羧胺三唑與SAHA聯(lián)合用藥抑制Lew is肺癌細(xì)胞的體內(nèi)外研究Δ

郭磊　陳晨　吳宏亮　鞠瑞　朱蕾　李娟　葉菜英#中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理學(xué)系，北京00005中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院麻醉科，北京　000

羧胺三唑與SAHA聯(lián)合用藥抑制Lew is肺癌細(xì)胞的體內(nèi)外研究Δ

郭磊1*陳晨1*吳宏亮2鞠瑞1朱蕾1李娟1葉菜英1#
1中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所藥理學(xué)系，北京1000052中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院麻醉科，北京100021

目的研究羧胺三唑（CAI）與組蛋白去乙?；敢种苿┬炼１桨樊惲u肟酸（SAHA）聯(lián)合用藥對(duì)Lew is肺癌細(xì)胞的抑制作用，對(duì)比聯(lián)合用藥與單藥使用的藥效差異。方法采用SRB法檢測(cè)體外培養(yǎng)的Lew is肺癌細(xì)胞系在單獨(dú)使用CAI或SAHA以及聯(lián)合用藥時(shí)的細(xì)胞活力變化；建立C57小鼠Lew is肺癌細(xì)胞皮下移植瘤模型，隨機(jī)分為4組：溶劑對(duì)照組、CAI組、SAHA組、CAI+SAHA聯(lián)合治療組，連續(xù)給藥25天，觀察各組小鼠體質(zhì)量變化、腫瘤體積、腫瘤抑制率及動(dòng)物死亡情況。結(jié)果CAI分別和兩種劑量的SAHA聯(lián)合用藥后，對(duì)Lew is肺癌細(xì)胞活力的抑制作用高于CAI組，細(xì)胞活力的抑制率分別達(dá)到46.09%±5.50%和54.43%±3.69%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，與對(duì)照組相比，CAI組、SAHA組以及聯(lián)合治療組均抑制小鼠皮下腫瘤生長(zhǎng)，且聯(lián)合治療組的腫瘤體積小于其他3組；除對(duì)照組外，各藥物治療組動(dòng)物死亡率均低于20%。結(jié)論SAHA與CAI聯(lián)合使用能顯著抑制Lew is肺癌細(xì)胞活力，并在Lew is肺癌細(xì)胞荷瘤動(dòng)物中顯現(xiàn)抗瘤增效作用。

Lew is肺癌細(xì)胞；羧胺三唑；辛二酰苯胺異羥肟酸；聯(lián)合用藥；體內(nèi)外研究

Kew words:Lew is lung carcinoma；carboxyam idotriazole；suberoylanilide hydroxam ic acid；combined treatment；in vitro and in vivo study

Oncol Prog，2016，14（4）

肺癌是目前全球死亡率最高的腫瘤之一，雖然針對(duì)特定類型的肺癌治療已取得突破性進(jìn)展，但大部分肺癌依然無(wú)法攻克，關(guān)于肺癌的藥物治療仍有極大的探索空間。羧胺三唑（carboxyam idotriazole，CAI）是本課題組多年來(lái)一直研究的一種小分子藥物，該藥物能夠抑制多種腫瘤細(xì)胞系的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，并可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡。體外實(shí)驗(yàn)中，CAI對(duì)于Lew is肺癌細(xì)胞、A549肺腺癌細(xì)胞、NCI-H209和H345小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖均有顯著抑制作用［1-2］，且CAI用于治療非小細(xì)胞肺癌的III期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中。本課題組在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，CAI單獨(dú)使用時(shí)相比細(xì)胞毒類藥物其抗腫瘤作用較弱，但其突出特點(diǎn)是不良反應(yīng)輕微。為了改進(jìn)羧胺三唑的抗腫瘤效果，特選取了一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxam ic acid，SAHA）進(jìn)行聯(lián)合用藥，從細(xì)胞水平和動(dòng)物水平評(píng)估兩種小分子藥物聯(lián)合使用的抗腫瘤效果，為建立高效低毒的肺癌治療方案提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

