中藥復(fù)方對復(fù)合應(yīng)激致慢性疲勞大鼠認知行為的影響*

張　燁，張振賢，黃　瑤

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院科研處，上?！?00062；2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)科，上?！?00437）

·實驗研究·

中藥復(fù)方對復(fù)合應(yīng)激致慢性疲勞大鼠認知行為的影響*

張燁1，2，張振賢2，黃瑤2

（1.上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院科研處，上海200062；2.上海中醫(yī)藥大學附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)科，上海200437）

［目的］觀察多重復(fù)合應(yīng)激致慢性疲勞模型大鼠認知行為的變化，驗證理虛解郁綜合方對其認知的改善作用。［方法］清潔級SD雄性大鼠80只，隨機分組為對照組、模型組以及中藥低、中、高劑量組，每組16只，除對照組外，均以復(fù)合因素造模（慢性束縛、冷水游泳、隨機晝夜顛倒），同時中藥低、中、高劑量組分以2 mL濃度為0.5、1、2 g/mL中藥灌胃30 d，對照組和模型組則給予等體積的生理鹽水。造模結(jié)束后應(yīng)用行為學方法（曠場實驗、懸尾實驗及Morris水迷宮實驗）檢測不同組大鼠之間出現(xiàn)的差異表現(xiàn)。［結(jié)果］與正常組比較，模型組大鼠在水迷宮實驗中目標象限停留時間減少，穿越原平臺的次數(shù)明顯減少，曠場中移動距離和移動時間明顯減少、而在活動箱邊緣區(qū)域活動時間百分比增加，懸尾實驗中靜止時間延長、掙扎次數(shù)減少；中藥三組與模型組比較，在水迷宮實驗中，高劑量組在目標象限內(nèi)停留的時間有顯著增加，各劑量組穿越原平臺的次數(shù)均明顯增加；曠場實驗中，中、大劑量組移動時間增加，大劑量組移動距離增加，中劑量組邊緣區(qū)域活動時間百分比減少；懸尾實驗中，中、大劑量組掙扎次數(shù)均增加，中劑量組靜止時間縮短。［結(jié)論］理虛解郁綜合方能夠明顯改善慢性疲勞模型大鼠的認知行為學表現(xiàn)。

中藥；動物實驗；行為學

慢性疲勞綜合征（CFS）是一種以長期極度疲勞為主要癥狀，同時伴有失眠健忘，肌肉關(guān)節(jié)疼痛、精神異常的病癥［1-2］。伴隨現(xiàn)代社會生活節(jié)奏的加快和生活壓力的增大，CFS的臨床發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢［3-4］，然其致病機理復(fù)雜，與多因素相關(guān)，目前尚缺乏有效治療手段［5］。中藥復(fù)方“理虛解郁方”長期應(yīng)用于臨床，取得了良好的療效［6-8］。文章應(yīng)用行為學評價方法，分析“理虛解郁方”對多重復(fù)合應(yīng)激誘導的慢性疲勞模型大鼠認知行為學的改善作用，為臨床用藥提供進一步的參考。

1　材料

1．1動物及分組清潔級雄性SD大鼠80只（體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克實驗動物有限公司提供），按隨機數(shù)字表法分為5組，分別為：正常對照組、模型組、理虛解郁方（大劑量）、理虛解郁方（中劑量）、理虛解郁方（小劑量），每組16只。

1.2藥物及試劑中藥：理虛解郁方（由黃芪、黨參、仙靈脾、石菖蒲、郁金、景天三七、丹參組成，專利申請?zhí)枺?01210197606.x），每1 mL按低、中、高劑量分別相當于生藥0.5、1、2 g，藥物委托上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院藥劑科制備。

1.3主要儀器自制硬塑料束縛筒（直徑6 cm，長度40 cm）；大鼠游泳池（75 cm×120 cm×80 cm）；硬質(zhì)黑色啞光自制敞箱（80 cm×80 cm×40 cm），Truscan視頻追蹤分析系統(tǒng)，懸尾測試儀。

