宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中組織微小RNA-21表達(dá)及高危型HPV病毒載量變化的意義

王彬

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·論著·

宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中組織微小RNA-21表達(dá)及高危型HPV病毒載量變化的意義

王彬

目的研究宮頸癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中組織微小RNA-21表達(dá)及高危型HPV病毒載量變化的意義。方法選取2011年3月至2015年3月收治的宮頸病變并行宮頸活檢的患者150例，CINⅠ組(n=39)、CINⅡ組(n=37)、CINⅢ組(n=34)，CC組 (n=40)，分析miR-21的表達(dá)及HR-HPV載量與宮頸癌臨床病理特征的聯(lián)系，miR-21的表達(dá)與HR-HPV載量的相關(guān)性，不同宮頸病變中miR-21的表達(dá)及HR-HPV載量。結(jié)果宮頸癌患者腫瘤細(xì)胞低分化者miR-21表達(dá)(6.12±0.83)低于中分化者(8.17±0.65)及高分化者(11.54±1.29)(P<0.05)；腫瘤細(xì)胞直徑>4 cm者HR-HPV載量(26.53±3.12)高于<4 cm者(23.60±2.85)(P<0.05)，F(xiàn)IGO分期Ⅰ～ⅡA者HR-HPV載量(23.86±2.34)低于ⅡB～Ⅳ者(27.59±3.12)；宮頸癌HR-HPV陽(yáng)性者miR-21表達(dá)(9.75±0.83)高于HR-HPV陰性者(5.47±0.46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；但miR-21表達(dá)及HR-HPV載量與宮頸癌年齡、FIGO分期、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；CINⅠ組HR-HPV陽(yáng)性患者(41.03%)分別低于CINⅡ組(67.57%)、CINⅢ組(85.29%)及CC組(92.50%)，CINⅠ組mi-R21相對(duì)表達(dá)水平(6.42±0.53)低于CINⅡ組(7.26±0.61)、CINⅢ組(8.24±0.65)及CC組(9.36±0.70)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論微小RNA-21表達(dá)可反應(yīng)宮頸癌細(xì)胞分化程度，高危型HPV病毒載量可反應(yīng)宮頸癌FIGO分期及腫瘤直徑范圍，微小RNA-21表達(dá)與高危型HPV病毒載量呈正相關(guān)，聯(lián)合檢查微小RNA-21及高危型病毒載量能夠提示宮頸癌前病變、宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。

相關(guān)性；微小RNA-21；高危型HPV病毒載量變化；宮頸癌

宮頸癌是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤。性生活紊亂、早婚、早育、多次分娩可增加宮頸癌的發(fā)病率。宮頸癌早期癥狀不明顯，病情進(jìn)展到一定程度可有陰道異常流血、白帶增多等癥狀。由宮頸癌前病變進(jìn)展為宮頸癌的時(shí)間很長(zhǎng)，因此盡早發(fā)現(xiàn)宮頸癌前病變與有效的阻斷治療能夠顯著降低宮頸癌的發(fā)病率[1]。人類乳頭狀瘤病毒(human papilloma virus,HPV)特異性極高，容易感染于機(jī)體表皮及黏膜鱗狀上皮，可分為高危型與低危型。高危型人類乳頭狀瘤病毒(high-risk human papilloma virus,HR-HPV)感染是宮頸癌的主要致病因素。但有學(xué)者報(bào)道，宮頸癌患者可有HR-HPV陰性表達(dá)，表明宮頸癌尚有其他致病因素[2]。微小核糖甘酸(small ribose monophosphate,miRNA)是一種內(nèi)源性非編碼RNA小分子，穩(wěn)定性強(qiáng)。miRNA可作為原癌基因或者抑癌基因，miR-21是典型的原癌基因，幾乎所有癌癥的發(fā)生、發(fā)展都有miR-21表達(dá)。本報(bào)告旨在研究組織微小RNA-21表達(dá)、高危型HPV病毒載量與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性。報(bào)告如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取我院2011年3月至2015年3月收治的宮頸病變并行宮頸活檢患者150例：納入標(biāo)準(zhǔn)[3]：(1)年齡35～55歲；(2)有性生活史且無(wú)子宮切除；(3)細(xì)胞學(xué)檢查異?；騂PV檢查陽(yáng)性者。排除：(1)已接受宮頸治療的患者；(2)其他惡性腫瘤、免疫性疾病、嚴(yán)重感染等其他合并疾病。所有患者填寫(xiě)知情同意書(shū)。其中CINⅠ組(宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變Ⅰ級(jí))39例、CINⅡ組(鱗狀上皮中度非典型增生Ⅱ級(jí))37例、CINⅢ組(鱗狀上皮重度非典型增生Ⅲ級(jí))34例，CC組 (子宮頸癌包括宮頸鱗癌和宮頸腺癌)40例。

