中藥復(fù)方對(duì)復(fù)合應(yīng)激致慢性疲勞大鼠認(rèn)知行為的影響*

張　燁，張振賢，黃　瑤

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院科研處，上海　200062；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)科，上?！?00437）

·實(shí)驗(yàn)研究·

中藥復(fù)方對(duì)復(fù)合應(yīng)激致慢性疲勞大鼠認(rèn)知行為的影響*

張燁1，2，張振賢2，黃瑤2

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院科研處，上海200062；2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽(yáng)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院內(nèi)科，上海200437）

［目的］觀察多重復(fù)合應(yīng)激致慢性疲勞模型大鼠認(rèn)知行為的變化，驗(yàn)證理虛解郁綜合方對(duì)其認(rèn)知的改善作用。［方法］清潔級(jí)SD雄性大鼠80只，隨機(jī)分組為對(duì)照組、模型組以及中藥低、中、高劑量組，每組16只，除對(duì)照組外，均以復(fù)合因素造模（慢性束縛、冷水游泳、隨機(jī)晝夜顛倒），同時(shí)中藥低、中、高劑量組分以2 mL濃度為0.5、1、2 g/mL中藥灌胃30 d，對(duì)照組和模型組則給予等體積的生理鹽水。造模結(jié)束后應(yīng)用行為學(xué)方法（曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、懸尾實(shí)驗(yàn)及Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)）檢測(cè)不同組大鼠之間出現(xiàn)的差異表現(xiàn)。［結(jié)果］與正常組比較，模型組大鼠在水迷宮實(shí)驗(yàn)中目標(biāo)象限停留時(shí)間減少，穿越原平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，曠場(chǎng)中移動(dòng)距離和移動(dòng)時(shí)間明顯減少、而在活動(dòng)箱邊緣區(qū)域活動(dòng)時(shí)間百分比增加，懸尾實(shí)驗(yàn)中靜止時(shí)間延長(zhǎng)、掙扎次數(shù)減少；中藥三組與模型組比較，在水迷宮實(shí)驗(yàn)中，高劑量組在目標(biāo)象限內(nèi)停留的時(shí)間有顯著增加，各劑量組穿越原平臺(tái)的次數(shù)均明顯增加；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)中，中、大劑量組移動(dòng)時(shí)間增加，大劑量組移動(dòng)距離增加，中劑量組邊緣區(qū)域活動(dòng)時(shí)間百分比減少；懸尾實(shí)驗(yàn)中，中、大劑量組掙扎次數(shù)均增加，中劑量組靜止時(shí)間縮短。［結(jié)論］理虛解郁綜合方能夠明顯改善慢性疲勞模型大鼠的認(rèn)知行為學(xué)表現(xiàn)。

中藥；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；行為學(xué)

慢性疲勞綜合征（CFS）是一種以長(zhǎng)期極度疲勞為主要癥狀，同時(shí)伴有失眠健忘，肌肉關(guān)節(jié)疼痛、精神異常的病癥［1-2］。伴隨現(xiàn)代社會(huì)生活節(jié)奏的加快和生活壓力的增大，CFS的臨床發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升的趨勢(shì)［3-4］，然其致病機(jī)理復(fù)雜，與多因素相關(guān)，目前尚缺乏有效治療手段［5］。中藥復(fù)方“理虛解郁方”長(zhǎng)期應(yīng)用于臨床，取得了良好的療效［6-8］。文章應(yīng)用行為學(xué)評(píng)價(jià)方法，分析“理虛解郁方”對(duì)多重復(fù)合應(yīng)激誘導(dǎo)的慢性疲勞模型大鼠認(rèn)知行為學(xué)的改善作用，為臨床用藥提供進(jìn)一步的參考。

1　材料

1．1動(dòng)物及分組清潔級(jí)雄性SD大鼠80只（體質(zhì)量200～250 g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供），按隨機(jī)數(shù)字表法分為5組，分別為：正常對(duì)照組、模型組、理虛解郁方（大劑量）、理虛解郁方（中劑量）、理虛解郁方（小劑量），每組16只。

