外周血鐵調素25 mRNA及蛋白表達水平在白血病患兒中的臨床價值

楊衛(wèi)紅　李培嶺　李樹軍

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院1兒科，2小兒內一科，3小兒內三科，河南　新鄉(xiāng)　453100

外周血鐵調素25 mRNA及蛋白表達水平在白血病患兒中的臨床價值

楊衛(wèi)紅1#李培嶺2李樹軍3

新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院1兒科，2小兒內一科，3小兒內三科，河南新鄉(xiāng)453100

目的觀察急性淋巴細胞白血病（ALL）患兒外周血鐵調素25（Hepc-25）mRNA和蛋白表達情況，并探討其與ALL化療療效的關系。方法選取接受MR方案治療的白血病患兒93例作為觀察組，另選取同期20例健康體檢兒童作為對照組。采用實時定量聚合酶鏈反應（RT-PCR）和酶聯免疫吸附法（ELISA）測定兩組外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平。分析Hepc-25與ALL療效的關系。結果白血病患兒外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表達水平均高于對照組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；經治療好轉組患兒外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表達水平較治療前均下降（P＜0.05）；而治療無效組患兒Hepc-25 mRNA及蛋白表達水平較治療前比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。結論ALL患兒外周血Hepc-25過表達對疾病復發(fā)有一定的預測價值，與白血病患兒的化療療效有密切關系。

急性淋巴細胞白血病；患兒；Hepc-25；化療療效

Oncol Prog，2016，14（4）

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一類造血干細胞的惡性克隆性疾病，其特點是骨髓及其他造血組織中大量無核細胞增殖失控，分化障礙，凋亡受阻，停止在細胞發(fā)育的不同階段，而白血病細胞大量增生累積，并浸潤其他組織和器官，進而導致正常造血功能受到抑制。主要臨床癥狀有不同程度的貧血、出血、感染、發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結腫大和骨骼疼痛［1-2］。白血病的發(fā)病率在兒童惡性腫瘤中占首位，且病死率高，是5歲以上兒童死亡的主要原因之一。近年來對白血病的研究主要集中在臨床診斷和治療方面，其相關流行病學、病因學的研究也獲得了一些進展［3-5］。鐵調素（hepcidin，Hepc）是一種由肝臟細胞產生的具有廣譜殺菌抑菌作用的抗菌肽，可以抑制腸道鐵吸收和單核巨噬細胞系統(tǒng)鐵釋放，是一種重要的負性鐵調節(jié)激素［6-7］。此外，慢性感染、炎癥、缺氧以及其他慢性疾病所引起的貧血也與Hepc有密切聯系，近幾年的研究證實，Hepc過表達可作為炎癥引發(fā)貧血的重要病理指標，而Hepc缺乏則導致多數家族性血色沉著病和無效性紅細胞生成性貧血伴隨鐵離子吸收增加，其中，Hepc-25是其主要活性部分［8-10］。目前，國內外對Hepc-25在白血病中的發(fā)生與疾病進展機制研究鮮見報道，本研究觀察分析了白血病患兒外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達情況，并探討其在白血病疾病發(fā)展以及治療中的臨床意義?，F報道如下。

1　對象與方法

1.1研究對象

經新鄉(xiāng)醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，選取2011年2月至2014年2月該院接受治療的白血病患兒93例作為觀察組。入選標準：①所有患兒均根據兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第四次修訂草案）確診為ALL［11］；②排除慢性炎癥、貧血或者其他自身免疫性疾病患兒；③排除肝功能異?；純?；④所有參與研究者均由家長簽署知情同意書。觀察組男性63例，女性30例，年齡2～13歲，平均年齡（8.7±2.4）歲。所有患兒均根據文獻［11］的標準化療方案進行治療。同時隨機選取接受體檢的20例健康兒童作為對照組。

1.2儀器與試劑

人淋巴細胞分離液購自美國MP Biomedicals公司；SYBR Green通用型qPCR Master M ix購自Roche生物公司；RT-PCR擴增儀購自Bio-Rad公司；逆轉率試劑盒購自TAKARA公司；Hepc-25蛋白ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.3檢測方法