1.2方法

1.2.1miR-21的檢測(cè)：①宮頸細(xì)胞病理學(xué)診斷：收集患者宮頸組織樣本，予以10%的甲醛織樣本，依次用80%、90%、95%及100%的乙醇浸泡2 h,將石蠟溶解充分包埋組織樣本，切片，常規(guī)染色、封片，鏡檢，并區(qū)分組織樣本；②實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)HPV DNA：進(jìn)行HPV16/18病毒的DNA檢測(cè)，試劑盒由公司提供；③提取HPV mRNA：組織樣本置于液氮中研磨，轉(zhuǎn)移至玻璃勻漿器內(nèi)，滴入1 ml的RNAiso Plus進(jìn)行勻漿，再移至1號(hào)1.5 ml的離心管內(nèi)，充分混合均勻后置于-5℃環(huán)境中孵育5 min，高速離心5 min，將上清液移至2號(hào)1.5 ml離心管內(nèi)，加入0.2 ml的氯仿，混合均勻后置于-5℃環(huán)境中孵育5 min，高速離心10 min，取上清液移至3號(hào)1.5 ml離心管內(nèi)，加入0.5 ml的異丙醇，混合均勻，置于-5℃環(huán)境中孵育5 min，高速離心5 min，去除上清液，添加1 ml的75%乙醇，混合均勻，高速離心5 min，去除上清液，常溫放置10 min，添加10 μl 的DEPC處理水使RNA溶解。取2 μl的RNA置于膠體電泳中并拍照，予以紫外分光光度計(jì)(賽業(yè)生物科技有限公司)檢測(cè)OD值，依據(jù)OD值計(jì)算RNA的濃度，調(diào)整RNA濃度為100 ng/μl并置于-70℃保存。④HPV mRNA反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)：A逆轉(zhuǎn)錄：加入1 μg的RNA樣本混合20 μl反應(yīng)體系，加入樣品， 42℃環(huán)境中反應(yīng)60 min，99℃環(huán)境中反應(yīng)5 min后終止反應(yīng)，4℃環(huán)境中冷卻后于-20℃保存。B熒光定量PCR：委托天津普瑞塞而生物科技公司設(shè)計(jì)合成Genebank GDB HPV16/18 的序列引物、熒光探針與標(biāo)準(zhǔn)品，將標(biāo)本低溫離心10 s，置于TC988C-2 熒光PCR 擴(kuò)增儀(重慶美德生物科技有限公司)內(nèi)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)，單個(gè)反應(yīng)的升降溫度設(shè)置為20℃/s，單個(gè)循環(huán)設(shè)置為62℃/s處行熒光檢測(cè)。

1.2.2HR-HPV載量檢測(cè)：要求患者取樣前3 d禁止使用陰道栓塞類藥物，前1 d禁止同房，非經(jīng)期。第二代雜交捕獲技術(shù)檢測(cè)HR-HPV的載量，組織樣本DNA雙鏈釋放并分解為單鏈RNA，RNA與DNA單鏈組合探針形成雜交體，予以特異性抗體捕獲雜交體，并固定于微孔壁內(nèi)，加入含堿性磷酸酶的第二抗體同DNA-RNA雜交體結(jié)合，添加底物顯色，讀取堿性磷酸酶含量，確定DNA-RNA雜交體含量。HR-HPV載量由樣本的相對(duì)光單位與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照之比(RLU/PC)來(lái)衡量，載量1.00為陰性，載量≥1.00為陽(yáng)性。

1.3觀察指標(biāo)分析miR-21的表達(dá)及HR-HPV載量與宮頸癌臨床病理特征的聯(lián)系，miR-21的表達(dá)與HR-HPV載量的相關(guān)性，不同宮頸病變中miR-21的表達(dá)及HR-HPV載量。

2　結(jié)果

2.1分析miR-21的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的聯(lián)系miR-21的表達(dá)與宮頸癌年齡、FIGO分期、腫瘤直徑、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)無(wú)明顯的相關(guān)性(P>0.05)；miR-21的表達(dá)與宮頸癌細(xì)胞分化程度密切相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.2分析HR-HPV載量與宮頸癌臨床病理特征的聯(lián)系HR-HPV載量與宮頸癌年齡、FIGO分期、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；HR-HPV載量與宮頸癌分期、腫瘤直徑密切相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表1　miR-21的表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的聯(lián)系　±s

