乳腺癌患者血漿微泡BCRP mRNA水平的改變及其臨床分析△

吐爾遜江·艾力　地力下·司馬義　帕孜來提·阿布都熱西提　司馬義力·買買提尼亞孜#新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院內(nèi)科，教育部重點實驗室，乳腺放療科，烏魯木齊　800

乳腺癌患者血漿微泡BCRP mRNA水平的改變及其臨床分析△

吐爾遜江·艾力1地力下·司馬義2帕孜來提·阿布都熱西提3司馬義力·買買提尼亞孜3#
新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院1內(nèi)科，2教育部重點實驗室，3乳腺放療科，烏魯木齊830011

目的探討血漿微泡乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）mRNA水平與乳腺癌化療療效及乳腺癌組織相關基因的關系。方法選擇接受新輔助化療的乳腺癌患者60例作為乳腺癌組，選擇同時期健康體檢者60例作為對照組。檢測血漿微泡BCRP mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及乳腺癌組織相關基因中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9和增殖相關基因Survivin、Bcl-2 mRNA含量。結果乳腺癌組患者血漿微泡中BCRP mRNA含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（t=31.289，P＜0.05）；CR/PR組患者血漿微泡中BCRP mRNA含量低于SD/PD組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；乳腺癌組織中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA含量低于癌旁正常組織，增殖相關基因Survivin、Bcl-2 mRNA含量高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結論血漿微泡中BCRP的mRNA含量與caspase-3、caspase-9 mRNA含量呈負相關，與Survivin、Bcl-2 mRNA含量呈正相關。血漿微泡中BCRP mRNA含量可作為乳腺癌輔助化療療效的預測指標，為乳腺癌化療提供指導依據(jù)。

乳腺癌；化療；乳腺癌耐藥蛋白；增殖；凋亡

Oncol Prog，2016，14（4）

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，手術切除聯(lián)合化療、生物治療能夠有效地控制病情、延長生存時間、預防腫瘤復發(fā)。但是，仍有部分乳腺癌患者在化療過程中出現(xiàn)化療藥物耐藥，進而造成化療效果不佳［1］。多藥耐藥一直是影響乳腺癌化療效果的重要因素，探明乳腺癌患者多藥耐藥的原因以及在耐藥過程中發(fā)揮關鍵作用的分子是臨床乳腺癌化療的研究熱點［2］。乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）與乳腺癌化療耐藥密切相關［3］，本研究分析了血漿微泡乳腺癌耐藥蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平對乳腺癌化療療效的預測價值。

1　對象與方法

1.1研究對象

選擇2012年3月至2015年3月來新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院治療，經(jīng)病理活檢確診為乳腺癌并接受新輔助化療的60例患者作為研究的對照組，住院接受TA（紫杉醇+阿奇霉素）或TE（紫杉醇+表柔比星）化療方案，化療4個周期后評價效果并進行手術切除治療。選擇同期在我院體檢的60例健康者作為研究的健康對照組。乳腺癌組：年齡21～65歲，平均（45.82±6.65）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）20 kg/m2～26 kg/m2，平均（22.15±3.42）kg/m2；臨床分期：Ⅱ期8例，Ⅲ期52例；病理類型：浸潤性導管癌51例，浸潤性小葉癌5例，其他4例。對照組：年齡21～70歲，平均（45.90±6.25）歲；體質(zhì)量指數(shù)（BMI）20 kg/m2～27 kg/m2，平均（22.89±3.19）kg/m2。乳腺癌患者有明確的病理診斷，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，且所有受試對象均簽署知情同意書。兩組受試者年齡、BMI等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

>1.2儀器和材料

RNA提取試劑為Invitrogen公司生產(chǎn)；反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增的試劑購自Promega公司（引物序列：R：5′-GACTGGATGAGGTCGTCCGTTTCC-3′；F：5′-CAGCCGTGGAACTCTTTGGGTAGAGAAG-3′）；PCR儀購自Bio-rad公司；Ultra SYBR Mixture（With ROX）購自北京康為世紀生物科技有限公司；小鼠抗BCRP單克隆抗體購自英國Abcam公司；乳膠珠購自美國Life Technologies公司。

1.3實驗方法

1.3.1血漿微泡采集方法采集受試對象空腹外周靜脈血，置于EDTA抗凝管中，3000 r/min離心3 min后得到血漿，按照血漿與磷酸鹽緩沖液（PBS）1:2的比例稀釋血漿樣本，而后用500 g離心10 min并棄去細胞碎片，2000 g離心30 min并棄去血小板，10000 g離心70 min獲取沉淀，用20 μl PBS重懸后保存在-80℃冰箱待用。