1.3.1RT-PCR分析外周血Hepc-25 mRNA變化抽取觀察組患兒治療前與治療后抗凝外周血各5 m l，并抽取對照組健康兒童外周血作為對照。根據RNA提取試劑盒說明書和逆轉錄試劑盒提取RNA，并逆轉錄為cDNA。根據GeneBank提供的Hepc-25序列，設計如下引物：Hepc-25-F：5'-ACGGCACGATCGCACTGAGC-3'；Hepc-25-R：5'-TCGCCTCCTTCGCCTCTGGA-3'。β-Actin-F：5'-GCGGGAAATCGTGCGTGAC-3'；β-Actin-R：CGTCATACTCCTGCTTGCTG-3'。采用實時熒光定量PCR儀分析Hepc-25mRNA的表達水平。

1.3.2ELISA分析外周血Hepc-25蛋白表達水平抽取觀察組患兒治療前和治療后抗凝外周血各2 m l，于4000 r/m in離心10 m in，取血清用于ELISA檢測，嚴格規(guī)范采用ELISA檢測Hepc-25蛋白表達情況，每個樣本和標準品均設置3個復孔，并于酶標儀上以492 nm波長測OD值。采用同種方法檢測對照組兒童外周血Hepc-25蛋白表達水平。

1.4隨訪與觀察終點

治療后根據《兒童急性淋巴細胞白血病診療建議（第三次修訂草案）》療效評判標準進行療效評價［11］，分為完全緩解、部分緩解和未緩解。好轉率=（完全緩解+部分緩解）例數/總例數×100%，未緩解視為治療無效。隨訪至2014年12月，對93例患兒均完成全部隨訪觀察，隨訪率為100%。

1.5統(tǒng)計學方法

所有數據均采用SPSS13.0軟-件進行統(tǒng)計分析，計量資料采用均數±標準差（±s）表示，采用t檢驗。相關性分析采用Pearson方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1兩組兒童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平比較

結果顯示，觀察組患兒外周血Hepc-25 mRNA水平高于對照組健康兒童（P=0.008）；觀察組患兒外周血Hepc-25蛋白表達水平亦高于對照組健康兒童，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。（表1）

表1　兩組兒童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白水平比較（±s）

表1　兩組兒童外周血Hepc-25 mRNA和蛋白水平比較（±s）

組別對照組（n=20）觀察組（n=93）Hepc-25 mRNA 1.01±0.32 5.48±1.01 Hepc-25蛋白（μg/m l）1.14±0.35 3.15±0.79

2.2觀察組患兒治療前后外周血Hepc-25 m RNA和蛋白表達水平比較

觀察組患兒經治療后隨訪結果顯示，完全緩解14例，部分緩解47例，未緩解32例。好轉率為64.89%。根據療效評價結果將觀察組分為好轉組（61例）與無效組（32例），好轉組患兒治療前外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平均低于無效組患兒，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.014、P=0.007）；治療后好轉組患兒Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平亦低于治療前（P＜0.01、P=0.012）；而無效組患兒Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平較治療前比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。（表2）2.3 Hepc-25 m RNA及蛋白表達水平與療效的關系

表2　觀察組不同療效患兒外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平比較（±s）

表2　觀察組不同療效患兒外周血Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平比較（±s）

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如上結果所述，Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平較高的患兒療效較差，而Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平較低的患兒療效較好。相關性分析顯示Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平與患兒的療效呈負相關（r=-1.032，P＜0.05）。

3　討論

急性淋巴細胞白血病是造血系統(tǒng)中惡性增生性疾病，亦是一個多因素，發(fā)病機制復雜的兒童最常見的惡性腫瘤。該病具有病程長、反復發(fā)作、需長期治療的特點，直接影響了兒童的身體發(fā)育、心理發(fā)展和社會適應能力，從而降低兒童的生存質量。近年來該病發(fā)病率呈上升趨勢，因此越來越受到研究人員的重視，但其致病因素仍無定論，因而較缺乏針對性的病因預防手段［12-13］。根據白血病細胞不成熟的程度和自然病程，將白血病分為急性淋巴細胞白血病和慢性淋巴細胞白血病兩類。由于白血病細胞惡性、無限制地增生，浸潤全身組織和臟器，直接影響了重要器官的功能以及正常血細胞的產生數量，使血細胞發(fā)生量與質的變化，從而導致患者出現貧血、出血和感染癥狀［14］。