1.2藥物及試劑中藥：理虛解郁方（由黃芪、黨參、仙靈脾、石菖蒲、郁金、景天三七、丹參組成，專利申請(qǐng)?zhí)枺?01210197606.x），每1 mL按低、中、高劑量分別相當(dāng)于生藥0.5、1、2 g，藥物委托上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬普陀醫(yī)院藥劑科制備。

1.3主要儀器自制硬塑料束縛筒（直徑6 cm，長(zhǎng)度40 cm）；大鼠游泳池（75 cm×120 cm×80 cm）；硬質(zhì)黑色啞光自制敞箱（80 cm×80 cm×40 cm），Truscan視頻追蹤分析系統(tǒng)，懸尾測(cè)試儀。

2　方法

2.1造模方法本研究采用復(fù)合應(yīng)激建立CFS大鼠模型，采用冷水游泳、慢性束縛及隨機(jī)晝夜顛倒方法造模，造模時(shí)間為30 d。

強(qiáng)制冷水游泳［6，9］：將大鼠每日于隨機(jī)時(shí)間點(diǎn)放入冷水（水溫維持在12℃左右）中游泳，每次5～10 min（視大鼠個(gè)體游泳能力而定）。

每日慢性束縛［9，13］：用自制束縛筒，將大鼠頭向通氣口置入后關(guān)閉閘門(mén)，調(diào)節(jié)到不產(chǎn)生強(qiáng)烈反抗的緊張程度，每日于隨機(jī)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行束縛，束縛時(shí)長(zhǎng)為2～4 h不等。

隨機(jī)晝夜顛倒［6］：夜間18：00至次日凌晨6：00給予持續(xù)日光燈照射，日間放置于黑暗封閉的環(huán)境中，共3次，具體時(shí)間隨機(jī)確定。

2.2給藥劑量及方法［6］造模前1 min給大鼠灌胃，正常組、模型組予生理鹽水2 mL，中藥各組予對(duì)應(yīng)劑量中藥2 mL，每日1次，共30 d。

2.3觀察指標(biāo)及方法

2.3.1實(shí)驗(yàn)期間，每天觀察并記錄大鼠的進(jìn)食量、體重、糞便、皮毛色澤及瞇眼等情況［6］。

2.3.2行為學(xué)指標(biāo)行為學(xué)檢測(cè)于造模結(jié)束后第2天開(kāi)始進(jìn)行，首先需將所有要檢測(cè)的大鼠籠盒放進(jìn)做行為學(xué)測(cè)試的房間進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)，并由試驗(yàn)人員每日對(duì)大鼠進(jìn)行安撫（handle）以使其適應(yīng)實(shí)驗(yàn)人員的操作和氣味，減小對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾。3 d后進(jìn)行正式實(shí)驗(yàn)。

1）Morris水迷宮［16］：實(shí)驗(yàn)在大鼠泳池中進(jìn)行，水深25 cm，水溫（22±2）℃，水中加入白色染料以使水不透明。整個(gè)泳池劃分為4個(gè)象限，目標(biāo)象限內(nèi)有可移動(dòng)的直徑12 cm、高23 cm的透明平臺(tái)，池壁內(nèi)側(cè)貼有不同形狀的標(biāo)記物。實(shí)驗(yàn)第一階段為訓(xùn)練，將大鼠隨機(jī)放入水中，讓其自由游動(dòng)，如1 min內(nèi)找到并爬上平臺(tái)，等待15 s將其取下；如沒(méi)有找到則人為引導(dǎo)大鼠至平臺(tái)并停留15 s后取下。此過(guò)程每日重復(fù)4次，持續(xù)3 d。第二階段為檢測(cè)階段，即第4天先撤去平臺(tái)，按之前訓(xùn)練順序，將大鼠放入平臺(tái)所在象限的對(duì)側(cè)象限，由Truscan視頻追蹤分析系統(tǒng)記錄其1 min之內(nèi)在原平臺(tái)所在象限內(nèi)停留的時(shí)間和穿越原平臺(tái)的次數(shù)。作為衡量其空間記憶的指標(biāo)。