1.3.2腫瘤標本采集方法術中采集乳腺癌組織和癌旁正常組織，經(jīng)病理學檢查確認組織性質(zhì)后，用生理鹽水清洗組織，在液氮中迅速冷凍，最后保存在-80℃。

1.3.3mRNA水平檢測方法微泡標本和組織標本分別用Trizol裂解液提取總RNA，采用MMLV試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄并得到cDNA標本，按照實時定量PCR方法進行擴增，擴增的基因包括BCRP、Caspase-3、Caspase-9、Survivin、Bcl-2，得到擴增曲線并對基因的mRNA相對含量進行計算。

1.4評價標準

臨床療效參照WHO實體瘤療效評價標準［4］，完全緩解（CR）：化療后腫瘤病灶完全消失；部分緩解（PR）：腫瘤兩個最大橫徑乘積減少大于50%；疾病穩(wěn)定（SD）：化療后腫瘤兩個最大橫徑乘積減少小于50%或增大小于25%；疾病進展（PD）：化療后腫瘤最大兩個橫徑乘積增大大于25%。

1.5統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0軟件錄入數(shù)-據(jù)并進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗，相關性分析可采用Pearson相關分析法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1乳腺癌組和對照組血漿微泡中BCRP mRNA含量比較

乳腺癌組患者血漿微泡中BCRP mRNA相對含量為（254.56±34.52），高于對照組的（100± 16.62），差異有統(tǒng)計學意義（t=31.289，P＜0.05）。

2.2乳腺癌組不同化療效果患者的血漿微泡中BCRP mRNA含量比較

60例乳腺癌患者化療兩個周期后按RECIST標準評價分為療效較好的CR/PR組42例（70.00%）和療效較差的SD/PD組18例（30.00%）。CR/PR組患者血漿微泡中BCRP mRNA含量為（173.77± 20.99），低于SD/PD組患者的（328.49±40.19），差異具有統(tǒng)計學意義（t=19.603，P＜0.05）。

2.3乳腺癌組癌組織與癌旁正常組織中凋亡、增殖基因的mRNA含量比較

乳腺癌組織中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9的mRNA含量低于癌旁正常組織，增殖相關基因Survivin、Bcl-2的mRNA含量高于癌旁正常組織，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.01），詳見表1。

2.4血漿微泡中BCRP mRNA含量與凋亡基因和增殖基因mRNA含量的相關性

血漿微泡中BCRP mRNA含量與組織中的caspase-3、caspase-9 mRNA含量呈負相關，與Survivin、Bcl-2的mRNA含量呈正相關。詳見表2。

表2　血漿微泡中BCRP mRNA含量與凋亡基因和增殖基因mRNA含量的相關性分析

表1　乳腺癌組癌組織與癌旁正常組織中凋亡、增殖基因的mRNA含量比較（±s）

表1　乳腺癌組癌組織與癌旁正常組織中凋亡、增殖基因的mRNA含量比較（±s）

組別癌組織癌旁正常組織凋亡基因Caspase-3 32.42±4.49 100±14.48 Caspase-9 25.69±3.05 100±16.04增殖基因Survivin 242.59±34.23 100±15.69 Bcl-2 309.59±44.23 100±17.06

3　討論

對于具有潛在手術機會的局部晚期乳腺癌手術患者而言，通過術前化療藥物的使用能夠縮小原發(fā)腫瘤病灶及轉(zhuǎn)移淋巴結體積，進而降低腫瘤TNM分期、提高手術切除的徹底性［5］。對于接受乳腺癌根治手術的患者而言，術后繼續(xù)接受新輔助化療和生物靶向治療能夠有效抑制殘留的微小病灶，預防腫瘤復發(fā)并延長患者生存時間［6］。綜合治療對于改善乳腺癌患者的預后具有重要價值，但是仍有部分患者在接受綜合治療后的效果欠佳，容易發(fā)生復發(fā)和轉(zhuǎn)移，其主要原因是腫瘤細胞對化療藥物產(chǎn)生了耐藥性，藥物無法有效抑制癌細胞［7］。