2　方法

2.1造模方法本研究采用復(fù)合應(yīng)激建立CFS大鼠模型，采用冷水游泳、慢性束縛及隨機晝夜顛倒方法造模，造模時間為30 d。

強制冷水游泳［6，9］：將大鼠每日于隨機時間點放入冷水（水溫維持在12℃左右）中游泳，每次5～10 min（視大鼠個體游泳能力而定）。

每日慢性束縛［9，13］：用自制束縛筒，將大鼠頭向通氣口置入后關(guān)閉閘門，調(diào)節(jié)到不產(chǎn)生強烈反抗的緊張程度，每日于隨機時間點進行束縛，束縛時長為2～4 h不等。

隨機晝夜顛倒［6］：夜間18：00至次日凌晨6：00給予持續(xù)日光燈照射，日間放置于黑暗封閉的環(huán)境中，共3次，具體時間隨機確定。

2.2給藥劑量及方法［6］造模前1 min給大鼠灌胃，正常組、模型組予生理鹽水2 mL，中藥各組予對應(yīng)劑量中藥2 mL，每日1次，共30 d。

2.3觀察指標及方法

2.3.1實驗期間，每天觀察并記錄大鼠的進食量、體重、糞便、皮毛色澤及瞇眼等情況［6］。

2.3.2行為學指標行為學檢測于造模結(jié)束后第2天開始進行，首先需將所有要檢測的大鼠籠盒放進做行為學測試的房間進行適應(yīng)性飼養(yǎng)，并由試驗人員每日對大鼠進行安撫（handle）以使其適應(yīng)實驗人員的操作和氣味，減小對實驗的干擾。3 d后進行正式實驗。

1）Morris水迷宮［16］：實驗在大鼠泳池中進行，水深25 cm，水溫（22±2）℃，水中加入白色染料以使水不透明。整個泳池劃分為4個象限，目標象限內(nèi)有可移動的直徑12 cm、高23 cm的透明平臺，池壁內(nèi)側(cè)貼有不同形狀的標記物。實驗第一階段為訓練，將大鼠隨機放入水中，讓其自由游動，如1 min內(nèi)找到并爬上平臺，等待15 s將其取下；如沒有找到則人為引導大鼠至平臺并停留15 s后取下。此過程每日重復(fù)4次，持續(xù)3 d。第二階段為檢測階段，即第4天先撤去平臺，按之前訓練順序，將大鼠放入平臺所在象限的對側(cè)象限，由Truscan視頻追蹤分析系統(tǒng)記錄其1 min之內(nèi)在原平臺所在象限內(nèi)停留的時間和穿越原平臺的次數(shù)。作為衡量其空間記憶的指標。

2）曠場實驗［12］：將大鼠面向角落放入活動箱中，由Truscan系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)的移動時間和移動距離，并分析活動軌跡和區(qū)域分布；每只大鼠測試結(jié)束后需清理活動箱內(nèi)排泄物，并用10%乙醇擦拭以去除氣味。

3）懸尾實驗［10-11］：用醫(yī)用膠布纏繞大鼠尾端靠近中部位置，然后懸掛于裝置頂端的張力感受器，設(shè)定合適的閾值，記錄6 min中大鼠的掙扎情況，取后5 min的大鼠靜止不動的時間作為有效數(shù)據(jù)。

2.4統(tǒng)計學方法采用SIGMAPLOT軟件進行統(tǒng)計分析，組間比較采用Student t檢驗進行檢驗，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著差異，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差（±s）表示。

3　結(jié)果

造模結(jié)束后，與正常組相比，可以觀察到模型組的大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、食量下降、被毛脫落，活動性下降，對外界刺激反應(yīng)減弱，大便不成形。一系列“疲勞”樣表現(xiàn)初步說明造模成功。

3.1Morris水迷宮實驗見表1。水迷宮用于檢測大鼠的空間記憶及學習能力。結(jié)果提示模型組相較正常組在目標象限中停留的時間有顯著的縮短，穿越原平臺的次數(shù)明顯減少；與模型組比較，大劑量中藥組停留時間較模型組有所增加，各劑量組穿越原平臺次數(shù)均增加，尤以大劑量組明顯，說明各劑量組理虛解郁方能夠緩解慢性疲勞模型大鼠的空間記憶能力的減退，以高劑量組緩解明顯。

表1　各組水迷宮目標象限停留時間比較（±s）Tab.1　Comparison of the residence time of target quadrant in morris water maze in each group（±s）

