北蟲草培養(yǎng)殘基中蟲草素的提取純化及抗腫瘤活性

陳麗冰，吳光旭，程 薇，范秀芝，史德芳，石 猛，高 虹，*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064；2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；3.湖北新冠食品科技有限公司，湖北黃石 435200）

北蟲草培養(yǎng)殘基中蟲草素的提取純化及抗腫瘤活性

陳麗冰1，2，吳光旭2，程 薇1，范秀芝1，史德芳1，石 猛3，高 虹1，*

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064；2.長江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；3.湖北新冠食品科技有限公司，湖北黃石 435200）

以北蟲草固體培養(yǎng)殘基為實驗材料，比較閃式提取、超聲波提取和超高壓提取培養(yǎng)殘基中蟲草素的效果，用陶瓷膜過濾提取液，獲得蟲草素粗提液，利用高速逆流色譜分離制備蟲草素，通過LC-MS/MS對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進(jìn)行鑒定，并驗證了蟲草素對小鼠S180肉瘤的抑制作用。結(jié)果顯示，超高壓提取培養(yǎng)基中蟲草素較好，高速逆流色譜分離純化條件是以V（乙酸乙酯）∶V（正丁醇）∶V（水）= 2∶3∶5的兩相溶劑系統(tǒng)，上相為固定相，下相為流動相，流速3.0 mL/min，主機(jī)轉(zhuǎn)速900 r/min，分離溫度28℃，以此分離條件經(jīng)一步洗脫，高速逆流色譜收集餾分，其中峰Ⅲ產(chǎn)物經(jīng)HPLC檢測純度達(dá)97.6%，結(jié)構(gòu)經(jīng)LC-MS/MS鑒定為蟲草素。從100 g北蟲草培養(yǎng)殘基中可制備得蟲草素181.90 mg，并對其活性驗證發(fā)現(xiàn)劑量為100 mg/kg時小鼠S180肉瘤瘤重抑制率為64.48%。

北蟲草培養(yǎng)基；蟲草素；提?。桓咚倌媪魃V；抗腫瘤活性

CHEN Libing，WU Guangxu，CHENG Wei，et al.Extraction，purification，and antitumor activity of cordycepin from Cordyceps militaris residue medium［J］.Journal of Food Science and Technology，2016，34（4）:73-79.

北蟲草（Cordyceps militaris L.）是一種近些年很受人們喜愛的食用菌，與著名的中藥冬蟲夏草有相似的藥理活性［1-3］。隨著市場需求的上升，人工栽培北蟲草的技術(shù)不斷成熟并廣泛應(yīng)用于市場，隨之產(chǎn)生的問題是采收子實體后的殘留培養(yǎng)基被廢棄于環(huán)境中導(dǎo)致腐敗變酸發(fā)臭造成污染。經(jīng)研究表明北蟲草培養(yǎng)殘基中存在的蟲草素高于子實體中的含量，而蟲草素具有抗腫瘤、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用［4-6］，具有可觀的醫(yī)療商用價值。因此，建立蟲草素成分的高效分離純化方法具有重要意義。

蟲草素的分離純化研究報道雖然多，但是工藝工序復(fù)雜、收率低、實驗成本高，對工業(yè)生產(chǎn)蟲草素參考價值不大。高速逆流色譜（high speed counter-current chromatography，HSCCC）是一種液-液色譜分離技術(shù)［7-8］，具有樣品無損失、無污染、高效、快速、制備量大等優(yōu)點，因此這項技術(shù)被廣泛應(yīng)用于天然生物活性成分的分離制備［9］。本研究采用超高壓設(shè)備對北蟲草培養(yǎng)殘基進(jìn)行水提，水提液經(jīng)陶瓷膜除雜后凍干，得蟲草素粗提物，并以此粗提物進(jìn)行HSCCC分離純化，經(jīng)一步成功分離得到高純度的蟲草素，同時對其抗腫瘤活性進(jìn)行了驗證，以期為蟲草素原料開發(fā)、分離、制備提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1材料與試劑