近年來，乳腺癌患者在化療過程中出現(xiàn)多藥耐藥的現(xiàn)象受到了越來越多的重視，多藥耐藥極大地影響了乳腺癌患者的化療效果［8］。相關研究顯示，多基因表達異常與乳腺癌多藥耐藥的發(fā)生有關［9］，其中乳腺癌耐藥蛋白是一類位于細胞膜表面的耐藥相關分子，由BCRP基因編碼，該蛋白的主要功能是介導細胞膜內(nèi)外藥物的轉(zhuǎn)運過程，具體過程為：BCRP通過水解ATP所提供的能量來將細胞內(nèi)的藥物轉(zhuǎn)運至細胞外［10］。這一過程能夠降低細胞內(nèi)藥物的濃度，若癌細胞的細胞膜上大量表達BCRP，則會造成化療藥物在癌細胞內(nèi)的濃度降低，無法產(chǎn)生有效的殺傷效應，進而表現(xiàn)為癌細胞對化療藥物的耐藥［11］。最新研究顯示，細胞微泡與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等病理過程密切相關。微泡是一種大多數(shù)細胞在生理或病理狀態(tài)下都會分泌的直徑在30～1000 nm之間的微小囊泡總稱，包括微粒（microparticle）或脫落小泡（shed vesicle）和外泌體（exosome），作為一種重要的細胞間通訊介質(zhì)，介導細胞間遺傳物質(zhì)的水平轉(zhuǎn)移，使相鄰細胞共享遺傳物質(zhì)，以達到組織內(nèi)相鄰細胞和不同細胞之間功能的相互協(xié)調(diào)。微泡可由細胞自發(fā)或激活因子的刺激下生成與釋放，是有“策略”地、主動地外排［12］，微泡膜上攜帶有母體細胞來源的抗原、脂質(zhì)，其內(nèi)含有核酸等生物大分子對疾病發(fā)生發(fā)展的影響成為研究熱點。有研究顯示腫瘤來源的血漿微泡與癌變、轉(zhuǎn)移等病理過程密切相關，在腫瘤發(fā)病機制研究中越來越受到人們的重視［13］。

本研究主要分析了乳腺癌患者血漿微泡中乳腺癌耐藥蛋白mRNA轉(zhuǎn)錄水平對乳腺癌化療療效的預測價值。首先，比較了乳腺癌患者和健康對照組血漿微泡乳腺癌耐藥蛋白的mRNA水平，結果顯示，乳腺癌組患者血漿微泡中BCRP mRNA含量高于對照組，這就初步明確血漿微泡乳腺癌耐藥蛋白mRNA水平增加與乳腺癌的發(fā)生密切相關。為了進一步明確血漿微泡乳腺癌耐藥蛋白與化療效果的關系，分析了不同化療效果患者血漿微泡中BCRP mRNA含量，結果顯示，CR/PR組患者血漿微泡中BCRP mRNA含量低于SD/PD組，提示血漿微泡中BCRP mRNA含量越低，化療效果越好，汪林軍［14］等文獻報道新輔助化療者BCRP mRNA含量（-2.32±0.75）明顯低于姑息化療者（-5.75±0.38），疾病控制組mRNA含量（-4.03± 0.71）明顯高于進展組（-6.30±0.44），與本文研究結果基本一致。

乳腺癌患者出現(xiàn)化療效果不佳、多藥耐藥后，化療藥物對癌細胞的殺傷作用減弱，原本對凋亡基因表達激活的作用以及對增殖基因表達抑制的作用減弱或喪失［15］。為了進一步明確血漿微泡中BCRP mRNA含量與化療效果的關系，我們分析了BCRP mRNA含量與凋亡、增殖基因mRNA含量的關系。通過檢測乳腺癌組織和癌旁正常組織中凋亡、增殖基因mRNA含量，得出乳腺癌組織中凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA含量低于癌旁正常組織，增殖相關基因Survivin、Bcl-2 mRNA含量高于癌旁正常組織，根據(jù)相關性分析得出，血漿微泡中BCRP mRNA含量與凋亡基因Caspase-3、Caspase-9 mRNA含量呈負相關，與增殖基因Survivin、Bcl-2 mRNA含量呈正相關。

綜上所述，血漿微泡乳腺癌耐藥蛋白BCRP mRNA水平與乳腺癌的發(fā)生以及化療耐藥有關，BCRP mRNA水平越高、化療效果越差。提示血漿微泡中BCRP mRNA含量可以作為乳腺癌輔助化療療效的預測指標，為乳腺癌化療提供指導依據(jù)。

［1］龔建平，姚宇鋒，唐金海，等.術前化療對乳腺部組織激素受體及耐藥基因蛋白表達的影響［J］.中國腫瘤臨床，2013，39（23）:1896-1898.

［2］胡巍，覃永堅.乳腺癌耐藥蛋白的表達及其與核轉(zhuǎn)錄因子snail相關性的臨床研究［J］.中國現(xiàn)代普通外科進展，2013，16（5）:362-365.

［3］A lfaras I，Perez M，Juan ME，et al.Involvement of Breast Cancer Resistance Protein（BCRP1/ABCG2）in the Bioavailability and Tissue Distribution of frans-Resveratrol in Knockout M ice［J］.J Agric Food Chem，2010，58（7）:4523-4528.

［4］Eisenhauer EA，Therasse P，Boqaerts J，et al.New response evaluation criteria in solid tumours:revised RECIST guideline（version 1.1）［J］.Eur J Cancer，2009，45（2）:228-247.