表2　HR-HPV載量與宮頸癌臨床病理特征的聯(lián)系　±s

2.3分析宮頸癌患者HR-HPV載量與mi-R21表達(dá)的相關(guān)性宮頸癌HR-HPV陽(yáng)性者miR-21表達(dá)水平低于HR-HPV陰性者(P<0.05)，可見(jiàn)HR-HPV載量與mi-R21表達(dá)呈正相關(guān)。見(jiàn)表3。

表3宮頸癌患者HR-HPV載量與mi-R21表達(dá)的相關(guān)性

HR-HPVmi-R21表達(dá)陽(yáng)性(n=28)9.75±0.83陰性(n=12)5.47±0.46 r值0.6151 P值0.0024

2.4分析不同宮頸癌病變中HR-HPV載量與mi-R21的表達(dá)CINⅠ組HR-HPV陽(yáng)性患者分別低于CINⅡ組、CINⅢ組及CC組，CINⅠ組HR-HPV陰性患者分別高于CINⅡ組、CINⅢ組及CC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；CINⅠ組mi-R21表達(dá)水平低于CINⅡ組、CINⅢ組及CC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4　不同宮頸癌病變中HR-HPV載量與mi-R21的表達(dá)

3　討論

宮頸癌是最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤，我國(guó)宮頸癌的發(fā)生率和死亡率占全球1/3，而且臨床發(fā)現(xiàn)子宮頸癌患者具有年輕化的趨勢(shì)[4]。宮頸癌的發(fā)生是1個(gè)多因素、多階段的漸進(jìn)生物學(xué)過(guò)程，及時(shí)有效的診斷與治療是宮頸癌的治療宗旨。研究報(bào)道，癌前病變與宮頸癌的首要致病因素為HPV感染，這是一種常見(jiàn)的下生殖道感染，但并不是所有HPV感染都會(huì)發(fā)展為宮頸癌，通常按照誘發(fā)宮頸癌的風(fēng)險(xiǎn)可以分為高危型與低危型[5]。HR-HPV的長(zhǎng)期或反復(fù)感染是宮頸黏膜細(xì)胞發(fā)生異常增殖和病變的原因之一，大量臨床研究表示宮頸病變嚴(yán)重程度與HR-HPV病毒載量表現(xiàn)為正相關(guān)[6]。但研究者表示鱗狀細(xì)胞癌發(fā)病早期，HPV16的病毒載量極低，因此關(guān)于HPV病毒載量與宮頸癌的聯(lián)系需要進(jìn)一步臨床研究證實(shí)[7]。研究認(rèn)為可以通過(guò)評(píng)估微小RNA的表達(dá)情況預(yù)測(cè)HPV感染的結(jié)果，miRNA的表達(dá)有助于區(qū)分高危型HPV感染后不同的宮頸病變[8]。

miRNA是一種小分子RNA，其主要通過(guò)堿基互補(bǔ)與靶mRNA的3'端非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶mRNA降解或抑制蛋白質(zhì)的合成，從而在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平影響靶基因的表達(dá)。抑癌基因或原癌基因的miRNA種類較多，miRNA 表達(dá)譜所顯示的生物學(xué)信息在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中扮演著重要的角色，能夠準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，可作為腫瘤標(biāo)志物應(yīng)用于臨床[9]。miRNA中與宮頸癌關(guān)系密切，miR-21是一種致癌基因，其在眾多腫瘤細(xì)胞中均有異常表達(dá)，宮頸癌發(fā)生與發(fā)展中miR-21起重要作用[10]。Let-7是一種miRNA，通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控機(jī)制，可以特異性結(jié)合到信使RNA，從而降解靶基因mRNA或抑制其翻譯；STAT3能調(diào)節(jié)多種基因的活性，從而參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和細(xì)胞凋亡；人乳頭狀瘤病毒癌蛋白E6可以調(diào)控Let-7、STAT3及miRNA的表達(dá)[11,12]。研究表示病毒HPV陽(yáng)性細(xì)胞E6/E7癌基因表達(dá)與胞內(nèi)和外來(lái)體穿梭miRNA的表達(dá)是互相促進(jìn)的[13,14]。HPV16的癌基因可以調(diào)控miR-21的表達(dá)，因此miR-21可以作為治療宮頸癌及其癌前病變的分子靶點(diǎn)。