2）曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)［12］：將大鼠面向角落放入活動(dòng)箱中，由Truscan系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)的移動(dòng)時(shí)間和移動(dòng)距離，并分析活動(dòng)軌跡和區(qū)域分布；每只大鼠測(cè)試結(jié)束后需清理活動(dòng)箱內(nèi)排泄物，并用10%乙醇擦拭以去除氣味。

3）懸尾實(shí)驗(yàn)［10-11］：用醫(yī)用膠布纏繞大鼠尾端靠近中部位置，然后懸掛于裝置頂端的張力感受器，設(shè)定合適的閾值，記錄6 min中大鼠的掙扎情況，取后5 min的大鼠靜止不動(dòng)的時(shí)間作為有效數(shù)據(jù)。

2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SIGMAPLOT軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用Student t檢驗(yàn)進(jìn)行檢驗(yàn)，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為非常顯著差異，數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。

3　結(jié)果

造模結(jié)束后，與正常組相比，可以觀察到模型組的大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降、食量下降、被毛脫落，活動(dòng)性下降，對(duì)外界刺激反應(yīng)減弱，大便不成形。一系列“疲勞”樣表現(xiàn)初步說(shuō)明造模成功。

3.1Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表1。水迷宮用于檢測(cè)大鼠的空間記憶及學(xué)習(xí)能力。結(jié)果提示模型組相較正常組在目標(biāo)象限中停留的時(shí)間有顯著的縮短，穿越原平臺(tái)的次數(shù)明顯減少；與模型組比較，大劑量中藥組停留時(shí)間較模型組有所增加，各劑量組穿越原平臺(tái)次數(shù)均增加，尤以大劑量組明顯，說(shuō)明各劑量組理虛解郁方能夠緩解慢性疲勞模型大鼠的空間記憶能力的減退，以高劑量組緩解明顯。

表1　各組水迷宮目標(biāo)象限停留時(shí)間比較（±s）Tab.1　Comparison of the residence time of target quadrant in morris water maze in each group（±s）

表1　各組水迷宮目標(biāo)象限停留時(shí)間比較（±s）Tab.1　Comparison of the residence time of target quadrant in morris water maze in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組對(duì)照，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別　例數(shù)　目標(biāo)象限停留時(shí)間（s）　穿越平臺(tái)次數(shù)（次）正常組　16　22.1±4.6　6.51±1.02模型組　16　16.8±2.4*　3.42±1.12*小劑量組　16　16.5±4.2　4.23±1.03#中劑量組　16　15.7±4.4　5.82±1.19#大劑量組　16　18.4±3.9#　6.01±1.12##

3.2曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表2。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)反映了動(dòng)物的基礎(chǔ)活動(dòng)量，并能夠在一定程度上判斷動(dòng)物的焦慮樣情緒。數(shù)據(jù)表明，模型組相對(duì)正常組出現(xiàn)明顯的移動(dòng)距離和移動(dòng)時(shí)間的減少，同時(shí)在活動(dòng)區(qū)域上更傾向于在活動(dòng)箱的邊緣區(qū)域，說(shuō)明其焦慮的程度有所增加。而中藥組的活動(dòng)量明顯上升，中、大劑量組移動(dòng)時(shí)間增加，大劑量組移動(dòng)距離增加，并且中劑量組在活動(dòng)區(qū)域上也更傾向于在活動(dòng)箱的中間區(qū)域，說(shuō)明適當(dāng)劑量的理虛解郁方除了增加模型大鼠活動(dòng)性之外，對(duì)于焦慮情緒的緩解也能起到一定作用。

表2　各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)時(shí)間、距離與區(qū)域的比較（±s）Tab.2　Comparison of open field test time，distance and area in each group（±s）

表2　各組曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)活動(dòng)時(shí)間、距離與區(qū)域的比較（±s）Tab.2　Comparison of open field test time，distance and area in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組對(duì)照，#P＜0.05。

組別　例數(shù)　移動(dòng)時(shí)間（s） 移動(dòng)距離（cm） 邊緣區(qū)域時(shí)間（%）正常組　16　232±29　2191±264　87.6±5.2模型組　16　169±22**　1753±388**　96.2±3.3*小劑量組　16　178±19　1664±180　97.4±4.6中劑量組　16　188±25#　1903±261　90.5±2.8#大劑量組　16　206±31#　1984±225#　93.6±6.9