以大米為主要原料培養(yǎng)北蟲草后的剩余基質(zhì)，經(jīng)確認(rèn)為同一批次的大米培養(yǎng)基，由湖北新冠食品科技有限公司提供。蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品，上海金穗生物科技有限公司；高效液相色譜分析用乙腈和甲醇均為色譜純，上?；裟犴f爾公司；乙酸乙酯、正己烷、氯仿、乙醇、正丁醇、甲醇及冰乙酸均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；蒸餾水、超純水實驗室自制。

1 mL一次性注射器、0.45 μm微孔濾膜、注射用環(huán)磷酰胺（CTX），江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司；RPMI-1640和胎牛血清，美國Gibco公司；昆明種小鼠，湖北省實驗動物研究中心；S180小鼠腹水瘤細(xì)胞，中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫。

1.2儀器與設(shè)備

TBE-300B型高速逆流色譜儀，配20 mL進(jìn)樣圈，TBP5002型柱塞式泵，TBD2000型檢測器和DC -0506型低溫恒溫循環(huán)器，上海同田生化技術(shù)有限公司；LC-20A型高效液相色譜儀，日本島津公司，配SPD-M20A型檢測器，LC-20AT型泵，20 μL定量圈；1100型液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（LC-MSDTRAP-XCT），美國Agilent公司；HPP.L1-600/3型超高壓處理設(shè)備，天津華泰森淼生物工程技術(shù)有限公司；Thermo 3111型二氧化碳培養(yǎng)箱，美國Thermo Scientific公司；Multiskan MK3型酶聯(lián)免疫檢測儀，上海雷勃生物技術(shù)有限公司；JHBE-50T型閃式提取器，河南金鼐科技發(fā)展有限公司；另需陶瓷膜分離設(shè)備，凍干機(jī)，微型植物粉碎機(jī)，雙頻數(shù)控超聲波提取器，電子天平，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，離心機(jī)等。

2　實驗方法

2.1蟲草素制備工藝流程

收集新鮮北蟲草培養(yǎng)殘基篩選后切成大小均勻的小塊，放入烘箱內(nèi)60℃烘干后，用植物粉碎機(jī)粉碎，過篩。稱取一定質(zhì)量的培養(yǎng)基粉末用超高壓提取，離心，收集上清液，利用陶瓷膜初步除雜，所得透過液真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后真空冷凍干燥得到蟲草素粗提物。最后利用高速逆流色譜純化分離蟲草素粗提物，重結(jié)晶得蟲草素純品。

2.2原料處理

將相同批次的北蟲草大米培養(yǎng)殘基收集切片后并于60℃熱風(fēng)干燥至含水率低于5%，使用植物粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，過篩，置于干燥陰涼處密封保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3比較不同提取方式下北蟲草培養(yǎng)殘基中蟲草素含量

2.3.1超高壓提取法

稱量一定質(zhì)量粉碎后過20目篩的培養(yǎng)基粉末于超高壓提取容器中后按照液料比為70∶1 mL/g（即蒸餾水體積與培養(yǎng)基粗粉質(zhì)量的比例）加入蒸餾水，攪拌均勻使其充分潤濕，放入真空封裝機(jī)中抽真空確保容器中無氣泡，再放入超高壓的處理室，在處理室中加入加載介質(zhì)自來水，用深度尺檢測液面高度合適為止，取走深度尺后將柱塞推至加壓位置，關(guān)上超高壓主機(jī)防護(hù)門，開始加壓。超高壓處理條件采用經(jīng)過預(yù)實驗優(yōu)化后的工藝條件:壓力400 MPa，處理時間15 min，迅速卸壓，處理完畢得到提取處理液。提取液離心以后將上清液收集，殘渣再用相同液料比加入蒸餾水進(jìn)行第2次超高壓提取，工藝條件與第1次的提取參數(shù)相同，提取后離心得第2次上清液，合并上清液。取適量上清液過0.45 μm微孔濾膜，得到濾液至1.5 mL棕色進(jìn)樣瓶中，供高效液相色譜法分析測得提取液中蟲草素含量。

