五氯酚鈉膠體金快速檢測(cè)試紙條的研制

羅曉琴 ，韓 深，呂艷秋，劉 螢，曹東山，王建霞

(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 100026；4.北京市昌平區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102200)

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五氯酚鈉膠體金快速檢測(cè)試紙條的研制

羅曉琴1,2，韓 深3，呂艷秋4，劉 螢3，曹東山1,2，王建霞1,2

(1.北京勤邦生物技術(shù)有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心，北京 102206；3.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京 100026；4.北京市昌平區(qū)動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，北京102200)

[目的]研制五氯酚鈉膠體金快速檢測(cè)試紙條。[方法]利用膠體金免疫層析技術(shù)，研制一種快速檢測(cè)豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦、水質(zhì)中五氯酚鈉的試紙條。[結(jié)果]經(jīng)測(cè)試，該試紙條對(duì)豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦的檢測(cè)限為1 μg/kg，對(duì)水質(zhì)的檢測(cè)限為2 μg/kg，檢測(cè)時(shí)間為15 min，假陽(yáng)性率和假陰性率均為0。[結(jié)論]該方法準(zhǔn)確、可靠，使用簡(jiǎn)便，適合大量樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

五氯酚鈉；膠體金免疫層析試紙條；快速檢測(cè)

五氯酚鈉(PentachlorophenoI-Na，簡(jiǎn)寫(xiě)PCP-Na)是五氯酚的鈉鹽，屬于有機(jī)氯農(nóng)藥，可作為殺蟲(chóng)劑、抗菌劑、防腐劑使用[1-3]。五氯酚鈉易在動(dòng)物體內(nèi)富集，能夠通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，嚴(yán)重危害人體健康[4-5]。因此，美國(guó)環(huán)境保護(hù)署(EPA)將五氯酚鈉列為可疑致癌物質(zhì)，并限制其使用[6]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部于2002年也將五氯酚鈉列入《食品動(dòng)物禁用的獸藥及其化合物清單》，禁止在水生動(dòng)物養(yǎng)殖中使用[7]。

GB 29708—2013《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 動(dòng)物性食品中五氯酚鈉殘留量的測(cè)定》、HJ 591—2010《水質(zhì) 五氯酚的測(cè)定 氣相色譜法》分別使用氣相色譜-質(zhì)譜法、氣相色譜法測(cè)定動(dòng)物性食品以及水質(zhì)中的五氯酚鈉殘留量[8]。目前，國(guó)內(nèi)對(duì)于五氯酚鈉的分析方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-電子捕獲法、氣相色譜-氫火焰法等[9-15]。該方法具有靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，但資金和人員等投入成本較高。針對(duì)五氯酚鈉檢測(cè)技術(shù)上的不足，筆者設(shè)計(jì)了一種利用膠體金免疫層析技術(shù)檢測(cè)豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦、水質(zhì)等樣本中五氯酚鈉的方法，該方法特異性好、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)成本低，適合于批量樣品的篩選檢測(cè)，是理想的快速篩選手段，能夠更好地滿足我國(guó)豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦、水質(zhì)等樣本企業(yè)、政府職能監(jiān)管部門(mén)等開(kāi)展檢測(cè)工作。

1　材料與方法

1.1材料與儀器五氯酚鈉、各種交叉反應(yīng)藥物(純度≥95%)等標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；氯金酸(HAuCl4·3H2O)、卵清蛋白(OVA) 均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；檸檬酸三鈉、碳酸鉀購(gòu)自北京百欣試劑公司；樣本提取劑、樣本復(fù)溶液由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供；渦旋儀、均質(zhì)器均購(gòu)自湖南湘立科學(xué)儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1五氯酚鈉半抗原的制備。1.0 g五氯酚鈉與4溴丁酸乙酯在DMF中，在無(wú)水碳酸鉀與碘化鈉的催化下，反應(yīng)生成五氯酚-4溴丁酸乙酯產(chǎn)物，經(jīng)乙酸乙酯萃取，水洗，柱層析純化分離，得到中間產(chǎn)物，中間產(chǎn)物在氫氧化鉀的水溶液中加熱反應(yīng)，水解生成半抗原，經(jīng)乙酸乙酯提取，二氯甲烷重結(jié)晶，得到半抗原產(chǎn)物(圖1)。

圖1　五氯酚鈉半抗原合成Fig.1　Half antigen synthesis of pentachlorophenol-Na

取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測(cè)定，化學(xué)位移在4.0 ppm處為鄰近酚氧的亞甲基信號(hào)峰，2.0 ppm處兩組為亞甲基信號(hào)峰，11 ppm處為羧基氫信號(hào)峰，說(shuō)明半抗原合成成功。