3.3懸尾實(shí)驗(yàn)見(jiàn)表3。懸尾實(shí)驗(yàn)是經(jīng)典的評(píng)價(jià)動(dòng)物抑郁狀態(tài)的實(shí)驗(yàn)方法之一，利用實(shí)驗(yàn)過(guò)程中記錄動(dòng)物不動(dòng)時(shí)間和掙扎次數(shù)來(lái)反映其抑郁狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，模型組大鼠相較正常組靜止不動(dòng)時(shí)間有所增加，掙扎次數(shù)減少；中藥治療后，中劑量組較模型組變化明顯，表現(xiàn)為靜止時(shí)間減少、掙扎次數(shù)增加，而大劑量組則掙扎次數(shù)增加，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明適當(dāng)劑量的理虛解郁方能夠緩解大鼠的抑郁樣情緒。

表3　各組大鼠懸尾中靜止時(shí)間及掙扎次數(shù)比較（±s）Tab.3　Comparison of resting time and struggling frequency of rat tail suspension test in each group（±s）

表3　各組大鼠懸尾中靜止時(shí)間及掙扎次數(shù)比較（±s）Tab.3　Comparison of resting time and struggling frequency of rat tail suspension test in each group（±s）

注：與正常組比較，*P＜0.05；與模型組對(duì)照，#P＜0.05。

組別　例數(shù)　靜止時(shí)間（s）　掙扎次數(shù)（次）正常組　16　182.06±21.24　57.24±19.18模型組　16　223.67±13.21*　48.87±21.28*小劑量組　16　197.58±29.61　45.65±23.17中劑量組　16　184.98±32.65#　61.82±17.56#大劑量組　16　209.65±19.26　60.16±22.09#

4　討論

以往的研究認(rèn)為，慢性疲勞綜合征是由多種因素刺激引起的持續(xù)性軀體和精神的雙重疲勞，多有負(fù)性生活事件等慢性應(yīng)激源導(dǎo)致。因此，對(duì)于模型的建立，也選擇多重復(fù)合應(yīng)激方法來(lái)模擬人體的多重生理、精神應(yīng)激狀態(tài)［13］。慢性束縛通過(guò)限制大鼠軀體活動(dòng)，使其產(chǎn)生反抗、焦躁等行為上的變化；強(qiáng)制冷水游泳包含了體力上的消耗、溫度的刺激和強(qiáng)迫心理刺激；隨機(jī)晝夜顛倒干擾了大鼠正常的晝夜節(jié)律，造成體力和精神的雙重應(yīng)激。持續(xù)性的多重應(yīng)激使大鼠同時(shí)產(chǎn)生軀體和精神上的疲勞，其變化程度及中藥治療的有效性可以通過(guò)相應(yīng)的行為學(xué)指標(biāo)來(lái)評(píng)定。

CFS在臨床上以身體疲勞為首發(fā)癥狀，逐漸出現(xiàn)心理、認(rèn)知功能的改變［14-15］，因此在本研究中，選擇了Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)、曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)、鼠尾懸掛實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)大鼠認(rèn)知功能的變化［16］。實(shí)驗(yàn)利用Morris水迷宮試驗(yàn)檢測(cè)大鼠記憶力及學(xué)習(xí)能力的變化［17］。記憶能力下降是慢性疲勞綜合征的典型癥狀之一，檢測(cè)結(jié)果表明，模型組大鼠在目標(biāo)象限探索的時(shí)間明顯縮短，穿越原平臺(tái)次數(shù)減少，表明其空間記憶能力的下降，通過(guò)中藥干預(yù)，可使大鼠空間記憶能力下降表現(xiàn)有所改善。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)觀察在開(kāi)放環(huán)境中的自主活動(dòng)和緊張情緒，曠場(chǎng)中模型組大鼠運(yùn)動(dòng)時(shí)間和運(yùn)動(dòng)距離相較正常組都有明顯的下降，且在邊緣區(qū)域的活動(dòng)時(shí)間百分比有所增加，反應(yīng)了更高程度的情緒緊張。中藥能改善大鼠的精神狀態(tài)，緩解焦慮抑郁等負(fù)性情緒，尤以中、大劑量組明顯；實(shí)驗(yàn)通過(guò)懸尾試驗(yàn)評(píng)價(jià)大鼠抑郁樣情緒及身體疲勞狀態(tài)，數(shù)據(jù)提示模型組大鼠靜止時(shí)間明顯延長(zhǎng)、掙扎次數(shù)減少，呈現(xiàn)軀體疲勞及精神抑郁狀態(tài)，中藥中、大劑量能明顯緩解大鼠的體力及精神疲勞。