Lew is肺癌（lew is lung carcinoma，LLC）細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，用DMEM高糖培養(yǎng)基（加入10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺、50 mg/m l青霉素和100 mg/m l鏈霉素）在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。CAI由本課題組合成，高效液相色譜法檢測(cè)其純度達(dá)99%以上。SAHA購(gòu)自美國(guó)Selleck公司，用DMSO配制成10 mmol/L儲(chǔ)存液，-20℃保存?；酋Ａ_丹明B（sulforhodamine B，SRB）染料、二甲基亞砜（DMSO）購(gòu)自Sigma公司，三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）、乙酸、Tris堿購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-beta-cyclodextrin，HOP-β-CD）購(gòu)自百靈威科技有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠，雄性［許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004］，6～8周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司。常溫環(huán)境飼養(yǎng)［溫度（22±2）℃，濕度40%～70%］，12 h明/暗周期。動(dòng)物自由攝食、飲水。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1SRB法測(cè)定細(xì)胞活力將LLC細(xì)胞接種至96孔板，1×104/孔，培養(yǎng)12 h，待細(xì)胞貼壁后，棄去原培養(yǎng)基，分別加入空白培養(yǎng)基（不含血清）和含有DMSO、CA（I20 μM）、SAHA（1 μM和5 μM）以及SAHA（1 μM和5 μM）+CA（I20 μM）的完全培養(yǎng)基（含血清）200 μl進(jìn)行孵育，SAHA單藥及聯(lián)合用藥劑量參照同類研究用量而定［3］，每個(gè)劑量組4孔。藥物作用24 h后，每孔加入50 μl預(yù)冷的50%三氯乙酸進(jìn)行固定。4℃靜置1 h，去離子水洗滌5次。在空氣中晾干后，每孔加入1%乙酸配制的0.4%SRB染料100 μl，室溫靜置20 min。棄去染料后，用1%的乙酸洗滌5次，在空氣中晾干。用pH值為10.5的10 mM非緩沖Tris堿液150 μl溶解，振搖5 min后用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀在515 nm處測(cè)定吸光度。

1.3.2動(dòng)物接種腫瘤LLC細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿單層后用0.25%胰蛋白酶消化，將細(xì)胞懸液緩慢吹打混勻，1000 r/min離心5 m in，收集細(xì)胞，用滅菌的PBS重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/m l。每只小鼠取100 μl細(xì)胞懸液，皮下接種至左側(cè)腋窩。接種腫瘤細(xì)胞后第5天，在動(dòng)物腋窩下可觸到瘤結(jié)節(jié)，荷瘤動(dòng)物隨機(jī)分組并給藥，給藥方案如表1所示。

表1　CAI及SAHA單獨(dú)用藥與聯(lián)合用藥給藥方案

1.3.3測(cè)量腫瘤體積并評(píng)價(jià)腫瘤抑制率自接種腫瘤后第8天，每周測(cè)量3次腫瘤長(zhǎng)、寬直徑，根據(jù)如下公式，計(jì)算腫瘤體積（長(zhǎng)、寬單位：cm）：

1.3.4評(píng)價(jià)藥物毒性每日稱量小鼠體質(zhì)量，并繪制小鼠體質(zhì)量變化曲線。根據(jù)接種腫瘤后第5天（給藥前）和接種腫瘤后第29天（給藥后）的動(dòng)物體質(zhì)量，計(jì)算末體質(zhì)量（FBW）/初體質(zhì)量（IBW），其中FBW為29天時(shí)小鼠的去瘤體質(zhì)量。FBW/IBW≥0.85，提示藥物毒副作用輕微，小鼠能夠耐受；FBW/IBW＜0.85則提示小鼠對(duì)藥物有一定的不良反應(yīng)［4］；治療期間如果給藥組動(dòng)物死亡超過(guò)20%，表示藥物具有毒性。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。體外實(shí)驗(yàn)中，不同藥物處理組進(jìn)行單因素方差分析后，再進(jìn)行兩兩組間LSD-t檢驗(yàn)；動(dòng)物荷瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析，評(píng)價(jià)藥物單用及聯(lián)合用藥的抑瘤作用。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1CAI和SAHA單獨(dú)或聯(lián)合作用后對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用

藥物作用24 h后，CAI（20 μM）和SAHA（1 μM和5 μM）以及SAHA（1 μM和5 μM）+CAI（20 μM）均能夠顯著地降低LLC細(xì)胞的增殖活力，與溶劑對(duì)照組相比，分別下降了29.64%±2.42%（P＜0.01），13.03%±4.67%（P＜0.05）和39.56%±4.23%（P＜0.01）。CAI和兩種劑量SAHA聯(lián)合用藥組對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用明顯高于CAI單獨(dú)治療組，細(xì)胞活力的抑制率分別達(dá)到46.09%±5.50%和54.43%± 3.69%，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），SAHA對(duì)CAI的增效作用非常顯著（圖1）。