1.2.2免疫原的制備——五氯酚鈉半抗原與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián)物合成。取18 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，得到溶液(1)，取氯甲酸異丁酯50 μL加入(1)中，4 ℃下攪拌30 min，得到反應(yīng)液A。稱取BSA 50 mg，使之充分溶解在4.0 mL PBS(pH 7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d,每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3包被原的制備——五氯酚鈉半抗原與卵清蛋白(OVA)偶聯(lián)物合成。取18 mg半抗原，溶解于1 mL DMF中，得到溶液(1)，取氯甲酸異丁酯50 μL加入(1)中，4 ℃下攪拌30 min，得到反應(yīng)液A。稱取OVA 50 mg，使之充分溶解在4.0 mL PBS(pH 7.2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24 h，用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d，每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。分裝，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的制備。在磁力攪拌下，用0.2 mol/L碳酸鉀溶液調(diào)膠體金的pH至7.2，按1 mL膠體金溶液中加入60 μg的標(biāo)準(zhǔn)向膠體金溶液中加入五氯酚鈉單克隆抗體，攪拌混勻，室溫靜置10 min，加入10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在膠體金溶液中的終濃度為1%(體積百分含量)，靜置10 min。離心、洗滌、重懸，置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干。將五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物凍干至微孔試劑上，向微孔試劑微孔板中加入100 μL五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物，放入冷凍干燥機(jī)中，在冷阱溫度為-50 ℃下，預(yù)凍3 h后，再真空干燥15 h，即可取出，得到凍干有五氯酚鈉單克隆抗體-膠體金標(biāo)記物的微孔試劑，密封保存。

1.2.6樣本前處理方法。豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣本前處理：取已去脂肪的組織樣本于均質(zhì)器中均質(zhì)；稱取2 g勻漿好的組織樣本至15 mL聚苯乙烯離心管中，加入1瓶樣本提取劑，用渦旋儀渦動(dòng)3 min，室溫(20～25 ℃)3 000 r/min下離心5 min；移取3 mL上層有機(jī)相至10 mL聚苯乙烯離心管中，于50～60 ℃水浴氮?dú)饬骰蚩諝饬飨麓蹈?；加?00 mL樣本復(fù)溶液，用渦旋儀渦動(dòng)20 s后待檢。水質(zhì)樣本：無(wú)需前處理。

1.2.7檢測(cè)方法。用微量移液器吸取100 μL待檢樣本溶液于微孔中，緩慢抽吸且充分與微孔中試劑混勻。室溫(20～25 ℃)孵育3 min后，吸取混勻液約70 uL垂直滴于組裝好的試紙條。液體流動(dòng)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，反應(yīng)10 min，根據(jù)示意圖判定結(jié)果或通過(guò)膠體金分析儀讀取檢測(cè)結(jié)果(圖2)。其他時(shí)間判讀無(wú)效。

圖2　五氯酚鈉膠體金試紙條結(jié)果判定示意Fig.2　Judgement of pentachlorophenol-Na gold immunochromatography assay strip

1.2.8樣本檢測(cè)限。在空白豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣本中，分別添加五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/L，在空白水質(zhì)樣本中分別添加五氯酚鈉標(biāo)準(zhǔn)品至質(zhì)量濃度為0、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/L，按照“1.2.7”所述方法用3批試紙條進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)濃度重復(fù)5次，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果確定樣本檢測(cè)限。

1.2.9試紙條的特異性。分別配制1 000 μg/L硝基呋喃類藥物、氯霉素等藥物，用此試紙條檢測(cè)，重復(fù)3次，判斷試紙條的特異性。

1.2.10準(zhǔn)確性。農(nóng)業(yè)部文件要求膠體金免疫層析法的準(zhǔn)確性以假陽(yáng)性率和假陰性率表示[9]。取空白豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣品和添加五氯酚鈉質(zhì)量濃度為1 μg/L的陽(yáng)性豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣品各50份，取空白水質(zhì)樣品和添加五氯酚鈉質(zhì)量濃度為1 μg/L的陽(yáng)性水質(zhì)樣品各50份，用試紙條進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算假陽(yáng)性率和假陰性率。

1.2.11試紙條的重復(fù)性。從3個(gè)批次中隨機(jī)抽取試紙條，對(duì)空白豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦和添加五氯酚鈉質(zhì)量濃度為1 μg/L的陽(yáng)性豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣品，以及空白水質(zhì)和添加五氯酚鈉質(zhì)量濃度為2 μg/L的陽(yáng)性水質(zhì)樣品進(jìn)行3次重復(fù)測(cè)定，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的重復(fù)性。

1.2.12試紙條的穩(wěn)定性。將足量的試紙條保存于2～8 ℃環(huán)境中，每隔30 d取出適量，分別檢測(cè)空白豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣品和添加五氯酚鈉質(zhì)量濃度為1 μg/L的陽(yáng)性豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣品各10份，以及空白水質(zhì)樣品、添加五氯酚鈉質(zhì)量濃度為2 μg/L的陽(yáng)性水質(zhì)樣品各10份，重復(fù)測(cè)定2次，根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果判定試紙條的穩(wěn)定性。

2　結(jié)果與分析

2.1樣本檢測(cè)限用試紙條檢測(cè)五氯酚鈉濃度分別為0、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/L的豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣品，0、1.0、1.5、2.0、2.5 μg/L的水質(zhì)樣品，按照“1.2.7”方法進(jìn)行檢測(cè)，確定檢測(cè)限。以僅出現(xiàn)C線時(shí)的最低標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度作為試紙條的檢測(cè)限。由表1可知，該試紙條檢測(cè)限為1 μg/kg。