2.3.2超聲波水提取法［10］

準(zhǔn)確稱取0.5 g北蟲草培養(yǎng)殘基粉末置于裝有80 mL蒸餾水的100 mL燒杯中，在超聲波功率500 W，頻率26 kHz條件下提取3 h冷卻后用100 mL容量瓶定容。取樣液離心過濾，收集1.5 mL濾液于棕色進(jìn)樣瓶中，供高效液相色譜法分析測得提取液中蟲草素含量。

2.3.3閃式提取法

稱量北蟲草培養(yǎng)殘基10 g（精確至0.01 g）于閃式提取容器中，以料液比1∶35（即m（殘基）∶V（水）= 1 g∶35 mL）加入蒸餾水，在轉(zhuǎn)速8000r/min下閃式提取12 min，提取液在6 000 r/min下離心10 min，殘渣同法再提取一次，合并上清液。取適量上清液過0.45 um微孔濾膜，得到濾液至1.5 mL棕色進(jìn)樣瓶中，供高效液相色譜法分析測得提取液中蟲草素含量。

2.4陶瓷膜除雜

［11］，將超高壓提取液離心后，取上清液過150 ku陶瓷膜，在頻率30%～40%，壓強(qiáng)0.02～0.1 MPa，溫度23～30℃條件下保留透過液，再次過15 ku陶瓷膜除雜，頻率、壓力和溫度與第一次保持一致。經(jīng)過初步除雜的透過液濃縮后凍干得到蟲草素粗提取。

2.5高效液相色譜法定量測定蟲草素

采用高效液相色譜法對超高壓提取清液中蟲草素的含量進(jìn)行了測定，色譜條件為:色譜柱C18柱（250 mm×2.6 mm，5 μm）；預(yù)柱為ODS（10 mm× 4.6 mm，5 μm）；流動相為V（乙腈）∶V（水）=5∶95；體積流速1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；紫外檢測波長260 nm；柱溫35℃。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制:準(zhǔn)確稱取蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品10 mg于100 mL容量瓶中，用流動相溶解并定容作為標(biāo)準(zhǔn)液，質(zhì)量濃度為100 μg/mL。準(zhǔn)確吸取100 μg/ mL的蟲草素母液0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，5.0 mL于10 mL容量瓶中，用水定容、搖勻。按參考色譜條件測定，以蟲草素質(zhì)量濃度1.00，2.00，5.00，10.00，20.00，50.00 μg/mL為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，求線性回歸方程。

2.6高速逆流色譜分離制備

2.6.1溶劑系統(tǒng)的選擇

采用高速逆流色譜分離制備樣品時，最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是溶劑系統(tǒng)的選擇。溶劑系統(tǒng)選擇的原則主要在于首先不造成樣品的分解或變性；樣品在體系中要有足夠大的溶解度；溶劑系統(tǒng)穩(wěn)定，固定相保留率最好在50%～70%；最后樣品在兩相溶劑體系中的分配系數(shù)合適，最好是1。常見的溶劑系統(tǒng)根據(jù)極性可以分為三大類:疏水性、中等疏水性和親水性體系?？梢酝ㄟ^待分離物質(zhì)的性質(zhì)來尋找合適的溶劑系統(tǒng)，體系中各組分的組成和比例可根據(jù)樣品的溶解度來篩選。通過分析蟲草素的極性、溶解度、酸堿度等理化性質(zhì)，本研究應(yīng)用經(jīng)典體系之一的乙酸乙酯體系，也是親水性體系來分離制備蟲草素。

2.6.2分配系數(shù)的測定［12］

稱取1～2 mg粗提物加入分層的兩相溶劑體系中，充分混勻分層后，取上相1 mL經(jīng)高效液相色譜（HPLC）檢測，上相峰面積記錄為A1；取下相1mL經(jīng)HPLC檢測，下相峰面積記錄為A2，分配系數(shù)K值計算公式:K=A1/A2。