2.2CAI和SAHA單獨(dú)或聯(lián)合用藥對(duì)荷瘤小鼠腫瘤體積的影響

從接種腫瘤后第20天（動(dòng)物用藥第16天）開(kāi)始，CAI（30 mg/kg）與SAHA（50 mg/kg）聯(lián)合治療組的腫瘤體積開(kāi)始明顯小于溶劑對(duì)照（Control）組（P＜0.05），同時(shí)也小于單藥治療組；接種腫瘤后第22、25、27、29天，SAHA單藥治療組的抑瘤作用逐步明顯，腫瘤體積相比對(duì)照組顯著縮?。≒＜0.05，P＜0.01）；CAI單藥治療組腫瘤體積雖有縮小趨勢(shì)，但第22天和第25天的腫瘤體積與溶劑對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；自第27天起，溶劑對(duì)照組腫瘤體積進(jìn)一步增大，CAI組表現(xiàn)出顯著的抑瘤作用（P＜0.05）。CAI與SAHA聯(lián)合治療組的腫瘤體積則顯著小于對(duì)照組和各單藥治療組，兩者合用后的抗瘤增效作用十分明顯（圖2、圖3）。

圖1　CAI（20 μM）和SAHA（1μM和5μM）單獨(dú)或聯(lián)合作用后對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用

圖2　CAI組、SAHA組和聯(lián)合治療組荷瘤小鼠的腫瘤體積隨時(shí)間的變化

圖3　接種腫瘤后第8～29天各組小鼠腫瘤體積分布圖

2.3小鼠給藥前后的體重比值（FBW/IBW）及各組動(dòng)物的死亡情況

如表2所示，采用CAI（30 mg/kg）單藥、SAHA（50 mg/kg）單藥以及兩者聯(lián)合用藥治療25天后，各藥物治療組FBW/IBW值均大于0.85，提示藥物毒副作用不明顯，聯(lián)合用藥組的FBW/IBW為（0.99±0.05），相比單藥治療組并未減小，初步說(shuō)明在此劑量下聯(lián)合用藥時(shí)藥物的毒副作用沒(méi)有增加。除對(duì)照組有4只小鼠因腫瘤體積過(guò)大死亡外，藥物治療組動(dòng)物死亡比例均低于20%，亦說(shuō)明藥物的毒性低。

3　討論

羧胺三唑是一種非細(xì)胞毒類的新型抗癌藥物，它通過(guò)影響腫瘤細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)體系干擾腫瘤細(xì)胞周期及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤細(xì)胞增生和轉(zhuǎn)移［5-8］；此外，CAI還能夠阻滯腫瘤血管生長(zhǎng)因子（VEGF）的信號(hào)傳導(dǎo)通路，抑制腫瘤新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而抑制腫瘤新生血管的生成，抑制腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［9-10］。近年來(lái)，我們還證實(shí)CAI能明顯地減輕化學(xué)物質(zhì)引起的炎性反應(yīng)及減輕炎癥引起的疼痛，這一作用與其抑制多種炎性介質(zhì)釋放有關(guān)［11-12］。在美國(guó)進(jìn)行的有關(guān)CAI抗腫瘤作用的一些臨床試驗(yàn)未能得到理想的結(jié)果，迄今該藥物尚未通過(guò)美國(guó)FDA的批準(zhǔn)，但由于其作用靶點(diǎn)的特殊性，CAI不良反應(yīng)輕微，明顯低于細(xì)胞毒類藥物，在腫瘤治療領(lǐng)域仍具備獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，尋找高效低毒的聯(lián)合用藥方案或可彌補(bǔ)CAI的不足。

表2　CAI、SAHA及CAI+SAHA組荷瘤小鼠的體質(zhì)量變化和死亡情況（±s）

表2　CAI、SAHA及CAI+SAHA組荷瘤小鼠的體質(zhì)量變化和死亡情況（±s）

?