表1　各組水迷宮目標象限停留時間比較（±s）Tab.1　Comparison of the residence time of target quadrant in morris water maze in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組對照，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　例數(shù)　目標象限停留時間（s）　穿越平臺次數(shù)（次）正常組　16　22.1±4.6　6.51±1.02模型組　16　16.8±2.4*　3.42±1.12*小劑量組　16　16.5±4.2　4.23±1.03#中劑量組　16　15.7±4.4　5.82±1.19#大劑量組　16　18.4±3.9#　6.01±1.12##

3.2曠場實驗見表2。曠場實驗反映了動物的基礎(chǔ)活動量，并能夠在一定程度上判斷動物的焦慮樣情緒。數(shù)據(jù)表明，模型組相對正常組出現(xiàn)明顯的移動距離和移動時間的減少，同時在活動區(qū)域上更傾向于在活動箱的邊緣區(qū)域，說明其焦慮的程度有所增加。而中藥組的活動量明顯上升，中、大劑量組移動時間增加，大劑量組移動距離增加，并且中劑量組在活動區(qū)域上也更傾向于在活動箱的中間區(qū)域，說明適當劑量的理虛解郁方除了增加模型大鼠活動性之外，對于焦慮情緒的緩解也能起到一定作用。

表2　各組曠場實驗活動時間、距離與區(qū)域的比較（±s）Tab.2　Comparison of open field test time，distance and area in each group（±s）

表2　各組曠場實驗活動時間、距離與區(qū)域的比較（±s）Tab.2　Comparison of open field test time，distance and area in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組對照，#P＜0.05。

組別　例數(shù)　移動時間（s） 移動距離（cm） 邊緣區(qū)域時間（%）正常組　16　232±29　2191±264　87.6±5.2模型組　16　169±22**　1753±388**　96.2±3.3*小劑量組　16　178±19　1664±180　97.4±4.6中劑量組　16　188±25#　1903±261　90.5±2.8#大劑量組　16　206±31#　1984±225#　93.6±6.9

3.3懸尾實驗見表3。懸尾實驗是經(jīng)典的評價動物抑郁狀態(tài)的實驗方法之一，利用實驗過程中記錄動物不動時間和掙扎次數(shù)來反映其抑郁狀態(tài)。實驗結(jié)果表明，模型組大鼠相較正常組靜止不動時間有所增加，掙扎次數(shù)減少；中藥治療后，中劑量組較模型組變化明顯，表現(xiàn)為靜止時間減少、掙扎次數(shù)增加，而大劑量組則掙扎次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計學意義，說明適當劑量的理虛解郁方能夠緩解大鼠的抑郁樣情緒。

表3　各組大鼠懸尾中靜止時間及掙扎次數(shù)比較（±s）Tab.3　Comparison of resting time and struggling frequency of rat tail suspension test in each group（±s）

表3　各組大鼠懸尾中靜止時間及掙扎次數(shù)比較（±s）Tab.3　Comparison of resting time and struggling frequency of rat tail suspension test in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組對照，#P＜0.05。

組別　例數(shù)　靜止時間（s）　掙扎次數(shù)（次）正常組　16　182.06±21.24　57.24±19.18模型組　16　223.67±13.21*　48.87±21.28*小劑量組　16　197.58±29.61　45.65±23.17中劑量組　16　184.98±32.65#　61.82±17.56#大劑量組　16　209.65±19.26　60.16±22.09#

4　討論

以往的研究認為，慢性疲勞綜合征是由多種因素刺激引起的持續(xù)性軀體和精神的雙重疲勞，多有負性生活事件等慢性應(yīng)激源導致。因此，對于模型的建立，也選擇多重復(fù)合應(yīng)激方法來模擬人體的多重生理、精神應(yīng)激狀態(tài)［13］。慢性束縛通過限制大鼠軀體活動，使其產(chǎn)生反抗、焦躁等行為上的變化；強制冷水游泳包含了體力上的消耗、溫度的刺激和強迫心理刺激；隨機晝夜顛倒干擾了大鼠正常的晝夜節(jié)律，造成體力和精神的雙重應(yīng)激。持續(xù)性的多重應(yīng)激使大鼠同時產(chǎn)生軀體和精神上的疲勞，其變化程度及中藥治療的有效性可以通過相應(yīng)的行為學指標來評定。