2.6.3樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取蟲草素粗提物樣品400 mg于試管中，加入10 mL上相和10 mL下相使其溶解，超聲脫氣，用于HSCCC分離。

2.6.4HSCCC的操作流程

按比例配置溶劑體系倒入分液漏斗中，將其反復(fù)多次振蕩搖勻，靜置約10 min，即出現(xiàn)明顯分層，后將兩相分別移入干凈干燥的兩個試劑瓶中，放置超聲震動儀中超聲脫氣20 min后放至室溫。提前打開恒溫循環(huán)水浴鍋預(yù)熱，設(shè)置主機(jī)溫度28℃，然后以流速30 mL/min泵入上相（固定相），再停泵以主機(jī)轉(zhuǎn)速900 r/min，流速3 mL/min泵入下相，在出液端用干凈的量筒接液并計算體系的固定相保留率。當(dāng)體系達(dá)到動力學(xué)平衡后開啟檢測器，基線穩(wěn)定后開始手動注入提前用各10 mL體積上、下相溶解的蟲草素粗提樣品，開啟檢測器，檢測波長254 nm，同時進(jìn)行圖譜采集，根據(jù)記錄信號的出峰情況手動收集組分。

2.7蟲草素結(jié)構(gòu)鑒定

蟲草素結(jié)構(gòu)用5975C質(zhì)譜儀鑒定，質(zhì)譜條件參考文獻(xiàn)［13］:電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），正離子模式；離子源溫度325℃；毛細(xì)管電壓3 500 V；毛細(xì)管出口電壓109.8 V；多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；蟲草素252［M+H］+。

2.8動物飼養(yǎng)與模型建立

昆明小鼠:60只SPF級，雌雄各半，4～6周齡，體重18～22 g，購自湖北省實驗動物研究中心［合格證號:SYXK（鄂）2008-0014］。保持飼養(yǎng)房室溫18～22℃，相對濕度50%～60%，自然光照，以全價營養(yǎng)飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。

小鼠S180腫瘤模型建立:收集對數(shù)生長期S180小鼠腹水瘤細(xì)胞，用無菌生理鹽水稀釋，將密度調(diào)整為（2～3）×106個/mL，制成細(xì)胞懸液。隨機(jī)選取小鼠10只，每只腹腔注射細(xì)胞懸液0.4 mL。約1周后，小鼠腹部明顯漲大、凸起，將小鼠頸椎脫臼處死，于超凈臺內(nèi)無菌抽取乳白色腹水液。用生理鹽水稀釋，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為（1～2）×107個/mL。隨機(jī)選取小鼠50只，雌雄各半，取0.2 mL接種于每只小鼠右上肢腋部皮下處。瘤細(xì)胞懸液接種前，均用0.4%臺盼藍(lán)染色，計算活細(xì)胞數(shù)為90%以上。從抽取腹水開始，至最后一只小鼠接種完畢，總時間需控制在1 h以內(nèi)。

分組給藥:接種24 h后，將小鼠隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半。具體給藥分組如下:陰性對照組A:蒸餾水（100 mL/（kg·d），ig）+生理鹽水（100 mL/（kg·d），ip）。陽性對照組B:蒸餾水（100 mL/（kg·d），ig）+環(huán)磷酰胺（20 mg/（kg·d），ip）。高劑量組C:蟲草素（100 mg/（kg·d），ig）+生理鹽水（100 mL/（kg·d），ip）。中劑量組D:蟲草素（50mg/（kg·d），ig）+生理鹽水（100 mL/（kg·d），ip）。低劑量組E:蟲草素（25 mg/（kg·d），ig）+生理鹽水（100 mL/（kg·d），ip）。按照以上給藥劑量和途徑，連續(xù)飼喂21 d（注:ip腹腔注射，ig灌胃）。