Hepc-25具有廣譜殺菌、抑菌作用，屬于防御性蛋白家族。目前國內外多項研究已證實Hepc-25是Hepc的主要活性成分。Hepc由肝細胞分泌，又叫肝臟抗菌多肽。Hepc作為一種炎癥急性期反應蛋白，積極參與了機體對貧血、組織缺氧和炎癥的反應，不僅是鐵代謝重要的負性調節(jié)激素，而且在固有免疫、慢性炎癥性貧血等與鐵代謝相關性疾病中也具有一定作用［15-17］。研究顯示，貧血、組織缺氧和炎癥均可影響肝臟Hepc產生。此外，學者們亦發(fā)現Hepc-25還與多種炎性和轉錄因子相關，它們共同影響了炎性反應的發(fā)生［18-20］。Nicolas等［21］對慢性炎癥和貧血小鼠尿液的分析結果顯示，與對照組比較，Hepc的升高可達100倍，而在較輕的炎性疾病中，尿液中Hepc-25相應減少，且與血清急性期反應蛋白-鐵蛋白水平成正比。陳姣等［22］采用RT-PCR和ELISA法分析了54例多發(fā)性骨髓瘤患者外周血Hepc-25 mRNA及蛋白表達水平，研究Hepc-25的動態(tài)變化與患者臨床表現的相關性及對預后的臨床預測價值，結果發(fā)現，患者的Hepc-25蛋白表達水平高與慢性貧血密切相關，且較高水平的Hepc-25蛋白表達對臨床復發(fā)具有一定的預測價值，并與患者療效、預后有密切關系。

本研究檢測了白血病患兒外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平，研究結果顯示，與對照組比較，白血病患兒外周血中Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平均升高，提示Hepc-25蛋白表達水平是白血病發(fā)生過程中較敏感指標，并有可能成為白血病臨床輔助診斷指標。另外，本研究結果發(fā)現，好轉組患兒Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平低于無效組患兒，提示Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平可作為臨床判斷白血病患兒化療療效的預測指標。好轉組患兒在接受治療后Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平下降，無效組患兒治療前后Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義。進一步說明Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平與白血病患兒化療療效存在密切關系，原因可能是Hepc-25蛋白是一種炎癥急性期蛋白，其水平代表患兒機體炎性水平的高低，炎性水平愈高，則治療效果越不佳。

綜上所述，白血病患兒體內Hepc-25 mRNA和蛋白表達水平高于正常兒童，且與患兒的化療療效密切相關，對白血病患兒的臨床治療與復發(fā)診斷亦具有指導意義。

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The clinical significance of the expression of Hepc-25 mRNA and protein in peripheral blood of children w ith leukem ia

YANG Wei-hong1#LI Pei-ling2LI Shu-jun3
1Department of Pediatrics，2Department of Pediatric First Medical，3Pediatric Third Medical，First Affiliated Hospital of Xinxiang Medical College，Xinxiang 453100，He'nan，China

Objective To study the expression of Hepc-25 mRNA and protein in peripheral blood of children w ith leukemia and to explore the correlation between expression level and efficacy of chemotherapy.Method 93 cases of children w ith leukemia who were administered w ith MR regimen were included as study group，while another 20 cases of healthy children were enrolled as control group；peripheral blood was extracted to determine the Hepc-25 mRNA and protein levels using RT-PCR and ELISA；the correlation between Hepc-25 and efficacy was analyzed.Result Hepc-25 mRNA and protein levels in study group were significantly higher than those in the control group（P＜0.05）.After treatment，Hepc-25 mRNA and protein levels in children w ith response were significantly decreased（P＜0.05），and there were no significant differences before and after treatment in children w ithout response（P＞0.05）.Conclusion The expression of Hepc-25 in peripheral blood of children w ith leukem ia is high，which is useful in predicting recurrence，and is closely correlated w ith the efficacy of chemotherapy.

acute lymphoblastic leukem ia；children；Hepc-25；efficacy

R733.7

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.19

2015-07-06）

（corresponding author），郵箱：YWH120@163.com