CFS在臨床上以身體疲勞為首發(fā)癥狀，逐漸出現(xiàn)心理、認知功能的改變［14-15］，因此在本研究中，選擇了Morris水迷宮實驗、曠場實驗、鼠尾懸掛實驗來評價大鼠認知功能的變化［16］。實驗利用Morris水迷宮試驗檢測大鼠記憶力及學習能力的變化［17］。記憶能力下降是慢性疲勞綜合征的典型癥狀之一，檢測結(jié)果表明，模型組大鼠在目標象限探索的時間明顯縮短，穿越原平臺次數(shù)減少，表明其空間記憶能力的下降，通過中藥干預(yù)，可使大鼠空間記憶能力下降表現(xiàn)有所改善。曠場實驗觀察在開放環(huán)境中的自主活動和緊張情緒，曠場中模型組大鼠運動時間和運動距離相較正常組都有明顯的下降，且在邊緣區(qū)域的活動時間百分比有所增加，反應(yīng)了更高程度的情緒緊張。中藥能改善大鼠的精神狀態(tài)，緩解焦慮抑郁等負性情緒，尤以中、大劑量組明顯；實驗通過懸尾試驗評價大鼠抑郁樣情緒及身體疲勞狀態(tài)，數(shù)據(jù)提示模型組大鼠靜止時間明顯延長、掙扎次數(shù)減少，呈現(xiàn)軀體疲勞及精神抑郁狀態(tài)，中藥中、大劑量能明顯緩解大鼠的體力及精神疲勞。

以上結(jié)果提示，中藥理虛解郁方在適當劑量下，能夠?qū)?fù)合應(yīng)激建立的慢性疲勞大鼠模型認知行為有較明顯的療效，表明其對于大鼠的精神疲勞有較為顯著的緩解作用。對于慢性疲勞綜合征病因的認識，中醫(yī)一般認為與先天稟賦不足或勞累過度，情致失調(diào)、飲食不節(jié)等所致脾虛肝郁［18］、氣血失調(diào)有關(guān)［19-20］。中藥復(fù)方理虛解郁方兼具補氣養(yǎng)血、健脾益氣，疏肝解郁透達之療效，臨床上能同時緩解患者的軀體疲勞，同時對于精神癥狀如抑郁、焦慮等也有不同程度的減輕［7-8］，與本動物實驗結(jié)論基本一致。另外實驗結(jié)果表明，理虛解郁方的臨床療效雖并未隨著劑量的增加而呈現(xiàn)遞增趨勢，但卻能在一定程度上同時緩解軀體及精神疲勞癥狀，故臨床中值得進一步推廣運用，其作用機制也值得進一步探討。

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（本文編輯：馬英，張震之）

Intervention effects of Chinese herbal compounds on the behavior of chronic fatigue rats induced by combined stress

ZHANG Ye1，2，ZHANG Zhen-xian2，HUANG Yao2
（1.Scientific Research office，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China；2.Medical Department，Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medcine，Shanghai 200437，China）

［Objective］To observe the changes of behavior of chronic fatigue rats induced by combined stress，and to verify the effect of Lixu Jiyu recipe on the improvement of behavior.［Methods］The 80 SD male rats were randomly divided into 5 groups：control group，model group，low dose treated group，middle dose treated group，and high dose treated group，16 rats in each group.The CFS rats models were made with multiple stimuli including chronic restraint，Swimming in cold water and day and night reversed by randomly except control group.The rats in the control group and model group were given normal saline of 2 mL，and the treated groups were given concentration of 0.5，1，2 g/mL of Lixu Jieyu recipe for 30 days.To observe the rats’behavioristic changes in open-field test，tail hanging test，exhausting swimming test and morris water maze test among different groups.［Results］Compared with the control group，the model group manifested a series of abnormal variations in open-field test，tail hanging test.Compared with the model group，Lixu Jieyu recipe could improve moving time and distance in open-field test，reducing the percentage of active time of the marginal zone；increasing the times of struggle，shortening the time of rest in tail hanging test；prolonging the time of the rats in the target quadrant in Morris water maze test.［Conclusion］Lixu Jieyu recipe can significantly improve the behavior of rats with chronic fatigue.

traditional Chinese Medicine；animal experiment；behavioristics

R259

A

1672-1519（2016）09-0545-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.09.10

2016-05-20）

國家自然科學基金青年項目（81303099）；上海市杏林新星計劃（ZY3-RCPY-2-2015）。

張燁（1982-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)亞健康、中醫(yī)心血管方面的研究。