2.9抑瘤率的測定

末次給藥、禁食24 h后，頸椎脫臼法處死小鼠，完整剝離瘤塊并稱重，并按式（1）計算瘤重抑制率（IR）。

式（1）中，W1為實驗組平均瘤重，g；W2為對照組平均瘤重，g。

3　結(jié)果與分析

3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為1.00，2.00，5.00，10.00，20.00和50.00 μg/mL，按參考色譜條件測定，以蟲草素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。二者的函數(shù)關(guān)系為:y=27 523x+7165.5，R2=0.999 6，表明在1～50 mg/L的濃度范圍內(nèi)，蟲草素的峰面積與標(biāo)樣濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

圖1　蟲草素標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard carve of cordycepin

3.23種不同提取方式下北蟲草培養(yǎng)殘基中蟲草素含量

通過比較超高壓提取、閃式提取和超聲波提取北蟲草培養(yǎng)殘基中蟲草素，得出不同提取方式下蟲草素含量，結(jié)果見表1。

表1　3種方法提取北蟲草培養(yǎng)殘基中蟲草素的得率Tab.1 Extraction yield of cordycepin from Cordyceps militaris medium by three methods

由表1可知，超高壓提取法提取北蟲草培養(yǎng)殘基中的蟲草素得率最高，且提取時間上明顯比超聲波提取縮短，優(yōu)于閃式提取和超聲波提取，因此采用超高壓提取蟲草素的方法是高效可靠的。

3.3陶瓷膜過濾超高壓提取液實驗

蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品HPLC色譜見圖2。超高壓提取液在通過陶瓷膜前后的高效液相色譜圖分別為圖3和圖4。從色譜圖中可以看出，超高壓提取液中物質(zhì)很雜，特別是高效液相色譜圖前面部分有很多雜質(zhì)峰，但盡管如此，在14.610 min仍有一很高的色譜峰，其保留時間與標(biāo)準(zhǔn)色譜圖（圖2）相一致，這就是蟲草素，峰表顯示含量為44.86%。由于蟲草素粗提品含有較多的雜質(zhì)，直接用于高速逆流色譜進(jìn)行分離純化難度比較大，于是將超高壓提取液先后通過150 ku和15 ku陶瓷膜進(jìn)行除雜。采用高效液相色譜法對陶瓷膜透過液中蟲草素的含量進(jìn)行了測定，圖譜顯示色譜圖前面的雜質(zhì)峰有減少，為后續(xù)HSCCC純化減少了難度，且含量提高到了49.56%。本研究試驗數(shù)據(jù)顯示，10 g北蟲草培養(yǎng)殘基粉末超高壓提取后直接濃縮凍干后得到粗提物2.161 g，而經(jīng)過陶瓷膜除雜后再凍干得到的粗提物為0.763 g，可知，通過陶瓷膜截留了液體中大部分懸浮顆粒和引起濁度升高的大分子膠體物質(zhì)及其他雜質(zhì)，在較短的時間內(nèi)有效并充分地除去雜質(zhì)，得到質(zhì)量較好純度較高的蟲草素粗品。

圖2　蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC色譜Fig.2 HPLC chromatogram of cordycepin standard

3.4高速逆流色譜分離條件選擇

HSCCC分離的樣品在兩相溶劑體系中合適的分配系數(shù)K值為0.67～1.50［14］，當(dāng)K值過小時，峰之間的分離度較差；當(dāng)K值過大時，出峰時間太長且峰形變寬［15］。根據(jù)分離化合物特性，考察了蟲草素在6個溶劑系統(tǒng)中的K值，結(jié)果見表2。

圖3　超高壓提取后蟲草素的HPLC色譜Fig.3 HPLC chromatogram of cordycepin extracted by ultra high pressure

圖4　超高壓提取液透過陶瓷膜后蟲草素的HPLC色譜Fig.4 HPLC chromatogram of cordycepin filtrated by ultrafiltration ceramic membranes

表2　不同溶劑系統(tǒng)的分配系數(shù)Tab.2 Partition coefficient of different solvent systems