［5］任杰，李遒昶，李曉蕾，等.乳腺癌CYPB1的表達對紫杉醇耐藥性的影響［J］.中國腫瘤臨床，2012，39（23）:1904-1908.

［6］Soliman AA，Csorba R，Ullrich A，et al.Antiphopholipid antibodies and functional activated protein C resistance in patients w ith breast cancer during anthracycline-based chemotherapy adm inistered through an intravenous port-catheter device［J］.Clin ApplThromb Hemost，2014，20（3）:338-340.

［7］張彥收，劉運江.乳腺癌組織中BCRP的表達與新輔助化療療效的關系［J］.腫瘤防治研究，2014，41（5）:434-438.

［8］王莉莉，于超.丹皮酚對HepG2細胞藥物轉(zhuǎn)運體BCRP及SLCO1B1表達及功能的影響［J］.中國生化藥物雜志，2015，36（3）:6-9.

［9］Ginguene C，Champier J，Maallem S，et al.P-glycoprotein（ABCB1）and breast cancer resistance protein（ABCG2）localize in the microvessels forming the blood-tumor barrier in ependymomas［J］.Brain Pathol，2010，20（5）:926-935.

［10］齊彩霞.BCRP與P-gp在乳腺癌組織中的表達及其意義［J］.山西大同大學學報（自然科學版），2014，30（1）:52-54.

［11］汪林軍，王騰，吳小紅，等.血漿微泡乳腺癌耐藥蛋白mRNA水平對乳腺癌化療療效的預測價值［J］.中華實驗外科雜志，2015，32（5）:976-968.

［12］Mears R，Craven RA，Hanrahan S，et al.Proteom ic analysis of melanoma-derived exosomes by two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis and mass spectrometry［J］.Proteom ics，2004，4（12）:4019-4031.

［13］Al-Nedaw i K，Meehan B，M icallef J，et al.Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRv III by m icrovesicles derived from tumour cells［J］.Nat Cell Biol，2008，10（5）:619-624.

［14］畢瑋琳，王伏生，董紅霖.survivin-siRNA聯(lián)合化療藥物對乳腺癌MCF-7細胞凋亡及逆轉(zhuǎn)耐藥的研究［J］.腫瘤研究與臨床，2014，26（5）:310-314.

［15］陳淑如，黃宇康，吳楚成，等.miR-155對乳腺癌細胞增殖、凋亡及耐藥蛋白表達的調(diào)控作用研究［J］.臨床腫瘤學雜志，2015，20（2）:108-111.

Clinical analysis of the BCRP mRNA level in plasma microvesicles of breast cancer patients△

TU'ERSUNJIANG Ai-li DILIXIA Si-mayi PAZILAITI A-budurexiti SIMAYILI Mai-maitiniyazi
1Department of Medicine，2Key Laboratory，M inistry of Education，3Department of Breast Radiation Oncology，Tumor Hospital of Xinjiang Medical University，Xinjiang，830011，China

Objective To investigate the relationship between the breast cancer resistance protein（BCRP）mRNA level in plasma m icrovesicles and efficacy of chemotherapy，and related genes.Method 60 cases of breast cancer patients who were given neoadjuvant chemotherapy were included as breast cancer group，while another 60 cases of healthy adults were enrolled as control group.The BCRP mRNA level in plasma microvesicles and the level of apoptosis related breast cancer genes，such as caspase-3，caspase-9 and proliferation related genes，including Survivin，Bcl-2 were analyzed.Result The BCRP mRNA level in plasma microvesicles were higher in breast cancer group as compared w ith control group，w ith significant difference observed（t=31.289，P＜0.05）；While the levels in CR/PR patients were lower in that of SD/PD patients，which were significantly different（P＜0.05）；For apoptosis genes，the mRNA of caspase-3 and caspase-9 were less in breast cancer tissues than in the adjacent normal tissues，while for the proliferation related genes，the mRNA of Survivin and Bcl-2 were higher in breast cancer tissues than in the adjacent normal tissues，and all differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion The mRNA level of BCRP in plasma m icrovesicles was negatively correlated w ith the mRNA levels of caspase-3 and caspase-9，while was positively correlated w ith the mRNA level of Survivin and Bcl-2.The BCRP mRNA level in plasma m icrovesicles is predictive for the efficacy of adjuvant chemotherapy in breast cancer，and is useful in guiding the chemotherapy for breast cancer.

breast cancer；chemotherapy；breast cancer resistance protein；proliferation；apoptosis

R737.9

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.141233#

2015-12-08）

新疆醫(yī)科大學科研創(chuàng)新基金（XJC201388）

（corresponding author），郵箱：497070959@qq.com