clotting Enzyme by Bacillus Amyloliquefaciens GSBa-1

TENG Junwei，YANG Zhennai*
（Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients/Beijing Laboratory of Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China）

A Bacillus amyloliquefaciens strain GSBa-1 was isolated from sweet Jiuqu.In order to improve the ability of producing a milk-clotting enzyme（MCE）by liquid fermentation of strain GSBa-1，the single factor test and response surface methodology were employed to optimize the composition of the medium used.The single factor experiment was carried out to analyze the influence of different carbon source，nitrogen source，metal salt and phosphorus source on production of MCE by strain GSBa-1.Then the Box-Behnken design based RSM experiment was used to study the optimum combination of three main factors such as the content of maltose，peptone and yeast extract powder in the medium.The optimal medium composition for producing MCE by GSBa-1 was as follows:maltose 1.93 g/L，peptone 10.89 g/L，and yeast extract powder 2.15 g/L.When the optimal culture medium was used，MCE activity was up to（562.57±7.67）Su/mL，which is similar as the theoretical prediction value of 537.10 Su/mL with an average error of 4.53%.After optimization of the medium composition，the MCE activity produced by strain GSBa-1 increased by 1.88 times compared with that of the basal medium.

Bacillus amyloliquefaciens strain GSBa-1；milk-clotting enzyme；response surface methodology；medium composition

TS252.1；TS201.3

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.04.006

2095-6002（2016）04-0031-08

（責任編輯:葉紅波）

20160223

國家自然科學基金面上項目（31371804）；北京市百千萬人才工程資助項目（B類）。

騰軍偉，男，碩士研究生，研究方向為乳品生物技術；

*楊貞耐，男，教授，博士，主要從事乳品加工及其交叉學科理論及應用方面的研究。通信作者。