由表2可知，蟲草素在V（乙酸乙酯）∶V（正丁醇）∶V（水）=1∶4∶5和2∶3∶5的溶劑系統(tǒng)中的K值分別為1.072 4和1.059 1，K值均在合適范圍內(nèi)，但在體積比為1∶4∶5時，蟲草素與其他化合物不能完全分離且譜圖峰形未達(dá)到基線分離，且固定相保留率僅為40.67%。因此選擇V（乙酸乙酯）∶V（正丁醇）∶V（水）=2∶3∶5分離蟲草素。

在逆流色譜中，分離溫度、主機(jī)轉(zhuǎn)速和流動相流速影響固定相保留率和組分的分配系數(shù)。在主機(jī)轉(zhuǎn)速為900 r/min，流動相流速為3.0 mL/min條件下考察了不同溫度（15，20，25，30，35℃）對蟲草素固定相保留率和分配系數(shù)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離溫度為28℃時固定相保留率為52.7%，分離時間小于3 h。實驗從400 mg蟲草素粗品中可制備得蟲草素11.10 mg。HSCCC色譜圖見圖5，根據(jù)色譜圖接收3個流分，即“Ⅰ”，“Ⅱ”和“III”。

圖5　蟲草素粗提物的HSCCC色譜Fig.5 High speed counter-current chromatograms of cordycepin

3.5產(chǎn)物純度和化合物結(jié)構(gòu)的鑒定

HSCCC分離所得流分“III”經(jīng)HPLC檢驗并與蟲草素標(biāo)準(zhǔn)品比較，見圖6，峰純度為97.6%。對HSCCC分離得到的化合物在m/z 50～1 000范圍內(nèi)進(jìn)行質(zhì)譜掃描，得到該化合物的質(zhì)譜圖見圖7和m/z 251.8［M+ H］+，說明化合物的分子量為251，與蟲草素的分子量相同。進(jìn)一步將m/z=251.8 u作為母離子進(jìn)行二級質(zhì)譜分析，得到m/z 135.8 u等碎片離子，這與文獻(xiàn)［16-17］報道一致，證明分離的化合物為蟲草素。

3.6抗腫瘤活性研究

按照2.8所述選擇小鼠S180腫瘤模型對高速逆流色譜分離制備的蟲草素的體內(nèi)抗腫瘤活性進(jìn)行研究，具體實驗結(jié)果如表3。

由表3可知，通過高速逆流色譜從北蟲草固體培養(yǎng)殘基中分離制備得到的蟲草素對小鼠S180移植瘤有較強(qiáng)的抑制效果，隨劑量增加抑瘤效果增強(qiáng)，且通過與陽性對照藥物進(jìn)行比對，高劑量組的抑瘤率高于抗腫瘤藥CTX，體內(nèi)試驗直觀的表明了蟲草素良好的抑瘤效果。

4　結(jié) 論

本研究通過比較閃式提取、超聲波提取和超高壓提取北蟲草固體培養(yǎng)殘基中蟲草素，發(fā)現(xiàn)超高壓提取蟲草素得率更高、能耗更小以及效率更高。超高壓提取北蟲草中蟲草素的工藝參數(shù)為:超高壓提取壓力400 MPa，料液比1∶70，粉碎度20目，保壓時間12 min，提取2次。在此工藝條件下提取400 g北蟲草培養(yǎng)殘基中蟲草素得超高壓提取液經(jīng)過陶瓷膜初步除雜，真空濃縮后冷凍干燥得到蟲草素粗提物26.22 g，研究表明超高壓提取蟲草素是一種高效可靠的方法。

圖6　標(biāo)準(zhǔn)品和HSCCC分離純化后樣品的HPLC分析Fig.6 HPLC chromatograms of stand and HSCCC purified supernatant

圖7　HSCCC分離樣液的LC-MS/MS提取質(zhì)譜和離子流Fig.7 LC-MS/MS selection chromatogram and mass spectrum of HSCCC purified supernatant