以上結(jié)果提示，中藥理虛解郁方在適當(dāng)劑量下，能夠?qū)?fù)合應(yīng)激建立的慢性疲勞大鼠模型認(rèn)知行為有較明顯的療效，表明其對(duì)于大鼠的精神疲勞有較為顯著的緩解作用。對(duì)于慢性疲勞綜合征病因的認(rèn)識(shí)，中醫(yī)一般認(rèn)為與先天稟賦不足或勞累過(guò)度，情致失調(diào)、飲食不節(jié)等所致脾虛肝郁［18］、氣血失調(diào)有關(guān)［19-20］。中藥復(fù)方理虛解郁方兼具補(bǔ)氣養(yǎng)血、健脾益氣，疏肝解郁透達(dá)之療效，臨床上能同時(shí)緩解患者的軀體疲勞，同時(shí)對(duì)于精神癥狀如抑郁、焦慮等也有不同程度的減輕［7-8］，與本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)論基本一致。另外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，理虛解郁方的臨床療效雖并未隨著劑量的增加而呈現(xiàn)遞增趨勢(shì)，但卻能在一定程度上同時(shí)緩解軀體及精神疲勞癥狀，故臨床中值得進(jìn)一步推廣運(yùn)用，其作用機(jī)制也值得進(jìn)一步探討。

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［20］成詞松，諸毅暉，袁權(quán)，等.電針改善慢性疲勞大鼠疲勞狀態(tài)及痛閾的下丘腦CRH機(jī)制研究［J］.成都中醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35 （3）:9-18.

（本文編輯：馬英，張震之）

Intervention effects of Chinese herbal compounds on the behavior of chronic fatigue rats induced by combined stress

ZHANG Ye1，2，ZHANG Zhen-xian2，HUANG Yao2
（1.Scientific Research office，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China；2.Medical Department，Yueyang Hospital of Integrated Traditional Chinese and Western Medicine，Shanghai University of Traditional Chinese Medcine，Shanghai 200437，China）

［Objective］To observe the changes of behavior of chronic fatigue rats induced by combined stress，and to verify the effect of Lixu Jiyu recipe on the improvement of behavior.［Methods］The 80 SD male rats were randomly divided into 5 groups：control group，model group，low dose treated group，middle dose treated group，and high dose treated group，16 rats in each group.The CFS rats models were made with multiple stimuli including chronic restraint，Swimming in cold water and day and night reversed by randomly except control group.The rats in the control group and model group were given normal saline of 2 mL，and the treated groups were given concentration of 0.5，1，2 g/mL of Lixu Jieyu recipe for 30 days.To observe the rats’behavioristic changes in open-field test，tail hanging test，exhausting swimming test and morris water maze test among different groups.［Results］Compared with the control group，the model group manifested a series of abnormal variations in open-field test，tail hanging test.Compared with the model group，Lixu Jieyu recipe could improve moving time and distance in open-field test，reducing the percentage of active time of the marginal zone；increasing the times of struggle，shortening the time of rest in tail hanging test；prolonging the time of the rats in the target quadrant in Morris water maze test.［Conclusion］Lixu Jieyu recipe can significantly improve the behavior of rats with chronic fatigue.

traditional Chinese Medicine；animal experiment；behavioristics

R259

A

1672-1519（2016）09-0545-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2016.09.10

2016-05-20）

國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（81303099）；上海市杏林新星計(jì)劃（ZY3-RCPY-2-2015）。

張燁（1982-），女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事中醫(yī)亞健康、中醫(yī)心血管方面的研究。