本研究結(jié)果顯示，宮頸癌患者腫瘤細(xì)胞低分化者miR-21表達(dá)低于中分化者及高分化者，腫瘤細(xì)胞直徑≥4 cm者HR-HPV載量高于<4 cm者，宮頸癌HR-HPV陽(yáng)性者miR-21表達(dá)水平低于HR-HPV陰性者，但miR-21表達(dá)及HR-HPV載量與宮頸癌年齡、FIGO分期Ⅰ～ⅡA者HR-HPV載量低于ⅡB～Ⅳ者、病理類型、淋巴轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)無(wú)明顯相關(guān)性；CINⅠ組HR-HPV陰性患者分別高于CINⅡ組、CINⅢ組及CC組，CINⅠ組mi-R21表達(dá)水平低于CINⅡ組、CINⅢ組及CC組，由此可見(jiàn)，miR-21表達(dá)及HR-HPV載量與宮頸癌的危險(xiǎn)性呈正相關(guān)，可作為臨床上常規(guī)篩查宮頸癌的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)手段。綜上所述，了解miR-21與高危HPV載量變化在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展中的作用可以完善宮頸癌的病因?qū)W和分子病理學(xué)理論、發(fā)現(xiàn)新的早期診斷與預(yù)后的生物標(biāo)志物、達(dá)到宮頸癌預(yù)防與治療的目的，具有廣闊的應(yīng)用前景。

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Significance of the expression of small RNA-21 and the changes of high-risk HPV viral load in the pathogenesis and development of cervical cancer

WANGBin.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,LuohuDistrictHospitalforMaternalandChildHealth,Guangdong,Shenzhen518000,China

ObjectiveTo investigate the significance of the expression of small RNA-21 (miR-21) and the changes of high-risk HPV viral load in the pathogenesis and development of cervical cancer.MethodsOne hundred and fifty patients with cervical lesion who were admitted and treated in our hospital from March 2011 to March 2015 were enrolled in the study,and all the patients underwent cervical biopsy.These patients were divided into CINⅠgroup (n=39),CINⅡ group (n=37),CIN Ⅲ group (n=34), CC group (n=40).The expression levels of miR-21 and HR-HPV load in different types of cervical lesions were detected.The correlation between the expressins of miR-21 and HR-HPV load was analyzed,moreover, the correlation between the expressins of miR-21 as well as HR-HPV load and clinicopathological charateristics of cervical cancer was analyzed.ResultsThe expression levels of miR-21 in patients with poorly differentiated tumor cells (6.12±0.83) were significantly higher than those (8.17±0.65) in patients with moderately differentiated tumor cells and those (11.54±1.29) in patients with well differentiated tumor cells (P<0.05). The HR-HPV load (26.53±3.12) in patients with tumor diameter >4cm was significantly higher than that (23.60±2.85) of patients with tumor diameter <4cm (P<0.05).The HR-HPV load (23.86±2.34) in patients at FIGO staging Ⅰ～ⅡA was obviously lower than that (27.59±3.12) in patients at FIGO staging ⅡB～Ⅳ. The expression levels of miR-21 in HR-HPV-positive patients (9.75±0.83) were significantly higher than those (5.47±0.46) in HR-HPV-negative patients (P<0.05). However there were no significant differences in the expression levels of miR-21,HR-HPV load, patient's age, FIGO staging,pathological types, lymphatic metastasis and vessel infiltration (P>0.05).The percentage (41.03%) of HR-HPV-positive patients (41.03%) in CINⅠgroup (41.03%) was significantly lower that that in CINⅡ group (67.57%), CIN Ⅲ group (85.29%), CC group (92.50%), moreover, the relative expression levels of mi-R21 in CINⅠgroup (6.42±0.53) was significantly lower than that in CINⅡ group (7.26±0.61),CIN Ⅲ group (8.24±0.65) and CC group (9.36±0.70) (P<0.05).ConclusionThe expression levels of miR-21 can reflect the differentiation degree of cervical cancer cells,and high-risk HPV viral load can reflect FIGO stages of cervical cancer and diameter range of cancer,moreover,the expression of miR-21 is positively correlated to high risk HPV viral load.The combined detection of miR-21 with high risk viral load can suggest cervical precancerous lesions, the pathogenesis and development of cervical cancer.【Key words】correlation; small RNA-21;high-risk HPV viral load; cervical cancer

10.3969/j.issn.1002-7386.2016.20.004

518000廣東省深圳市羅湖區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科

R 737.33

A

1002-7386(2016)20-3059-04

2016-01-15)

項(xiàng)目來(lái)源：深圳市羅湖區(qū)科技創(chuàng)新局[編號(hào)：羅科(2015)26號(hào)]