表3　蟲草素對小鼠S180肉瘤的瘤重抑制率Tab.3 Tumor weight inhibition of cordycepin in mouse S180

對蟲草素粗提物進(jìn)行了高速逆流色譜分離純化，選擇V（乙酸乙酯）∶V（正丁醇）∶V（水）=2∶3∶5作為蟲草素分離體系。從400 mg蟲草素粗品中得到蟲草素11.10 mg且純度達(dá)到97.6%，提供了一種快速制備高純度蟲草素的方法。

通過小鼠S180體內(nèi)試驗發(fā)現(xiàn)從北蟲草固體培養(yǎng)基中富集純化的蟲草素具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，當(dāng)單獨使用蟲草素劑量為100 mg/（kg·d-1）時，對小鼠S180肉瘤抑制率達(dá)到64.48%，明顯高于抗腫瘤藥物環(huán)磷酰胺的抑制率。本研究不僅充分證明北蟲草固體培養(yǎng)殘基可以作為抗腫瘤藥物或保健品的較佳原料，同時也為培養(yǎng)基的開發(fā)與利用提供了參考依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ LIU Zhu，LIANG Zongqi，LIU Aiying.Effect of the components of medium on increasing the content of cordycepin［J］.Journal of Fungal Research，2003，1（1）:9.

［2］ HUANG Lanfang，LIANG Yizeng，GUO Fangqiu，et al. Simultaneous separation and determination of active components in Cordyceps sinensis and Cordyceps militaris by LC/ESI-MS［J］.Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2003，33（5）:1155-1162.

［3］ CHA J Y，AHN H Y，CHO Y S，et al.Protective effect of cordycepin-enriched Cordyceps militaris on alcoholic hepatotoxicity in Sprague-Dawley rats［J］.Food and Chemical Toxicology，2013，60（10）:52-57.

［4］ TULI H S，SANDHU S S，SHARMA A K.Pharmacological and therapeutic potential of cordyceps with special reference to cordycepin［J］.3 Biotech，2014，4（1）:1-12.

［5］ TULI H S，SHARMA A K，SANDHU S S，et al. Cordycepin:a bioactive metabolite with therapeutic potential［J］.Life Sciences，2013，93（23）:863-869.

［6］ 李娟，王顏紅，王世成，等.HPLC測定人工蛹蟲草培養(yǎng)基中的蟲草素［J］.光譜實驗室，2012，29（6）:3300-3304.

LI J，WANG Y H，WANG S C，et al.Determination of cordycepin in cultured Cordyceps medium by HPLC［J］. Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory，2012，29（6）:3300-3304.

［7］ ADRIAN W，EUGENE P M，CONSTANCE M M，et al. Preparative separation of isomeric sulfophthalic acids by conventional and pH-zone-refining counter-current chromatography［J］.Journal Chromatography A，2002，966:111-118.

［8］ LI Huabin，CHEN Feng，ZHANG Tianyou，et al.Preparative isolation and purification of lutein from the microalga Chlorella vulgaris by high-speed counter-current chromatography［J］.Journal Chromatography A，2001，905（1-2）:151-155.

［9］ BERTHOD A.Countercurrent chromatography，the support-free liquid stationary phase，comprehensive analytical chemistry［M］.Amsterdam:Elsevier Science B V，2002:201-260.

［10］ 中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.蟲草制品中蟲草素和腺苷的測定高效液相色譜法:NY/T 2116—2012［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2012.

［11］ 陳建行，劉鷺，孫顏君，等.酪蛋白膠束粉的陶瓷膜分離生產(chǎn)工藝［J］.農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2013，29（9）:256-266. CHEN J H，LIU L，SUN Y J，et al.Pilot scale production process of micellar casein concentrate powder［J］. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering，2013，29（9）:256-266.

［12］ 劉永玲，陳濤，陳晨，等.半制備型高速逆流色譜分離制備鐵棒錘根中的一種咪唑生物堿［J］.色譜，2014，32（5）:543-546.