2.2特異性該試紙條檢測(cè)1 000 μg/L硝基呋喃類藥物、氯霉素等藥物，結(jié)果均呈陰性，即與其他藥物無(wú)交叉反應(yīng)，該試紙條特異性強(qiáng)。

2.3準(zhǔn)確性該試紙條檢測(cè)的50份空白豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦、水質(zhì)樣品，均顯示為陰性，假陽(yáng)性率低于5%；添加五氯酚鈉質(zhì)量濃度為1 μg/L的50份陽(yáng)性豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦樣品以及2 μg/L的50份陽(yáng)性水質(zhì)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，試紙條假陰性率為0，符合要求。

表1五氯酚鈉快速檢測(cè)試紙條的檢測(cè)限

Table 1Detection limit of pentachlorophenol-Na rapid detection strip

五氯酚鈉濃度Pentachlorophenol-Naconcentrationμg/L豬肉Pork雞肉Chicken魚(yú)Fish蝦Shrimp水質(zhì)Waterquality0-----0.5----1.0++++-1.5++++-2.0+++++2.5+

注：- 表示陰性，+ 表示陽(yáng)性。

Note：- stands for negative,+ stands for positive.

2.4重復(fù)性和穩(wěn)定性經(jīng)驗(yàn)證，該試紙條的批內(nèi)和批間重復(fù)性良好，在2～8 ℃下能夠保存12個(gè)月；從第13個(gè)月起，試紙條出現(xiàn)失效、假陰性等現(xiàn)象。

3　討論

(1)通過(guò)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)目前檢測(cè)動(dòng)物組織中五氯酚鈉殘留量的方法較少，主要集中在水樣、土壤、皮革、紡織品等方面，尚未發(fā)現(xiàn)能夠同時(shí)檢測(cè)豬肉、雞肉、魚(yú)、蝦、水質(zhì)中五氯酚鈉的膠體金試紙等的報(bào)道。該研究的五氯酚鈉膠體金試紙條操作簡(jiǎn)便，無(wú)需設(shè)備，操作時(shí)間僅需15 min，能夠達(dá)到定性檢測(cè)水平。由于試紙條方便、快捷、成本較低，非常適用于我國(guó)基層檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室、政府部門(mén)的市場(chǎng)監(jiān)控檢測(cè)、臨時(shí)抽檢、排查工作中廣泛推廣使用，且能夠解決基層單位因設(shè)備和經(jīng)費(fèi)問(wèn)題而較難開(kāi)展食品中殘留物檢測(cè)和監(jiān)控等工作的問(wèn)題，為農(nóng)業(yè)質(zhì)檢、衛(wèi)生部、工商管理、養(yǎng)殖業(yè)等機(jī)構(gòu)的食品安全檢測(cè)提供檢測(cè)技術(shù)及產(chǎn)品[16]。

(2)五氯酚鈉半抗原通過(guò)五氯酚鈉與4-溴丁酸乙酯等反應(yīng)制備而成，由此制備的半抗原進(jìn)而制備成免疫原和包被原，制備方法均不繁瑣，便于商業(yè)化生產(chǎn)。

(3)該研究制備的試紙條假陰性率為0，假陽(yáng)性率低于5%，且在2～8 ℃下能夠保存12個(gè)月，說(shuō)明該試紙條穩(wěn)定性良好，適于基層實(shí)驗(yàn)室使用。

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Study on Gold Immunochromatography Assay for Rapid Detection of Pentachlorophenol-Na

LUO Xiao-qin1,2,HAN Shen3,LU Yan-qiu4et al

(1.Beijing Kwinbon Biotechnology Company,Beijing 102206;2.Beijing Engineering Research Centre of Food Safety Immunodetection,Beijing 102206;3.Beijing Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau,Beijing 100026;4.Beijing Changping District Animal Disease Prevention and Control Center,Beijing 102200)

[Objective]The aim was to study gold immunochromatography assay strip for rapid detection of pentachlorophenol-Na.[Method]By using gold immunochromatography assay,strip for rapid detection of pentachlorophenol-Na in pork,chicken,fish,shrimp and water quality was developed.[Result]The limit of detection was 1 μg/kg in pork,chicken,fish,shrimp flesh,and 2 μg/kg in water.The results could be obtained in 15 minutes.The assay gave no false positive and false negative results.[Conclusion]The method is accurate,simple,reliable and convenient to rapidly detect pentachlorophenol-Na on the spot.

Pentachlorophenol-Na;Gold immunochromatography assay strip;Rapid detection

北京市科技計(jì)劃課題“城市地下水和地表水中PPCPs微污染物新型檢測(cè)技術(shù)、降解工藝及專項(xiàng)設(shè)備的研發(fā)”(Z151100002115059)。

羅曉琴(1984- )，女，廣西南寧人，高級(jí)工程師，從事食品安全檢測(cè)技術(shù)研究。

2016-07-06

TS 207

A

0517-6611(2016)25-055-03