組蛋白去乙酰化酶抑制劑（histone deacetylases inhibitor，HDACi）是一類新型的抗腫瘤藥物，具有高效、低毒的特點(diǎn)，其作用于腫瘤細(xì)胞后能夠抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞分化或凋亡［13-14］。SAHA是最具代表性的組蛋白去乙?；敢种苿┲?，它能通過(guò)組蛋白的乙?；谷旧|(zhì)重塑為促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的疏松結(jié)構(gòu)，重新激活腫瘤細(xì)胞中由于異常的組蛋白去乙酰化而表達(dá)受阻的基因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［15］。本研究首次考察了CAI與SAHA聯(lián)合用藥的抗腫瘤效果，體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，較低濃度的SAHA（1 μM和5 μM）能夠明顯增強(qiáng)CAI抑制Lew is肺癌細(xì)胞增殖的能力；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)則進(jìn)一步證實(shí)SAHA（50 mg/kg）與CAI聯(lián)合使用較單藥更能有效地降低腫瘤負(fù)荷。而且，從荷瘤動(dòng)物的體質(zhì)量變化和死亡情況判斷，該劑量的SAHA并未增加藥物的毒性。

課題組近幾年對(duì)CAI的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了深入研究后發(fā)現(xiàn)，CAI能夠抑制腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），基于此機(jī)制，體外實(shí)驗(yàn)顯示其可抑制LLC細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，在LLC荷瘤動(dòng)物中降低腫瘤負(fù)荷并延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物生存期［2］。同樣，SAHA除了具有抗腫瘤作用之外，還具有抗炎和抑制血管新生的特性。SAHA可阻斷臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中VEGF信號(hào)通路，抑制體內(nèi)外致炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生［16-17］。因此，關(guān)于SAHA與CAI合用時(shí)的抗瘤增效機(jī)制，一方面可能源于SAHA通過(guò)組蛋白的乙酰化，重新激活腫瘤細(xì)胞中表達(dá)受阻的基因，與CAI協(xié)同誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡；另一方面也可能是兩者通過(guò)不同的、互補(bǔ)的機(jī)制抑制炎癥，從而延緩腫瘤的發(fā)生發(fā)展。從分子、細(xì)胞和整體水平上證實(shí)上述作用機(jī)制將是我們后續(xù)的重點(diǎn)研究?jī)?nèi)容。

SAHA與CAI聯(lián)合使用增加了對(duì)Lew is肺癌細(xì)胞的抑瘤效果而未增加毒副作用，這一優(yōu)勢(shì)為兩者今后在臨床上聯(lián)合使用、增效互補(bǔ)提供了理論依據(jù)，也代表了一種可能的新型、有效、耐受良好的化療方案。

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In vitro and in vivo study of the inhibitory effect of the combination of CAI and SAHA on Lew is lung carcinoma cellsΔ

GUO Lei1*CHEN Chen1*WU Hong-liang2JU Rui1ZHU Lei1LI Juan1YE Cai-ying1#
1Department of Pharmacology，Institute of Basic Medical Sciences，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100005，China
2Department of Anesthesiology，Cancer Hospital，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Beijing 100021，China

Objective To study the inhibitory effect of the combination of CAI and SAHA on Lew is lung carcinoma（LLC）and evaluate the pharmacodynam ic difference between the combined and single-agent treatment.Method SRB was performed to investigate the viability of LLC cells treated w ith CAI or SAHA alone，or in combination；LLC transplanted model was established in C57 m ice and the models were random ized into 4 groups，namely vehicle control group，CAI group，SAHA group and CAI+SAHA combination group.The indicated solvent or drugs were adm inistered continuously for 25 days and the change of body weight，tumor volume，tumor inhibition rate and death of mice were observed. Result The combinations of CAI and two different doses of SAHA showed stronger inhibitory effect on LLC cells viability than single CAI treatment.The inhibition rate of the combined treatment was 46.09%±5.50%and 54.43%±3.69%，（P＜0.01），respectively.In vivo experiment showed that all treatments，including single CAI，single SAHA and combined treatment significantly inhibited LLC tumor grow th compared w ith vehicle control.Moreover the tumor volume in mice treated w ith the combination was significantly smaller than that in control group and single-drug treated groups.Death rate of animals in all study groups but the control group was below 20%.Conclusion The combination of CAI and SAHA inhibits LLC cells viability significantly and shows synergistic anti-tumor effect in vivo.

R734.2

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2016.14.04.09

2016-03-16）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金（81402923）；北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院2015協(xié)同創(chuàng)新基金（3332015168）

*兩位作者對(duì)本文的貢獻(xiàn)一致

（corresponding author），郵箱：caiyingye@126.com