LIU Y L，CHEN T，CHEN C，et al.Isolation and preparation of an imidazole alkaloid from radix of Aconitum pendulum Busch by semi-preparative high-speed countercurrent chromatography［J］.Chinese Journal of Chromatography，2014，32（5）:543-546.

［13］ 黃蘭芳，郭方遒，梁逸曾，等.HPLC-ESI-MS測定冬蟲夏草和蠶蛹蟲草中腺苷和蟲草素含量［J］.中國中藥雜志，2004，29（8）:762-764.

HUANG L F，GUO F Q，LIANG Y C，et al.Determination of adenosine and cordycepin in Cordyceps sinensis and C.militarris with HPLC-ESI-MS［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2004，29（8）:762-764.

［14］ 曹學(xué)麗.高速逆流色譜分離技術(shù)及應(yīng)用［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2005:40-42.

［15］ CONWAY W D，PETROSKI R J.Modern counter-currentchromatography［M］.Washington:American Chemical Society，1995:78-86.

［16］ 劉靜明，鐘裕容，楊智，等.蛹蟲草化學(xué)成分分析［J］.中國中藥雜志，1989，14（10）:32-33.

［17］ 陳順志，褚景芝.蟲草素及2'-脫氧腺苷的超導(dǎo)核磁共振與紅外光譜鑒別［J］.中國抗生素雜志，1996，21（1/2）:9-12.

Extraction，Purification，and Antitumor Activity of Cordycepin from Cordyceps Militaris Residue Medium

CHEN Libing1，2，WU Guangxu2，CHENG Wei1，F(xiàn)AN Xiuzhi1，SHI Defang1，SHI Meng3，GAO Hong1，*
（1.Research Institute of Agricultural Products Processing and Nuclear-Agricultural Technology，Hubei Academy of Agricultural Sciences，Wuhan 430064，China；2.College of Life Science，Yangtze University，Jingzhou 434025，China；3.Hubei Xinguan Food Science and Technology Co Ltd，Huangshi 435200，China）

Flash extraction，ultrasonic extraction，and ultra-high pressure extraction technology were used to extract cordycepin from Cordyceps militaris residue medium.The extracting solution was filtered with ceramic membrane and cordycepin was separated and prepared by using high-speed countercurrent chromatography（HSCCC）.The product structure was identified by LC-MS/MS.Antitumor activity of cordycepin was tested in mice S180 tumor.The results showed that ultra-high pressure extraction technology was better for cordycepin extraction.Combining a two-phase solvent system composed of ethyl acetate-n-butanol-water（2∶3∶5，V/V/V）with high-speed counter-current chromatography（HSCCC），the cordycepin was purified at 28℃with flow rate of 3.0 mL/min and revolution speed was 900 r/min，while the upper phase was stationary phase and the lower phase was mobile phase.Cordycepin identified was identified by LC-MS/MS and the purity of cordycepin was 97.6%.About 181.90 mg of cordycepin was obtained from 100 g of Cordyceps militaris residue medium.The inhibition rate of cordycepin was 64.48% at doses of 100 mg in vitro test.

Cordyceps militaris medium；cordycepin；extraction；high speed counter-current chromatography；antitumor activity

TS209；R284.2

A

10.3969/j.issn.2095-6002.2016.04.013

2095-6002（2016）04-0073-07引用格式：陳麗冰，吳光旭，程薇，等.北蟲草培養(yǎng)殘基中蟲草素的提取純化及抗腫瘤活性［J］.食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報，2016，34（4）:73-79.

（責(zé)任編輯:李 寧）

20150429

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）專項（201303080）；湖北省科技支撐計劃項目（2015BBA205）；湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心資助項目（2016-620-000-001-033）。

陳麗冰，女，碩士研究生，研究方向為食品生物技術(shù)；

*高 虹，男，研究員，博士，主要從事食藥用菌深加工和功能食品開發(fā)方面的研究。通信作者。